紫堇靈對三陰性乳腺癌細胞增殖、干性以及凋亡的影響

李施霖，孔祥溢，方 儀

國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫學研究中心 中國醫學科學院 北京協和醫學院 腫瘤醫院乳腺外科，北京 100021

隨著醫學的進步與發展，雖然癌癥的治療手段越來越先進，但癌癥尤其是乳腺癌的發病率卻始終居高不下。據統計，僅2020年，全球乳腺癌新發病例約226萬，我國新發乳腺癌病例則超過40萬，全球死亡病例68萬，且發病呈現年輕化趨勢[1]。乳腺癌嚴重危害女性身心健康，其中三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌中惡性程度最高的類型，約占診斷出乳腺癌病例的15%～20%[2]。TNBC中雌激素受體、孕激素受體及人類表皮生長因子受體- 2均為陰性，缺乏治療靶點，且易發生化療耐藥，傳統化療藥物治療效果較差，因此尋找新型治療藥物十分必要。天然產物來源廣、毒性小、副作用少，是篩選新型化療藥物的理想來源。近年各領域均更傾向于應用天然產物開發藥物[3]。布氏紫堇為多年生草本植物，分布于中國北部和東部、蒙古的東南部、朝鮮半島的北部和俄羅斯的遠東地區等[4]。干燥的整株布氏紫堇在中國傳統中藥中稱之為苦地丁，苦地丁多用于抗炎、清熱解毒以及涼血消腫。而紫堇靈是提取自布氏紫堇干燥根帶全草的一種生物堿類，也是布氏紫堇的主要活性成分之一[5]。有研究顯示，紫堇靈的抗炎作用是由c-Jun氨基末端激酶和p38磷酸化的抑制介導的，而不是細胞外調節蛋白激酶1/2磷酸化，這些磷酸化事件又受到核因子E2相關因子2/抗氧化響應元件通路的調控[6]。紫堇靈還可在關節炎大鼠模型中通過抑制氧化應激及炎癥反應發揮抗風濕性關節炎的作用[7]。從中醫學的角度來講，腫瘤與體內毒邪有關，一般使用清熱解毒藥物加以治療，而腫瘤本身又可導致炎癥反應的產生，炎癥反應又反過來促進腫瘤的發生發展，因此，抑制炎癥反應可以在一定程度上扼制腫瘤的發展。目前對紫堇靈抗腫瘤的研究較少，僅報道了紫堇靈對于黑色素瘤的抑制作用：經紫堇靈處理的黑色素瘤細胞系活性氧增多，凋亡增加，細胞周期被阻滯于G2期，可被作為治療黑色素瘤的潛在藥物[6]。紫堇靈在TNBC中的抗癌作用報道更少。本研究通過CCK- 8法、Western blot等方法，探究紫堇靈對TNBC細胞增殖、干性、凋亡以及侵襲、轉移的作用，以明確紫堇靈對TNBC細胞的作用及機制，為開發新的抗TNBC藥物提供候選對象并奠定研究基礎。

材料和方法

材料紫堇靈(1 mg，純度 98.17%)購于上海陶素生化科技有限公司，以10 mmol/L的濃度溶解在二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，于-80 ℃儲存(圖1)。

圖1 紫堇靈化學結構式

細胞培養MDA-MB- 436細胞購自美國組織培養庫，在含10% 胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中，飽和濕度培養箱(37 ℃，5% CO2)中培養。MCF- 10A細胞購自美國組織培養庫，在含5% 馬血清、1%青霉素-鏈霉素2 mmol/L谷氨酰胺、20 μg/L生長因子、 100 μg/L霍亂霉素、0.01 g/L胰島素、500 μg/L氫化可的松的DMEM-F12培養基中，飽和濕度培養箱(37 ℃，5% CO2)中培養。

CCK- 8檢測細胞活力以 4×103個細胞/孔的密度將MDA-MB- 436 細胞接種在 96 孔板中。 24 h后，加入不同濃度的紫堇靈(0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μmol/L)培養24、48、72 h。培養終止，每孔加入10 μl CCK- 8試劑和100 μl無血清培養基，孵育1 h。使用96孔熱循環儀測量 450 nm 處的光密度值。

