吞噬細胞運動蛋白1和原鈣黏附蛋白17啟動子甲基化水平對胃癌早期診斷的價值分析

趙洪乾 范少鵬 范立奎 李 磊

胃癌(gastric cancer，GC)是臨床上常見的腫瘤性疾病，尤其是隨著人們生活方式和飲食習慣的改變，GC的發病率也在逐年增加[1-2]。據流行病學統計結果表明，2020年，全球范圍內，確診的新發胃癌病例約為74萬例，其中89%以上病例出現在發展中國家，以中晚期胃癌為主[3]。單就我國而言，我國每年新發的胃癌患者約為12.4萬例，約86%以上患者為中晚期胃癌，少數為體檢發現的早期胃癌[4]。對于晚期胃癌患者，手術效果欠佳，多以放化療為主，5年生存率較低[5-6]。因此，如何對GC患者做到早期診斷和早期治療是臨床上的熱點問題。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學改變，也是癌癥發生的早期重要改變之一。相關研究表明，在胃癌患者血清組織中可見抑制基因(TSG)的甲基化，包括FAM5C，MYLK和p16等，并且可以在早期胃癌組織中表達量增加[7-8]。因此，檢測胃癌患者中血清中DNA的甲基化水平可能是胃癌早期診斷的潛在方法。上皮內瘤變(IN)是一種潛在的癌前病變，具有GC的高風險，因此，住院患者的篩查對于GC的診斷和預測至關重要。因此，在本研究中，以吞噬細胞運動蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)啟動子甲基化水平作為檢測指標，探求對胃癌早期診斷的作用，以期做到早期診斷和早期治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集自2018年1月至2020年1月我院普外科收治的147例患者為研究對象，其中胃上皮內瘤變者49例，腸上皮化生者40例，胃癌患者58例，并且以142例體檢健康者作為對照組。

收集患者的一般資料，包括性別、年齡等，收集患者的臨床病理學資料，包括腫瘤大小、位置、分化程度、淋巴結轉移和TNM分期等。

1.2 納入標準

①治療前均經胃鏡活檢，明確胃癌的診斷；②無血液系統疾??；③無明顯手術禁忌；④了解試驗的目的和方法，簽署知情同意書的患者。

1.3 排除診斷

①合并嚴重的內科疾病的患者，比如嚴重高血壓，糖尿病，冠心病等，不適合手術治療；②未簽署知情同意書的患者。

1.4 血清標本收集和DNA抽提以及重亞硫酸鹽修飾

抽取患者的清晨血，肘靜脈取血后，將血清置于預先加入肝素的試劑管中保存，4 ℃預冷離心機離心2000 rpm，時間設置為15 min，抽提上層的血清，分裝于1.5 ml的EP管中，置于-80 ℃以保存。

DNA的提取選擇碧云天公司的血清DNA提取試劑盒，按照說明書要求配置Buffer AW1試劑和Buffer AW2試劑，取消融的400 μl血漿，置于EP管中，加入400 μlBuffer AL，恒溫水浴箱孵育10 min，4 ℃預冷離心機離心2000 rpm，時間設置為15 min，取沉淀，加入400 μL無水乙醇，置于離心柱中，加入500 μL Buffer AW1試劑，4 ℃預冷離心機離心8000 rpm，時間設置為5 min，取沉淀，加入400 μl無水乙醇，置于新離心柱中，加入500 μl Buffer AW2試劑，4 ℃預冷離心機離心8000 rpm，時間設置為5 min，反復2次后，提取DNA樣本以備用。在260 nm波長下通過光譜法測量DNA濃度。用Zymo-DNA修飾試劑盒對DNA進行亞硫酸氫鹽處理。

1.5 甲基化特異性PCR檢測(MSP)

