胃黏膜病變中異常的黏蛋白表達及糖基化修飾

鄒 龍，楊愛明

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 1消化內科 2病理科，北京 100730

糖基化是蛋白質最常見的翻譯后修飾。通過不同的糖基轉移酶等催化，蛋白質與糖基共價相連，形成不同糖基化修飾的糖蛋白。糖蛋白是細胞的主要成分，其糖基結構參與細胞的多種關鍵生理過程，包括蛋白質的折疊、受體激活和信號轉導、細胞黏附、免疫監視等。如果蛋白質糖基化異常，細胞的生物學行為可能改變，這與多種疾病甚至腫瘤發生發展密切相關[1]。

黏蛋白是一類具有相似分子結構的高度糖基化的蛋白質家族，其蛋白質核心富含脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)。黏蛋白經過糖基化修飾形成的聚糖分子可占總體質量的50%～90%，并最終決定黏蛋白的生化特性和功能[2]。目前鑒定出的黏蛋白家族有22個成員，分為分泌型黏蛋白和膜結合型黏蛋白，主要分布于上皮細胞。分泌型黏蛋白包括MUC2、MUC5B、MUC5AC、MUC 6～8、MUC19，通過層疊作用形成黏液凝膠層，覆蓋于上皮細胞表面，發揮保護上皮的作用；膜結合型黏蛋白包括MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC11～13、MUC15～17、MUC20～22等，通常定位于上皮細胞的頂端，維持上皮細胞極性，其胞外區聚糖結構參與構成黏液，胞內區參與信號轉導，影響細胞的增殖、細胞與細胞及細胞外基質間的相互作用等。

細胞和組織如果發生了生理狀態的改變，會影響黏蛋白的糖基化修飾和表達。黏蛋白及其聚糖在臨床方面已經表現出很高的應用價值，比如血清學標志物CA15- 3、CA125所檢測的對象分別為MUC1、MUC16，它們已經作為乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤診斷及預后的標志物。這些診斷標志物雖已成熟應用，但對疾病早期診斷的敏感性低，疾病特異性也不高。另外，以MUC1等黏蛋白為靶點已經開展了多種免疫治療方法的探索，但目前主要應用于卵巢癌、結腸癌、肺癌等惡性腫瘤[3]。監測黏蛋白的表達及糖基化修飾在疾病過程中的變化，對于胃黏膜病變發現早期診斷標志物也有幫助，在疾病的干預與治療方面也有應用前景。

正常胃黏膜的黏蛋白表達及糖基化修飾

胃黏膜表面覆蓋的黏液可通過物理、化學機制保護上皮細胞，也能與胃腔內病原體相互作用，發揮生物性保護功能，并參與調節宿主免疫反應。構成胃黏液的最主要分子為黏蛋白。黏蛋白的分布具有細胞和組織特異性。正常胃黏液主要由分泌型黏蛋白MUC5AC、MUC6和膜結合型黏蛋白MUC1的胞外區參與構成，前兩者分別為胃表面上皮細胞、幽門腺體深部的細胞分泌，后者廣泛存在于表面上皮細胞的頂端。MUC1除了富含O-聚糖的胞外結構，還有富含酪氨酸的高度保守的胞內區，通過酪氨酸的磷酸化，與眾多蛋白質相互作用，調節胞內信號轉導[4]。

基于黏蛋白的蛋白質核心的結構特點，其糖基化修飾主要為黏蛋白型O-糖基化，即糖基與Ser或Thr殘基羥基的氧原子相連。這種糖鏈結構簡單，但連接形式繁多。黏蛋白型O-糖基化的第1步均由N-乙酰氨基半乳糖轉移酶催化，將乙酰氨基半乳糖殘基供給Ser或Thr的羥基，形成Tn抗原。隨后多見的反應模式為Tn抗原由半乳糖轉移酶催化，合成T抗原，又稱Core1。再由乙酰氨基葡萄糖轉移酶催化形成Core2，并進一步分支、延伸形成聚糖的主鏈和末端結構。正常胃上皮細胞中，Core2是黏蛋白糖鏈的主要核心結構，Tn、T抗原通常不會單獨表達[5- 6]。黏蛋白糖鏈末端主要為ABH血型抗原、Lewis血型抗原。MUC5AC、MUC1糖鏈末端主要是Lea、 Leb血型抗原，由巖藻糖轉移酶參與合成[4]。MUC6糖鏈末端主要為Lex、 Ley血型抗原，另外還有α- 1，4-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶參與催化合成含有α-GlcNAc的糖鏈末端[2]。