細胞平板克隆實驗以4.0×103/孔的密度將MDA-MB- 436細胞接種于6孔板中，用不同濃度的紫堇靈(1、2、5 μmol/L)處理細胞，并將加入等體積的DMSO處理者作為對照組。10 d后，將細胞用甲醇固定并用結晶紫染色。洗去多余的染料后，在倒置顯微鏡下拍照，按一定標準計數細胞形成的克隆數。

流式細胞術檢測細胞凋亡膜聯蛋白 V-熒光素異硫氰酸酯/碘化丙啶雙標記用于確定紫堇靈對MDA-MB- 436細胞的凋亡誘導作用。以每孔 5×105個細胞/孔的密度將MDA-MB- 436細胞接種于6孔板中，并以3、5 μmol/L的紫堇靈處理細胞24 h。然后用胰酶將細胞消化，離心，收集，用熒光素異硫氰酸酯偶聯的膜聯蛋白V和碘化丙啶對細胞進行孵育。通過流式細胞術測量細胞凋亡，并使用軟件(美國BD 生物科學細胞探索研究 6.1.3)分析數據。

蛋白質印跡分析使用蛋白裂解液(購自上海翊圣生物科技有限公司)從MDA-MB- 436細胞中提取蛋白質。使用BSA測定法測定蛋白濃度。本研究采用的分離膠濃度為10%，上樣量為20 μg蛋白質。采用70 V電壓，待蛋白樣品越過濃縮膠并且大約呈一條直線時，將電壓調升至100 V，直至電泳結束。電泳結束后，將分離膠上的蛋白轉移到 聚偏二氟乙烯膜。轉膜條件：4 ℃，轉膜2 h。轉膜結束后，使用5%脫脂奶粉封閉聚偏二氟乙烯膜，并以抗聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(1∶1000)、抗剪切的-半胱氨酸蛋白酶 3(1∶800)、抗β-actin(1∶3000)、抗八聚體結合轉錄因子4(octamer-binding transcription factor- 4，Oct- 4)(1∶1000)，抗Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor- 4，KLF4)(1∶800)，抗人胚胎干細胞關鍵蛋白2(SRY-related high-mobility-group-box protein- 2，SOX2)(1∶800)，抗重組人B細胞淋巴瘤因子2 XL(recombinant human B-cell leukemia/lymphoma XL，Bcl-XL)(1∶1000)，抗髓樣細胞白血病蛋白- 1(myeloid cell leukemia- 1，MCL- 1)(1∶1000)抗體4 ℃過夜孵育，然后加入二抗(1∶4000)在室溫下孵育1.5～2 h。使用普通曝光液和增強曝光液(均購自賽默飛世爾科技有限公司)對條帶進行顯影。此外，β-actin用于量化蛋白質的數量和完整性。使用ImageJ 1.8.0(美國國立衛生研究院)量化條帶的灰度。

細胞侵襲轉移按照1.2×105個細胞/孔的密度，將MDA-MB- 436細胞接種至由聚碳酸酯過濾器隔開的24孔碳酸脂膜板的上室。在上室添加無血清培養基(其中實驗組加入3 μmol/L紫堇靈，對照組加入等體積DMSO)，下室則添加含有20%胎牛血清的培養基。24 h后，棄去上室細胞，并用 0.5% 結晶紫將細胞在4 ℃固定染色24 h，使用倒置顯微鏡計數并拍照。

轉錄組測序分析用紫堇靈(3 μmol/L)處理MDA-MB- 436細胞。使用Trizol收集樣本并將其郵寄至明碼(上海)生物科技有限公司進行轉錄組測序與分析。

統計學處理使用 SPSS 26.0和 Prism 8.0.1中的t檢驗進行統計分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

半數抑制濃度根據測定結果繪制曲線并得出紫堇靈的半數抑制濃度為(4.209±0.898)μmol/L(圖2)。

圖2 紫堇靈在MDA-MB- 436細胞中24 h的半數抑制濃度

細胞增殖CCK- 8檢測顯示，紫堇靈可以抑制MDA-MB- 436細胞的增殖，且呈現時間與濃度依賴性(圖3)。另外，相應濃度的紫杉醇與紫堇靈對人正常乳腺上皮細胞MCF- 10A具有相似的抑制效應(圖4)。經過紫堇靈處理后，TNBC細胞MDA-MB- 436中的干性相關蛋白的表達量下降，且藥物作用濃度越高，干性蛋白表達量下降越多(圖5)。平板克隆實驗結果顯示，紫堇靈可以減少MDA-MB- 436細胞克隆數量的形成，并呈現濃度依賴性，進一步證實紫堇靈可對TNBC細胞的干性產生抑制(圖6)。