經過亞硫酸氫鹽處理后，DNA樣本中的未甲基化胞嘧啶變為尿嘧啶，甲基化胞嘧啶不變。引物設計由上海瑞捷生物有限公司負責。PCR的MSP擴增體系選擇Zymo Taq PreMix 反應體系，體積容量選擇6.5 μl，MSP反應程序設置：95 ℃反應10 min，擴增40個循環，然后在95 ℃下處理30 s，退火溫度設置為56 ℃下處理40 s，然后加入反應底物，瓊脂糖凝膠中120 V電泳30 min，然后紫外成像系統下觀察條帶，引物序列見表1。

表1 ELMO1和PCDH17的基因序列

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 胃癌腫瘤組織的甲基化結果

結果顯示，GC患者的腫瘤和相鄰正常DNA樣本進行全基因組Illumina甲基化EPIC芯片分析。比較了腫瘤和正常組織之間的甲基化結果，發現865918個CpG位點中的2180個(0.25%)在腫瘤組織中差異甲基化。這些CpG位點位于837個功能基因附近；腫瘤組高甲基化率為78.4%(1710個CpG位點)，低甲基化率為21.6%(470個CpG位點)。與數據庫對比，認為吞噬細胞運動蛋白1(Engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原鈣黏附蛋白17(Protocadherin 17，PCDH17)啟動子甲基化水平變化最大。

2.2 各組患者血漿中ELMO1和PCDH17的瓊脂糖結果

結果顯示，與對照組患者血漿中ELMO1和PCDH17的含量相比，胃癌組，上皮內瘤變組和腸化生組的血漿含量明顯升高(P<0.05)，見圖1。

注：NC為對照組；IM為腸上皮化生組；IN為上皮內瘤變組；GC為胃癌組。

2.3 胃癌患者臨床參數與血漿DNA甲基化的相關性分析

結果顯示，外周血中ELMO1啟動子甲基化與腫瘤分化程度呈正相關(OR=2.509，95%CI：1.207～3.424，P<0.05)，與淋巴結轉移呈正相關(OR=2.427，95%CI：1.114～4.076，P<0.05)，與浸潤深度呈正相關(OR=2.306，95%CI：1.136～3.548，P<0.05)，與CEA表達呈正相關(OR=2.115，95%CI：1.158～5.508，P<0.05)，與Hp表達呈正相關(OR=2.327，95%CI：1.479～4.638，P<0.05)。

外周血中PCDH17啟動子甲基化與腫瘤分化程度呈正相關(OR=2.634，95%CI：1.336～4.008，P<0.05)，與淋巴結轉移呈正相關(OR=2.967，95%CI：1.327～4.267，P<0.05)，與浸潤深度呈正相關(OR=2.576，95%CI：1.436～3.007，P<0.05)，與CEA表達呈正相關(OR=2.658，95%CI：1.367～5.157，P<0.05)，與Hp表達情況呈正相關(OR=2.997，95%CI：1.856～5.435，P<0.05)，見表2。