催化黏蛋白型O-聚糖形成的糖基轉移酶在不同物種、個體、組織、生理狀態有特異性表達模式，可識別特定氨基酸序列，調節O-糖基化的位點和密度，從而決定不同組織和器官的糖基化模式[7]。唾液酸轉移酶在正常胃上皮細胞中較少表達，多在病理狀態下出現，參與Lea、Lex抗原和Tn、T抗原的唾液酸化，分別合成唾液酸-Lea(sialy-Lea，SLea)、唾液酸-Lex(sialy-Lex，SLex)抗原和唾液酸-Tn(sialyl-Tn，STn)、唾液酸-T(sialyl-T，ST)抗原。STn、ST抗原的合成會導致糖鏈的提前終止，形成不成熟的截短聚糖，影響黏蛋白構型及功能。

幽門螺桿菌感染后的黏蛋白及其糖基化修飾改變

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)感染影響全球超過50%的成年人口，我國的感染率甚至超過70%[8]。約90%的胃部惡性腫瘤與Hp感染相關，1%～3%感染者可能發生胃癌或黏膜相關淋巴組織淋巴瘤[9- 10]。因而，Hp被WHO認定為Ⅰ類致癌物。黏蛋白作為胃黏膜的屏障，在Hp感染及致病過程中發揮重要作用。

Hp的外膜蛋白具有凝集素樣的結合特性，可識別聚糖，是介導Hp在胃內定植以及Hp與上皮細胞黏附的重要分子。目前研究最多的是血型抗原黏附素(blood group antigen binding adhesin，BabA)和唾液酸黏附素(sialic acid-binding adhesin，SabA)。BabA優先與Leb血型抗原結合；SabA主要與唾液酸化的抗原SLea和SLex結合，是致病Hp在胃內最常見的黏附方式[11]。它們的結合強度受pH值的影響，在中性環境中結合強度最高。正常狀態下，主要為MUC5AC攜帶Leb抗原，而很少有唾液酸化的聚糖存在。因此，表達BabA的Hp多與MUC5AC共定位于接近上皮細胞表面的黏液層。這是Hp一種自我保護機制，使細菌免受胃腔內機械、化學因素的影響。Hp與MUC5AC結合會使Hp隨著胃的蠕動排出胃腔，減少胃內細菌密度，也減少Hp與上皮細胞表面MUC1或糖脂的結合[11]。當黏膜處于炎癥狀態，上皮細胞表達白細胞介素(interleukin，IL)- 1β、IL- 2、IL- 6、IL- 8、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等促炎性細胞因子增多。這些促炎性細胞因子會激活解聚素金屬蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM17)、TNF-α轉化酶(TNF-α convertase，TACE)等蛋白酶，誘導MUC1分子的胞外糖鏈結構解離，使與其結合的細菌被排出[4，12]。Hp慢性感染時，上皮細胞唾液酸合成酶表達上調，導致黏蛋白唾液酸化，不成熟截短聚糖表達增多，糖基化的總量下調。再加上MUC1這種胞外結構的改變，黏蛋白對黏膜的保護作用會受到影響，使上皮細胞對外界刺激更敏感，導致炎癥狀態的持續。