圖3 不同濃度紫堇靈處理的MDA-MB- 436細胞生長曲線

圖4 不同濃度紫堇靈與紫杉醇對正常乳腺上皮細胞MCF- 10A生長的影響

SOX2：抗人胚胎干細胞關鍵蛋白2；Oct4：八聚體結合轉錄因子4；KLF4：Kruppel樣因子4；Mr：相對分子質量；DMSO：二甲基亞砜；1：DMSO；2：3 μmol/L紫堇靈；3：5 μmol/L紫堇靈

圖6 不同濃度紫堇靈處理后MDA-MB- 436細胞克隆形成情況

細胞凋亡Western blot檢測顯示，經過紫堇靈處理后，聚ADP核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP)和剪切的半胱氨酸天冬酶 3蛋白表達量增高，而Bcl-XL和MCL- 1蛋白表達量減少(圖 7)。此外，流式細胞術檢測結果證實，紫堇靈可以促進TNBC細胞發生凋亡，且藥物作用濃度越高，凋亡越顯著(圖8)。

PARP：聚腺苷二磷酸核糖聚合酶；Bcl-XL：重組人B細胞淋巴瘤因子2 XL；MCL- 1：髓樣細胞白血病蛋白- 1；1：DMSO；2：3 μmol/L紫堇靈；3：5 μmol/L紫堇靈

圖8 流式細胞術檢測不同濃度紫堇靈處理MDA-MB- 436細胞時細胞凋亡情況

侵襲和轉移細胞侵襲轉移能力檢測結果顯示，紫堇靈對MDA-MB- 436細胞的侵襲和轉移能力無影響(圖9)。

圖9 紫堇靈對MDA-MB- 436細胞侵襲與轉移能力的影響

RNA-Seq轉錄組測序分析結果經過紫堇靈處理后的TNBC細胞與對照組相比，二者的差異表達基因的生物學過程主要富集在氧化磷酸化、電子轉移等方面。分子功能主要富集在NADH脫氫酶的活性，而細胞成分則富集在呼吸鏈中(圖10)。京都基因與基因組百科全書通路富集分析顯示，差異表達基因主要富集在氧化磷酸化通路中(圖11)。

圖10 基因本體論富集分析結果

圖11 京都基因與基因組百科全書通路富集分析

討 論

紫堇靈是苦地丁的有效活性成分，常用于抗炎、清熱解毒，既往研究顯示，其在大鼠模型中可有效抑制關節炎的發生[5]。但目前尚無紫堇靈在抗乳腺癌領域中的研究。本研究用不同濃度的紫堇靈處理TNBC細胞不同的時長，觀察細胞表型(包括增殖、干性、凋亡、侵襲和轉移)，結果顯示紫堇靈可以抑制TNBC細胞的增殖，具有時間依賴性和劑量依賴性。同時，還可以促進TNBC細胞的凋亡，呈現濃度依賴性。此外，本研究以正常乳腺上皮作為對照，證明紫堇靈對正常乳腺上皮無抑制作用，且與目前臨床化療用藥紫杉醇相當，表明紫堇靈對正常乳腺上皮細胞的毒副作用有限并可以被接受。

紫堇靈可以降低干性相關蛋白的表達水平。SOX2在細胞發育的所有階段均發揮重要作用。有研究證明，SOX2的過表達和基因擴增與多種腫瘤侵襲和轉移有關，SOX2常用于在乳腺癌中定義分化程度較低的“干細胞表型”[8- 9]。Oct4可在多種腫瘤細胞中被檢測到，并且在腫瘤干細胞中高表達；研究顯示治療后殘留的乳腺癌細胞中Oct4的表達顯著增加[10- 11]，這些都表明Oct4與腫瘤細胞的干性有關。KLF4也已被證明可用作多種腫瘤細胞的干性標記物。提示紫堇靈可抑制TNBC細胞的干性。