表2 胃癌患者臨床病理參數與血漿DNA甲基化的相關性分析/例

2.4 上皮內瘤變組患者臨床病理參數與血漿DNA甲基化的相關性分析

結果顯示，外周血中ELMO1和PCDH17啟動子甲基化水平與上皮內瘤變組患者臨床病理參數無明顯相關性(P>0.05)，見表3。

2.5 腸上皮化生組患者臨床病理參數與血漿DNA甲基化的相關性分析

結果顯示，外周血中ELMO1和PCDH17啟動子甲基化水平與腸上皮化生組患者臨床病理參數無明顯相關性(P>0.05)，見表4。

2.6 聯合檢測外周血中ELMO1和PCDH17甲基化對胃癌的診斷價值

結果顯示，聯合檢測外周血中ELMO1和PCDH17甲基化后的約登指數和ROC曲線下面積也明顯增加，高于任一單獨指標或其他聯合方式檢測，見表5。

表3 上皮內瘤變組患者臨床病理參數與血漿DNA甲基化的相關性分析/例

表4 腸上皮化生組患者臨床病理參數與血漿DNA甲基化的相關性分析/例

表5 聯合檢測外周血中ELMO1和PCDH17甲基化對胃癌的診斷價值

3 討論

胃癌是臨床上的常見腫瘤類型之一，多于患者的飲食、生活習慣密切相關。而對于胃癌的診療中，最重要的治療方法是早期診斷，早期治療和早期預防。對于胃癌的早期診斷方法的探索中，血清學指標是臨床上較為常用的方法之一。既往研究中，探究血清中胃蛋白酶原(PG)I、PGII和胃泌素-17(G-17)水平在萎縮性胃炎和胃癌篩查中的價值和臨床適用性，從而為臨床上胃癌的診斷和治療提供思路[9]。也有研究探究血清中的lncRNA MIAT和lncRNA CCAT1在胃癌早期診斷中的應用，可以作為生物標志物存在[10-11]。但是，其特異性和敏感性欠佳。在本研究中，我們以血清中吞噬細胞運動蛋白1和原鈣黏附蛋白17啟動子甲基化水平作為研究切入點，探究其對胃癌早期診斷和早期治療中的作用。

吞噬細胞運動蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)是指具有保守序列的一類蛋白質，與細胞的侵襲，遷移和吞噬密切相關。既往研究[12]中，他們認為肺癌細胞可以通過TGF-β信號通路介導ELMO1調控的腫瘤細胞的侵襲和凋亡。也有研究探討ELMO1在三陰性乳腺癌(TNBC)上皮細胞遷移和侵襲中的作用和機制。利用細胞遷移和細胞侵襲試驗，分別評估細胞活力、遷移和侵襲。結果表明，ELMO1的下調抑制了MDA-MB-231細胞的活力、遷移和侵襲，并降低了Rac1的活性，研究結果表明ELMO1通過RhoA/Rac1途徑抑制TNBC上皮細胞的遷移和侵襲[13]。原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)屬于鈣黏附蛋白超家族中的一員，可以發揮抑癌的作用。PCDH17的基因突變和甲基化改變與腫瘤的發生和發展密切相關，比如鼻咽癌，乳腺癌等。在本研究中，我們通過比較胃癌患者和癌周組織比較了腫瘤和正常組織之間的甲基化結果，發現吞噬細胞運動蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)啟動子甲基化水平變化最大。

DNA的甲基化改變是表觀遺傳學的常見類型之一，抑癌基因可以通過甲基化改變，基因的功能發生改變，從而進一步調控腫瘤細胞的侵襲和凋亡。既往研究中，抑瘤素M受體基因可以通過甲基化修飾，與胃癌患者的預后密切相關，可以作為生物靶向因子[14]。在本研究中，利用PCR瓊脂糖檢測胃癌患者，腸上皮化生，上皮內瘤變和對照組患血清中吞噬細胞運動蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)的甲基化改變，結果表明，胃癌患者中吞噬細胞運動蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)的甲基化水平明顯升高。

此外，本研究還探究了胃癌患者中，吞噬細胞運動蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)的甲基化改變與臨床資料的相關性，結果表明，外周血中ELMO1和PCDH17啟動子甲基化情況與腫瘤的分化程度，淋巴結轉移，浸潤深度，CEA表達水平和Hp表達情況呈正相關(P<0.05)。分析原因，可能是腫瘤分化越差，淋巴結已經轉移，浸潤深度較高，CEA表達水平較高以及Hp陽性的患者外周血中ELMO1和PCDH17啟動子甲基化水平明顯升高，可以作為生物標志物而存在。此外，本研究還聯合檢測外周血中ELMO1和PCDH17甲基化對胃癌的診斷價值，結果表明，聯合ELMO1和PCDH17啟動子甲基化水平檢測后，靈敏度和特異性明顯升高，約登指數和ROC曲線下面積也明顯增加。與朱春霞等[15]的研究結果相似，ELMO1和PCDH17的甲基化水平可以作為胃癌患者早期診斷的指標之一。

但是，本研究也存在一定的局限性，比如入組病例多為單中心病例，而且具體的作用機制尚未可知。因此，在本研究的后續工作中，將進一步完善該項工作。