原代肝細胞外泌體對肝星狀細胞活化的影響

周霞， 黃佳， 瞿祥， 李亞騏， 朱加應， 姜海行

(1.貴州省人民醫院 急診內科， 貴州 貴陽 550000； 2.廣西醫科大學第一附屬醫院 消化內科， 廣西 南寧 530000)

慢性肝病是目前全球面臨的重大衛生健康問題，其病因包括病毒性肝炎、脂肪性肝病及藥物性肝病等[1-2]。在各種病因的作用下，肝細胞的死亡會引起肝臟組織的病理改變，最終導致肝纖維化、肝硬化或肝癌等不良后果[3-4]。肝纖維化是多種慢性肝病所致肝細胞慢性損傷后持續發展的共同病理過程[5]，肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化是導致肝纖維化發生和發展的中心環節。在肝損傷因素的作用下，HSCs從脂質存儲周細胞分化為表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的肌成纖維細胞，引起細胞外基質成分的改變，最終導致以Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen，COL1A1)為主的細胞外基質沉積，這是肝纖維化形成的重要環節之一[6-7]。外泌體是指包含了復雜RNA和蛋白質的盤狀囊泡[8]，天然存在于血液、唾液、尿液、腦脊液及乳汁等體液中，參與了細胞間的信息通訊。分化抗原9(cluster of differentiation，CD9)和腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene，TSG101)是外泌體常見的表面標志物，可用于外泌體的鑒定[9]。近年來，較多研究發現肝細胞外泌體在肝纖維化過程中起重要作用、并與HSC的活化有關[10-11]。目前大部分針對肝細胞外泌體的研究均來自于細胞系，本研究擬分離培養原代肝細胞，提取肝細胞外泌體、并與活化的HSC共培養，觀察HSC活化及纖維化相關基因的表達，初步探索正常肝細胞外泌體對HSC活化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

1.1.1實驗動物 SPF級C57BL/6雄性小鼠，7～8周齡，體質量約20 g，購于廣西醫科大學實驗動物中心，動物實驗操作過程均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》及倫理要求。

1.1.2主要實驗試劑和儀器 實驗所用主要試劑包括：D-Hanks液，小鼠肝細胞專用培養基，Ⅳ型膠原酶，青鏈霉素混合液，DMEM/F12培養基，1%磷鎢酸負染色液，糖原PAS染色液(細胞專用)；抗細胞角蛋白18(Anti-cytokeratin 18，Anti-CK18)抗體，Aniti-TSG101抗體，Aniti-CD9抗體，Anti-α-SMA抗體，山羊抗兔二抗488，山羊抗兔HRP二抗；逆轉錄試劑盒，實時定量PCR(qPCR)試劑盒，exoEasy Maxi Kit試劑盒。實驗儀器主要包括：5810R型臺式高速冷凍離心機，Q6實時熒光定量PCR儀，200目篩網，恒溫搖床等。

1.2 實驗方法

1.2.1小鼠原代肝細胞及HSC的分離培養C57BL/6小鼠麻醉后，采用Selgen兩步膠原酶灌注法[12]分離提取小鼠原代肝細胞，經3次低速離心進一步純化、專用培養基5 mL重懸細胞，吸取細胞懸液80 μL用于細胞計數和臺盼藍染色，其余細胞懸液接種于25 cm2培養瓶中；24 h觀察到細胞貼壁后，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗2次，更換培養基繼續培養，每3～5 d更換1次培養基。在原位兩步膠原酶灌流法的基礎上，結合密度梯度離心分離肝臟原代HSCs，將分離的HSCs重懸于10%胎牛血清的DMEM培養基中，24～48 h換液，繼續培養約1周。

1.2.2小鼠原代肝細胞糖原染色 提取小鼠原代肝細胞制作爬片、使用PAS固定液固定15 min，水洗晾干后加入氧化劑室溫氧化18 min，流水沖洗2次，蒸餾水浸洗2次，加入Schiff Reagent后置于室溫陰暗處浸染16 min，亞硫酸鈉滴洗2次，每次2 min。流水沖洗、經Mayer蘇木素復染1 min。水洗晾干后顯微鏡下觀察，采集圖像。