紫堇靈可以影響多種凋亡相關蛋白的表達：PARP、剪切的半胱氨酸天冬酶和MCL- 1等，并能通過多種方式調節細胞凋亡。PARP是一種DNA修復酶，可以修復DNA。PARP是細胞凋亡核心成員半胱氨酸天冬酶的裂解底物，在DNA損傷修復和細胞凋亡中發揮主要作用。PARP被剪切，表明細胞凋亡正在發生[12]。半胱氨酸天冬酶3是一種蛋白酶，其剪切體被認為是細胞凋亡發生的通用標志物和細胞毒性淋巴T細胞殺傷機制的重要組成部分。大多數與細胞凋亡相關的事件和生化過程都與半胱氨酸天冬酶3相關[13- 15]。Bcl-XL是Bcl- 2家族的一種抗凋亡蛋白，可與線粒體凋亡通路中的關鍵分子結合，抑制細胞凋亡[16- 17]；有研究表明，Bcl-XL可以通過破壞誘導死亡的信號復合物的形成，從而使半胱氨酸蛋白酶- 8失活，進而抑制細胞發生凋亡[18]。另一方面，Bcl-XL還可以通過與Bcl- 2家族的促凋亡成員Bax相互作用抑制細胞凋亡[19]。此外，Bcl- 2家族的抗凋亡蛋白MCL- 1最初發現于分化的髓系細胞中[20]，在高度分化的上皮細胞(如乳腺、肺上皮細胞等)的頂端層更為常見。MCL- 1的表達在細胞凋亡過程中降低，半胱氨酸天冬酶介導的切割可能與MCL- 1的下調有關。MCL- 1在惡性細胞的存活中發揮關鍵作用，其活性降低影響細胞的活力。其中PARP和剪切的半胱氨酸天冬酶3為促凋亡蛋白，而Bcl-XL和MCL- 1為抑制凋亡蛋白，表明紫堇靈可以促進TNBC細胞MDA-MB- 436發生凋亡，并呈現藥物濃度依賴性。本研究顯示高濃度藥物治療組相比于低濃度組和對照組，促凋亡蛋白的表達量明顯高于低濃度組，而高濃度藥物治療組抗凋亡蛋白的表達則受到抑制。表明紫堇靈可以顯著增強MDA-MB- 436細胞的凋亡途徑，從而抑制TNBC細胞的生長。

通過轉錄組測序和生物信息學相關分析，推測紫堇靈可能靶向氧化磷酸化途徑發揮抗癌活性。而且，其抗炎特性可能對腫瘤引起的炎癥反應發揮抑制作用，從而更好地抑制腫瘤的發生和發展。Weinburg等[21]研究顯示線粒體和活性氧與KRAS介導的腫瘤形成密切相關。另有研究顯示TNBC中的耐藥干細胞可以通過MYC和MLC1基因的擴增，上調腫瘤細胞的氧化磷酸化水平[22]。另外，在體外和異種移植模型中已經被證實，抑制氧化磷酸化水平可以抑制腫瘤生長，這為未來的抗腫瘤治療提供了潛在的選擇與方向[23]。由此，筆者大膽猜想紫堇靈可能通過調節氧化磷酸化途徑發揮抗TNBC的作用。

考慮到時間、培養條件、設備以及經費等客觀條件的限制，本研究未對RNA-Seq測序得出的結果進行進一步實驗驗證以及體內動物實驗。

針對紫堇靈相關的進一步研究，筆者認為可從以下幾方面進行：(1)本研究僅在1個TNBC細胞系中進行，若想得到深入的研究結論還應在其他更多的TNBC細胞系中進行實驗；(2)需要在多個其他TNBC細胞系中對紫堇靈進行藥代動力學評估、藥理研究以及藥物毒性的評價。若體外實驗結果較為理想，為了探索紫堇靈的臨床藥用價值，需要進行動物實驗，甚至是臨床藥物試驗；(3)針對紫堇靈作用機制的探索，可以從氧化磷酸化通路出發，檢測藥物作用前后通路中相關酶活性的變化，通過酶活性的差異繼續探究具體的作用機制(例如紫堇靈可特定靶向作用于某種酶)；(4)紫堇靈與目前臨床用藥(如紫杉醇)聯合使用的療效以及紫堇靈是否可以對化療藥物發揮增敏的效果也是未來值得探索的方向。

綜上，紫堇靈作為苦地丁的有效成分，可抑制MDA-MB- 436細胞的增殖與干性，并促進其發生凋亡。此外，這些抗癌作用可能都與紫堇靈對氧化磷酸化通路的調控相關。本研究為未來在臨床中使用紫堇靈治療TNBC提供了新的理論基礎，并為TNBC的治療提供了新的思路。