GPR97、HuR和Sema3A蛋白在細粒棘球蚴感染小鼠肝臟中的表達

王勃， 陳瑞花， 王昆， 李志強， 魏琴， 姜濤, 張春**

(1.新疆醫科大學 動物實驗中心， 新疆 烏魯木齊 830011； 2.新疆醫科大學 新疆醫學動物模型研究重點實驗室， 新疆 烏魯木齊 830011)

細粒棘球蚴病是一種因感染細粒棘球蚴絳蟲蟲卵所致的慢性人獸共患寄生性傳染病，可對人的肝臟、肺以及其他器官造成嚴重傷害[1]。細粒棘球蚴蟲隨血液循環遷移至中間宿主的肝、肺和其他臟器中，出現原發囊性病變，其中在肝臟中最為常見[2]。細粒棘球蚴蟲早期定植引起機體急性炎癥反應而被清除，殘留的幼蟲待包囊形成，產生代謝產物[3]，影響免疫細胞和細胞趨化因子功能，可逃避宿主的免疫反應[4]。G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)是最大的受體超家族，位于細胞膜表面，參與介導生物過程與多種疾病[5]。G蛋白偶聯受體97(G protien-coupled recepter 97，GPR97)具有經典的黏附GPCR結構，具有7個跨膜螺旋、1個N端片段和1個C端片段，通過與下游G蛋白相互作用，介導細胞內信號轉導[6-7]。在免疫細胞中，GPR97在白細胞中表達，如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞[8]，GPR97有可能與炎癥相關，但GPR97對免疫細胞的調節作用及機制仍然不清楚。GPR97基因敲除的腎臟保護作用是通過腦信號蛋白3A(semaphorin 3A，Sema3A)信號通路進行的，同時在體外基因沉默GPR97可減輕低氧細胞模型引起的腎小管上皮的凋亡和促炎因子的產生，加入Sema3A重組蛋白可逆轉這一作用，而GPR97對Sema3A的表達調控是通過人抗原R(human antigen R，HuR)蛋白進行的。HuR蛋白在肝臟多種疾病中均扮演著重要的角色[9]，如在肝炎中，HuR可以促進炎癥介質表達[10]、還可調控巨噬細胞的活性[11]。目前，關于GPR97、Sema3A和HuR蛋白在細粒棘球蚴感染小鼠肝臟中的表達情況還未見報道。因此，本研究通過建立細粒棘球蚴感染小鼠模型，采用免疫組織化學法觀察GPR97、Sema3A和HuR蛋白在細粒棘球蚴感染小鼠肝臟中的表達情況，為進一步闡述這3種蛋白與細粒棘球蚴病的相互作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細粒棘球蚴原頭蚴 選擇6～8周齡雌性C57BL/6小鼠12只，飼養在新疆醫科大學動物實驗中心屏障系統環境[SYXK(新)2018-0002]。購買當地屠宰場感染細粒棘球蚴病的羊肝臟，抽取病灶組織囊液，收集原頭蚴。

1.1.2主要試劑與儀器 兔抗GPR97、Sema3A、HuR多克隆抗體(Affinity公司，美國)，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體、DAB顯色試劑盒、蘇木精和伊紅染液、天狼星紅染液、磷酸鹽緩沖液PBS(北京索萊寶科技有限公司)。試驗儀器主要有石蠟切片機(Leika公司，德國)和生物顯微鏡(Motic實業有限公司，廈門)等。

1.2 研究方法

1.2.1建立細粒棘球蚴感染肝臟模型 檢測原頭蚴活力并計數，通過小鼠肝門靜脈注射細粒棘球蚴500個，建立細粒棘球蚴感染小鼠肝臟模型。

1.2.2采集、處理肝臟標本 感染細粒棘球蚴2周和8周的小鼠經二氧化碳安樂處死，采集肝臟組織，經4%多聚甲醛固定后，經梯度乙醇脫水、石蠟包埋，制備肝臟石蠟切片。

1.2.3蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)和天狼星紅染色 肝臟石蠟切片置于60 ℃恒溫箱中烘烤30 min后，經脫蠟、二甲苯、梯度乙醇復水，用于進行蘇木素-伊紅染色和苦味酸-天狼星紅染色，再梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