Hp與黏蛋白型O-聚糖相互作用，會對細菌的生長和致病產生影響。健康胃黏膜產生的黏蛋白可抑制Hp生長。這一方面是由于BabA與Leb抗原結合會抑制Hp生長[7]；另一方面，MUC6糖鏈末端分子α-GlcNAc可抑制Hp細胞壁的重要組成成分膽甾醇-α-D-吡喃葡萄糖苷的合成，從而通過抗生素樣作用抑制Hp的生長，避免Hp分布于胃黏膜深部腺體[13]。另外，Hp外膜蛋白的表達具有動態性，這是細菌對宿主的一種適應能力，在Hp相關疾病的發生和發展中發揮重要作用。BabA與Leb抗原相結合會使細菌BabA表達減少而優先表達SabA，促進Hp與炎性胃黏膜的黏附[14- 15]。毒力因子cagA、ureA表達與BabA、SabA水平呈線性正相關[13]，這類細菌具有更強的致病性，與胃體萎縮、腸上皮化生、癌變等多種胃黏膜疾病相關[7]。

Hp會影響宿主黏蛋白的分泌、表達以及黏蛋白的糖基化。Hp感染使MUC5AC的分泌速度明顯減慢，并抑制黏蛋白的合成，導致表達MUC5AC、MUC1的上皮細胞明顯減少[16- 17]。在Hp感染狀態下，MUC6在胃表面上皮細胞中出現異常表達及定位[17]，但整體表達量沒有差異性變化[16]。

胃黏膜癌前狀態黏蛋白及其糖基化修飾改變

Correa級聯反應是目前公認的一種腸型胃癌的發病模型：由于Hp感染等因素引起胃黏膜慢性炎癥，導致多灶性腺體萎縮，并隨著萎縮的進展，上皮細胞出現腸上皮化生、異型增生，最終發生癌變。據估計，慢性萎縮性胃炎者胃癌發生率為(0.53～15.24)/1000人年，腸上皮化生者胃癌發生率為(0.38～17.08)/1000人年[18]。低級別異型增生和高級別異型增生診斷后5年內胃癌年發生率分別為0.6%和6.0%[19]。這些癌前狀態下，黏蛋白及其糖基化修飾也發生變化。

免疫組織化學半定量分析發現，萎縮性胃炎黏膜MUC5AC、MUC6表達均下調[20]。在正常胃黏膜中MUC6與α-GlcNAc共表達；而在慢性萎縮性胃炎患者的幽門腺中，α-GlcNAc表達量相對于MUC6顯著降低，Ki- 67指數相對更高[21]。

根據組織形態學和黏蛋白表達特征，腸上皮化生分為完全型腸上皮化生(Ⅰ型)和不完全型腸上皮化生(Ⅱ、Ⅲ型)。不同的腸上皮化生類型有不同的預后表現，Ⅰ型腸上皮化生黏膜癌變的風險并未增加，而Ⅱ型、Ⅲ型腸上皮化生癌變相對危險度分別提高至2.14和4.58[22]。黏蛋白表達及糖基化修飾的差異是不同腸上皮化生類型的主要鑒別點之一。完全型腸上皮化生同時具有杯狀細胞、吸收細胞和潘氏細胞，其中杯狀細胞合成和分泌MUC2，而MUC1、MUC5AC和MUC6在化生細胞中的表達完全缺失。不完全型腸上皮化生有杯狀細胞和柱狀細胞，其中杯狀細胞表達和分泌腸型黏蛋白MUC2，多數情況下胃型黏蛋白MUC1、MUC5AC、MUC6也在杯狀細胞和柱狀細胞中均有表達[23- 24]。Ⅱ型腸上皮化生表達中性或唾液酸化的黏蛋白，Ⅲ型腸上皮化生為硫酸化的黏蛋白。腸上皮化生的上皮細胞中，Tn和STn的表達增加。STn主要分布于杯狀細胞，以MUC2為載體；Tn則主要分布于柱狀上皮[5]。

異型增生的上皮細胞免疫組織化學特征與不完全型腸上皮化生相似，同時具有胃型、腸型黏蛋白表達，伴有STn抗原表達的異常升高[25]。MUC5AC表達量在出現高級別異型增生時，較低級別異型增生增多，而MUC6表達進一步下降，其糖鏈末端α-GlcNAc分子減少更明顯，Ki- 67也更高[25- 26]。