1.2.3小鼠原代肝細胞CK-18細胞化學染色 提取小鼠原代肝細胞制作爬片、室溫下經4%多聚甲醛固定30 min、PBS洗滌爬片3次，0.5%Triton-X 100室溫處理15 min、PBS洗滌爬片，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑后室溫下孵育10 min、PBS洗滌爬片3次，滴加封閉用正常山羊血清工作液、室溫封閉15 min。傾去血清，滴加CK-18一抗(abcam，1 ∶200)，37 ℃孵育60 min；PBS洗滌爬片3次后滴加生物素標記山羊抗兔IgG、室溫孵育15 min。PBS洗滌爬片3次，滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液、室溫孵育15 min；PBS洗滌爬片，DAB顯色液室溫孵育8 min、自來水沖洗、蘇木素染色孵育30 s，分化、沖洗返藍，水洗晾干后顯微鏡下觀察，采集圖像。

1.2.4小鼠原代HSC鑒定 原代HSC培養1周、接種于6孔板內的無菌蓋玻片上，細胞貼壁爬片后棄去培養基，4%多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片，0.5%Triton-X 100室溫通透20 min，滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min。傾去封閉液，玻片上滴加足夠量的α-SMA一抗(1 ∶250)，4 ℃孵育過夜。PBS浸洗玻片3次，滴加適量熒光二抗，室溫孵育60 min，滴加DAPI避光孵育5 min。用含熒光淬滅劑的封片液封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，采集圖像。

1.2.5小鼠原代肝細胞外泌體的提取 原代肝細胞培養24 h貼壁后，PBS洗2次，更換為10%無外泌體培養基繼續培養，24～48 h留取原代肝細胞上清32 mL，經0.22 μm過濾器過濾，按exoEasy Maxi Kit試劑盒操作步驟提取外泌體。BCA試劑盒定量外泌體蛋白濃度，將樣品-80 ℃保存備用。

1.2.6小鼠原代肝細胞外泌體形態 取外泌體懸液10 μL，銅網蓋在外泌體懸液上沉淀1 min，濾紙吸去浮液。吸取1%磷鎢酸負染液10 μL，銅網蓋在復染液上染色1 min，濾紙吸去浮液。常溫干燥數分鐘、上機，透射電子顯微鏡觀察外泌體形態，采用80 kV成像。

1.2.7小鼠原代肝細胞外泌體濃度和粒徑 去離子水清洗樣本池后，納米顆粒跟蹤分析儀(Nanoparticle tracking analyzer，NTA)分析經聚苯乙烯微球(110 nm)校準。采用PBS清洗樣本池，將稀釋后的樣本進樣檢測，ZetaView 8.04.02軟件進行分析。

1.2.8檢測小鼠原代肝細胞外泌體標志物 取外泌體蛋白20 μg經10%的SDS-PAGE凝膠，120 V恒壓電泳，當溴酚藍遷移至距離分離膠下緣約0.5 cm時，停止電泳。200 mA恒流轉膜70 min，5%脫脂牛奶室溫封閉2.5 h，加入CD9(abcam，1 ∶1 500)，TSG101(abcam，1 ∶1 000)抗體，置入4 ℃冰箱孵育過夜。經TBST洗膜后加入HRP標記的羊抗兔二抗(CST，1 ∶20 000)，室溫條件搖床孵育60 min，用Odyssey紅外激光成像系統檢測熒光信號并成像。

1.2.9小鼠原代肝細胞外泌體與HSCs共培養 12孔板中原代HSCs生長1周后，PBS洗2次，每孔加入無外泌體血清培養基500 μL，按BCA測定所得肝細胞外泌體濃度，以8 mg/L的濃度加入HSCs中共培養。