1.2.4免疫組織化學染色 經梯度乙醇復水后的肝臟石蠟切片，依次進行檸檬酸鹽溶液微波中火加熱15 min，3%過氧化氫處理15 min，加封閉液室溫孵育1 h，PBS洗3次；加GPR97、Sema3A、HuR一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，加二抗室溫孵育2 h，PBS洗3次，加DAB顯色，顯微鏡下觀察，蘇木素復染，梯度乙醇脫水后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察GPR97、Sema3A、HuR蛋白表達情況，每個樣本隨機選取5張切片，每張片子隨機選取不重疊的5個包囊放大視野(200×)，在Motic生物顯微鏡下拍照、記錄，進行蛋白表達染色評分。染色評分由染色強度與程度的乘積確定，染色強度按照不著色為陰性(0分)、著淺黃色為弱陽性(1分)、著中黃色或著棕色且無背景著色或者著深棕色但有淺棕色背景為中等陽性(2分)、細胞著深棕色或棕褐色且無背景著色為強陽性(3分)，染色程度陽性細胞的頻率<5%為0分(-)、5%～25%為1分(+)、26%～50為2分(++)、51%～75%為3分(+++)、>75%為4分，包囊相關陽性細胞的頻率為占包囊的整體細胞。綜合評分分為0～1分為陰性(-)、2～4分為弱陽性(+)、5～8分為中度陽性(++)、9～12分為強陽性(+++)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 肝組織細胞學

HE染色和苦味酸-天狼星紅結果顯示，細粒棘球蚴感染第2周時小鼠的肝組織結構完整、肝索排列整齊，偶見纖維細胞大量增生、肉芽腫形成，炎性細胞增多，將炎癥組織放大觀察可見纖維化包囊逐漸成型；感染第8周時小鼠肝組織結構不完整，肝索排列紊亂，部分肝細胞被破壞、有炎性病灶，包囊出現空泡化，外囊外膜層纖維化組織增生且致密。見圖1、圖2。

注：A、C為第2周肝組織，B、D為第8周肝組織。圖1 細粒棘球蚴感染小鼠肝組織感染第2周和第8周時小鼠肝組織HE染色結果Fig.1 HE staining of liver tissues in mice with echinococcus granulosus infection in 2nd and 8th week

注：A、C為第2周肝組織，B、D為第8周肝組織。圖2 細粒棘球蚴感染小鼠肝組織第2周和第8周時苦味酸-天狼星紅染色結果Fig.2 Picric acid-Sirius red staining of liver tissues in mice with echinococcus granulosus infection in 2nd and 8th week

2.2 肝組織GPR97蛋白表達

GPR97蛋白免疫組化染色結果顯示，第2周時，小鼠肝組織初步形成的包囊內部分呈黃褐色陽性著色，肝細胞胞質有不同程度的黃色著色；第8周時，包囊空泡化后生發層細胞呈黃褐色陽性著色，外囊層無陽性表達；與感染第2周時比較，感染第8周時細粒棘球蚴感染小鼠肝內囊生發層細胞、外囊外膜層細胞、周圍肝組織細胞的GPR97蛋白表達免疫評分均升高(P<0.05)。見圖3。

2.3 肝組織HuR蛋白表達

HuR蛋白免疫組化染色結果顯示，第2周時，小鼠肝組織形成的包囊內基本無陽性表達，偶見褐色陽性著色，肝胞質呈黃色陽性；第8周時，包囊空泡化后生發層細胞呈黃色或黃褐色陽性著色，外膜層無陽性表達，周邊肝細胞胞質為黃色陽性；與感染第2周時比較，感染第8周時細粒棘球蚴感染小鼠肝內囊生發層細胞、外囊外膜層細胞、周圍肝組織細胞的HuR蛋白表達免疫評分均升高(P<0.05)。見圖4。

注：A、C為第2周肝組織GPR97蛋白免疫組化，B、D為第8周肝組織GPR97蛋白免疫組化。(1)與感染肝臟第2周時比較，P<0.05。圖3 細粒棘球蚴感染小鼠肝組織的GPR97蛋白表達Fig.3 Expression of GPR97 protein in liver tissues of mice with echinococcus granulosus infection

注：A、C為第2周肝組織HuR蛋白免疫組化，B、D為第8周肝組織HuR蛋白免疫組化。(1)與感染肝臟第2周時比較，P<0.05。圖4 細粒棘球蚴感染小鼠肝組織的HuR蛋白表達Fig.4 Expression of HuR protein in liver tissues of mice with echinococcus granulosus infection