胃癌的黏蛋白及其糖基化修飾改變

根據我國腫瘤登記數據，2015年全國胃癌新發病例40.3萬例，累積發病率為2.29%，居癌癥發病譜第2位；死亡病例29.09萬例，累積死亡率為1.5%，居癌癥死亡順位第3位。中國人群胃癌世界人口標化發病率和死亡率為全球人群世界人口標化發病率和死亡率的2倍[27]。減輕胃癌的疾病負擔，仍是我國衛生健康行業需要重點努力的方向。腫瘤的生長是由于細胞異常分裂，逃避死亡信號和免疫監視，并且遷移至其他部位形成的。黏蛋白及其糖基化修飾的改變在腫瘤發生的每個過程中都發揮重要作用，參與癌細胞中信號傳導、腫瘤細胞的解離和侵襲、細胞-基質相互作用、免疫調節和轉移等細胞生物學過程[28]。

胃癌有多種病理分型方式，臨床多用的是Lauren分型，將胃癌分為腸型和彌漫型。腸型胃癌是最多見的病理類型，多認為由腸上皮化生進展而來。腸型胃癌細胞中，Core2的表達量減少，MUC6糖鏈末端的α-GlcNAc表達也減少，而T抗原、硫酸化聚糖和STn、ST等不成熟的唾液酸化聚糖表達量較正常上皮細胞增多[6]。α-GlcNAc缺乏與更深的腫瘤浸潤、脈管浸潤相關[29]，STn表達的增多也是不良預后的獨立危險因素[30]。Ozaki等[31]也發現MUC1異常表達STn與胃癌更強的轉移能力相關，其機制可能為STn增多使腫瘤細胞與基質蛋白的黏附減少[4]。腸型胃癌組織中，MUC2的表達異常升高，也是攜帶STn最主要的黏蛋白，轉移至淋巴管內的腫瘤細胞也可見攜帶STn的MUC2聚集。腸型胃癌組織MUC1、MUC3、MUC4、MUC5B的表達量增多，而MUC5AC、MUC6表達下降[26]。MUC1的過表達與胃癌發生脈管浸潤、淋巴結轉移和同步肝轉移相關[32]，MUC4在胃癌中表達升高是腫瘤不良生存預后的危險因素[33]。若背景黏膜MUC6表達缺失，則Ki- 67陽性細胞分布更多且也更廣，提示預后可能更差[34]。MUC1等膜結合型黏蛋白截短聚糖表達的增多會暴露抗原決定簇，與β-catenin形成胞內復合物，調節Wnt信號通路，激活細胞核內cyclin-D1的表達，抑制細胞凋亡并形成腫瘤[3]。并且，MUC1等膜結合型黏蛋白異常表達的唾液酸化聚糖會與免疫細胞表面表達的凝集素siglec結合，抑制NK細胞、樹突狀細胞、Th1細胞的活化，促進免疫細胞分泌IL- 10、轉化生長因子-β等細胞因子，發揮免疫逃避及免疫抑制特性[4]。

結 論

胃黏膜從正常狀態逐步發展為胃癌的過程中，上皮細胞黏蛋白及其糖基化修飾發生了異常的動態改變。MUC5AC表達的下調和黏蛋白唾液酸化聚糖表達的增多貫穿于整個疾病發展過程中，削弱了黏蛋白的保護作用。從萎縮性胃炎階段開始，MUC6表達量下調，其重要的糖鏈末端分子α-GlcNAc水平也出現更高程度的降低。處于這種異常黏蛋白表達及糖基化狀態的病變則預后更差。當上皮細胞發生腸上皮化生，MUC2即異常表達于胃部。若腸上皮化生狀態下，硫酸化聚糖表達異常增多，則預示更高的癌變風險。MUC1等膜結合型黏蛋白在胃癌中表達升高，其糖基化修飾也以截短的唾液酸化聚糖為主。這除了減弱對上皮細胞的保護，還會抑制細胞凋亡和宿主免疫，提示更差的預后，但也可作為干預的靶點。黏蛋白表達及糖基化修飾的改變反映了疾病狀態，反過來也會改變疾病進程。了解這些分子改變有利于認識胃上皮病變過程，對分子結構的鑒定有助于尋找潛在的診斷、預后標志物，甚至治療靶點。但由于糖蛋白結構及合成過程的復雜性和異質性，實現其在疾病診斷和治療中的應用依然任重而道遠。