1.2.10HSC活化相關基因mRNA的表達 肝細胞外泌體與HSCs共培養24 h，提取細胞總RNA，參照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，采用Q6實時熒光定量PCR儀進行Real-time PCR反應：95 ℃變性1個循環30 s，PCR反應：95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40 個循環。PCR反應過程中，在儀器上將自動生成每個目的基因的PCR 融解曲線與擴增曲線。檢測HSCs中α-SMA及COL1A1 mRNA的表達情況，小鼠α-SMA、COL1A1 及GAPDH(內參照)基因的引物序列見表1。α-SMA、COL1A1 mRNA的表達水平通過2-ΔΔCt法確定[13]。

表1 小鼠α-SMA、COL1A1的引物序列Tab.1 Primer sequences of mouse α-SMA and COL1A1

1.3 統計學分析

所有實驗至少重復3 次，反應結果為3 次獨立實驗的校正結果；數據使用SPSS 20.0 軟件進行處理及分析，使用GraphPad 8.0 軟件進行繪圖，組間數據比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 原代肝細胞的培養及鑒定

臺盼藍染色顯示，細胞存活率為(87.80±3.27)%；分離的原代肝細胞呈圓形或橢圓形、透光度好，胞核清晰，每只小鼠可提取肝細胞數量約為2×107個；分離24～48 h時肝細胞完全貼壁，更換培養基為10%無外泌體血清培養基繼續培養，鏡下可見肝細胞胞體大、多邊形或不規則形，呈單核或雙核，胞漿豐富，細胞可穩定貼壁5～7 d(見圖1A～C)；肝細胞貼壁培養48 h的糖原染色顯示，肝細胞胞質內見染成紫紅色的糖原顆粒(圖1D)；抗CK-18免疫細胞化學染色示，肝細胞胞質內見染成棕黃色的CK-18抗原，呈均勻顆粒狀分布(圖1 E)；光鏡下觀察肝細胞形態、糖原染色及免疫細胞化學染色顯示，體外培養小鼠原代肝細胞純度>95%。

注：A為原代小鼠肝細胞培養12 h、B為24～28 h、C為5 d(臺盼藍染色，×100)，D為肝細胞糖原染色(200×)，E為肝細胞CK-18免疫細胞化學染色(200×)。圖1 原代小鼠肝細胞培養及鑒定Fig.1 Culture and identification of primary mouse hepatocytes

2.2 小鼠HSC的培養及鑒定

分離的HSCs重懸于10%胎牛血清的DMEM培養基中，24～48 h換液，約1周左右細胞出現明顯增殖，細胞鋪滿培養板，光鏡下見HSCs呈典型的肌成纖維樣細胞形態，免疫熒光染色顯示α-SMA陽性率>90%(圖2)。

注：A為光鏡下HSC呈典型的肌成纖維樣細胞形態(100×)，B為HSC細胞免疫熒光染色(200×)。圖2 小鼠原代肝臟HSCs培養及鑒定Fig.2 Culture and immunofluorescence staining of primary mouse HSCs

2.3 原代肝細胞外泌體提取及鑒定

提取的小鼠原代肝細胞貼壁24 h后，更換為10%無外泌體血清的培養基，24～48 h收集細胞上清，取原代肝細胞上清液32 mL提取外泌體。透射電子顯微鏡下觀察，肝細胞外泌體多為圓形或橢圓形、呈雙層膜樣結構，直徑約100 nm(圖3A)； NTA結果顯示外泌體樣品平均粒徑<150 nm，直徑<145 nm的外泌體約占94.4%(圖3B)。Western blot可見樣品中有外泌體標志物CD9和TSG101的表達(見圖3C)。

注：A為原代肝細胞外泌體電鏡圖像，B為原代肝細胞外泌體NTA檢測結果，C為Western blot檢測原代肝細胞外泌體及肝細胞CD9、TSG101的表達結果。圖3 原代肝細胞外泌體鑒定Fig.3 Identification of exosomes from primary hepatocytes