2.4 肝組織Sema3A蛋白表達

Sema3A蛋白免疫組化染色結果顯示，第2周時，小鼠肝組織包囊內有黃褐色陽性著色，肝細胞質呈不同程度的黃色陽性；第8周時，包囊空泡化后生發層細胞呈黃色陽性，外膜層無陽性表達，周邊肝細胞質呈黃色陽性著色；與感染第2周時比較，感染第8周時細粒棘球蚴感染小鼠肝內囊生發層細胞、外囊外膜層細胞、周圍肝組織細胞的Sema3A蛋白表達免疫評分均升高(P<0.05)。見圖5。

注：A、C為第2周肝組織Sema3A蛋白免疫組化，B、D為第8周肝組織Sema3A蛋白免疫組化。(1)與感染肝臟第2周時比較，P<0.05。圖5 細粒棘球蚴感染小鼠肝組織Sema3A的蛋白表達Fig.5 Expression of Sema3A protein in liver tissues of mice with echinococcus granulosus infection

3 討論

細粒棘球蚴病是由細粒棘球絳蟲引起的一種人畜共患疾病，其在人體中通常保持無癥狀，直到包囊破裂或不斷生長變大，足以對周圍組織施加壓力，產生類似于占位性腫塊的癥狀[12]。本研究建立細粒棘球蚴感染小鼠模型，HE染色和天狼星紅染色結果表明，感染第2周時炎性細胞明顯增多、纖維化包囊逐漸形成，纖維化組織逐步增生且致密；第8周時，包囊空泡化，形成內囊和外囊結構。包蟲囊內側的生發層向囊腔內產生育囊，外側為無細胞角質層，具有彈性、機械抗性和過濾器的作用，保護生發層不被宿主細胞接觸。寄生蟲的生存策略不僅依賴于謀劃物理屏障，還依賴于下調宿主反應。囊外側被宿主炎癥細胞以及不同數量的纖維組織包圍[13]，常見情況還有包蟲立即被未過濾的膠原層包圍，而在寄生蟲較遠的地方發現一些炎癥灶[14]。在免疫細胞中，GPR97在白細胞中表達，如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞[8]，GPR97最初發現于小鼠腸淋巴管內皮細胞，在調節B細胞命運和淋巴內皮細胞遷移中起重要作用[15]。本研究結果顯示，在細粒棘球蚴感染小鼠模型中，GPR97在初形成的包囊中有弱陽性表達。感染初期炎性細胞增多，局部炎癥的維持與寄生蟲活力低下有關，而炎癥的消退與幼蟲的繁衍有關[13]。GPCRs位于細胞表面可以調控多種生理功能，但是關于GPR97在調節炎癥反應中的作用仍存在爭議。在高脂飲食喂養誘導的肥胖型小鼠體內，GPR97基因敲除可減輕脂肪組織炎癥，減少M1型巨噬細胞浸潤，增加M2型巨噬細胞浸潤，從而導致促炎因子表達降低，抑炎因子表達升高[16]，但在卵清蛋白誘導的過敏性哮喘的小鼠體內，GPR97基因敲除對炎癥因子產生沒有影響[17]。本研究結果表明，隨著包囊空泡化的形成，內囊生發層細胞中GPR97呈現強陽性表達，炎性病灶增多，可能參與介導炎癥反應。

HuR作為一類RNA結合蛋白，參與炎癥和免疫反應基因轉錄后調控。研究表明，糖尿病患者心臟HuR表達升高與炎癥標志物水平增高相關[18]。本研究結果顯示在細粒棘球蚴感染初期，包囊內基本無HuR陽性表達，待包囊空泡化后，HuR在內囊生發層細胞呈中等陽性，與GPR97陽性表達趨勢相近。Wei Fang等[19]發現缺血再灌注損傷模型小鼠腎臟HuR表達上調且與GPR97表達量呈正相關，并且GPR97通過影響HuR蛋白表達可對Sema3A進行轉錄后調節，從而影響Sema3A蛋白表達。Sema家族參與調節機體免疫反應，Sema3A與巨噬細胞共同培養時，誘導M1型巨噬細胞凋亡，而炎癥因子會下調Sema3A受體，阻止Sema3A誘導巨噬細胞凋亡[20-21]。本研究結果顯示，細粒棘球蚴感染初期時，Sema3A在形成的纖維化包囊中心細胞為弱陽性表達，在空泡化包囊生發層細胞也為弱陽性表達，提示炎性病灶增多可能會影響Sema3A蛋白表達。

綜上所述，GPR97、HuR和Sema3A在細粒棘球蚴感染小鼠第2周和第8周肝臟空泡化包囊中均有不同程度的陽性表達，可能參與感染相關的炎癥反應，是否為膜蛋白GPR97影響RNA結合蛋白HuR參與Sema3A信號通路調控，需進一步研究。