2.4 原代肝細胞外泌體對HSC活化的影響

將原代肝細胞外泌體與HSCs共培養24 h后，提取HSCs 總mRNA，檢測原代肝細胞外泌體對HSCs活化的影響。qRT-PCR結果顯示，與空白組比較，肝細胞外泌體組HSCs中α-SMA、COL1A1 mRNA的表達明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖4。提示原代肝細胞外泌體可通過抑制HSCs的活化，降低COL1A1的合成，從而抑制肝纖維化。

注：(1)與空白組比較，P<0.05。圖4 肝細胞外泌體對HSC 中α-SMA、COL1A1 mRNA表達的影響Fig.4 Effect of hepatocyte exosomes on expression of HSC α-SMA and COL1A1 mRNA

3 討論

肝細胞是肝臟最主要的實質細胞，參與了許多生理過程，肝細胞的分離對于肝病的研究具有重要意義，新鮮分離的原代肝細胞已成為生物醫學研究領域的重要工具[14]。Berry等[15]首次報道了兩步膠原酶灌注技術成功分離原代大鼠肝細胞。在膠原酶灌注技術的基礎上，較多研究在肝細胞分離過程中使用Percoll進行離心以純化肝細胞，Horner等[16]研究顯示，Percoll純化可導致大量的細胞損失，建議如果初始存活率高，可以省略這一步。本研究在原位兩步灌流法的基礎上，多次低速離心純化肝細胞，成功分離獲得原代肝細胞，且細胞存活率及純度較高。將原位兩步膠原酶灌流技術與密度梯度離心法結合，亦成功分離肝臟原代HSCs，可用于進一步的實驗研究。

外泌體是特指直徑在30～150 nm，包含了復雜RNA和蛋白質的盤狀囊泡，是細胞活化或凋亡后釋放的細胞外囊泡，它的組成取決于其細胞來源及相關刺激因素[17-18]。肝臟細胞來源的外泌體攜帶細胞特異性蛋白和微小RNA(microRNA，miRNA)，為肝臟疾病提供診斷學生物學標準和治療靶點[19-20]。不同病因作用下可改變肝細胞外泌體內含物的組成，調節肝纖維化的進程[21-22]。此外，肝細胞外泌體能容易地通過肝竇內皮，刺激各種非實質細胞，在信號傳遞中發揮重要作用，參與肝臟疾病的發病機制[23-24]。因此對肝細胞外泌體的研究能進一步闡明慢性肝病、肝纖維化的發病機制。為更準確了解肝細胞外泌體對HSCs的影響，本研究進一步提取原代正常肝細胞進行培養，實驗證實，原代肝細胞在無外泌體血清培養基中生長良好。exoEasy Maxi Kit試劑盒采用膜親和離心柱法從血漿、血清、細胞上清或其他生物液體中提取外泌體，取原代肝細胞上清液32 mL，通過膜親和離心柱法可順利提取原代肝細胞外泌體，并通過透射電鏡、NTA、Western blot三方面成功鑒定了原代肝細胞外泌體。Li等[25]將HepG2細胞系來源的外泌體(8 mg/L)與小鼠HSCs共培養發現，肝細胞系來源的外泌體可抑制HSCs中α-SMA及COL1A1的表達。所以，本研究將提取的原代正常小鼠肝細胞外泌體以8 mg/L的劑量與HSCs共培養，結果發現，與空白組相比，原代正常肝細胞外泌體與HSCs共培養后，HSCs活化的標志α-SMAmRNA明顯降低，COL1A1 mRNA的表達亦明顯降低，提示原代正常肝細胞外泌體可抑制HSCs活化及纖維化相關基因的表達。

綜上所述，本研究成功分離了原代小鼠肝細胞并獲得原代正常肝細胞外泌體，明確了正常肝細胞外泌體能抑制HSC的活化，為進一步探索不同病因下肝細胞外泌體內含物的變化，肝細胞外泌體在肝纖維化過程中的作用提供實驗基礎。