益智方水提物及其不同萃取部位對小鼠學習記憶障礙的改善作用

龍 杰 高 娜 王鈁鍵 李瑞海* 李民強

1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2.大連博格林生物科技有限公司，遼寧 大連 116000

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease, AD)是一種進行性疾病，在癡呆病例中占60%，是最應該受到重視的癡呆類型，臨床表現為記憶力減退，認知和學習功能障礙以及行為改變。以老年斑(senile plaque，SP)、神經元內神經原纖維纏結(neurofibrillaty tangle，NFT)和神經炎癥為主要的病理特征[1]。目前，我國人口老齡化問題日趨嚴重，阿爾茨海默病已經成為不可忽視一大疾病，因此迫切需要開發出改善阿爾茨海默病的藥物。

益智方由何首烏、柏子仁、黃精、蓮子、遠志、丹參6味中藥組成。何首烏、柏子仁、黃精為君藥。何首烏補益精血，補肝腎；柏子仁養心安神，可用于氣血虧虛所致的健忘；黃精滋補肝腎之陰。蓮子、遠志為輔。蓮子益腎固精，遠志多用于驚悸健忘。丹參清心安神?，F代研究表明何首烏[2]、柏子仁[3]、黃精[4]、蓮子[5]、遠志[6-7]、丹參[8]對學習記憶障礙都有明顯的改善作用。人體正常的學習記憶能力離不開膽堿能神經保持正常的活性，擬膽堿藥能夠使學習記憶障礙減輕，而抗膽堿藥則會加重學習記憶障礙[9]。據報道[10-11]，東莨菪堿作為抗膽堿藥可阻斷M膽堿受體，導致小鼠的學習記憶功能出現障礙，可作為學習記憶障礙和阿爾茨海默病的造模方法之一。

由于中藥在發揮藥效的過程中很難確定是單一的組分還是多個不同的組分[12]，實驗對益智方進行了組分拆分，采用腹腔注射氫溴酸東莨菪堿造模，探討益智方不同組分對學習記憶障礙小鼠的改善作用，以發現益智方中改善模型小鼠學習記憶障礙的有效組分。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性昆明種小鼠，SPF級，體質量26～30 g(遼寧長生生物技術股份有限公司)。

1.2 儀器 RE3000A旋轉蒸發器(上海越眾儀器設備有限公司)；HH-W600數顯三用恒溫水箱(金壇市白塔新寶儀器廠)；Morris水迷宮(賽昂斯SA220)；小鼠跳臺記錄儀(賽昂斯SA202)；LEICA DM1000顯微鏡，LEICA RM2255石蠟切片機，Arcadia H+C組織包埋機(大連博格林生物科技有限公司)。

1.3 藥物及試劑 益智方(何首烏、柏子仁、黃精、蓮子、遠志、丹參)均購于安國市廣盛商貿有限公司；吡拉西坦片(華中藥業股份有限公司，批號：20211006)；氫溴酸東莨菪堿(大連美侖生物科技有限公司，批號：MB5860)，HE染色試劑盒(大連美侖生物科技有限公司，批號：MB9898)。

2 方法

2.1 益智方組分的拆分 益智方(制何首烏15 g，黃精15 g，柏子仁7 g，遠志5 g，蓮子7 g，丹參10 g)稱取5個處方。加水浸泡后煎煮3次，趁熱用濾布過濾，合并濾液，靜置24 h。將濾液濃縮，取部分用作水煎液用藥。放冷后緩緩加入95%乙醇，快速攪拌，使含醇量達到80%，4 ℃放置24 h。收集上清液，沉淀加些許水溶解，放置水浴鍋80 ℃至無醇味，加水二次醇沉后4 ℃放置24 h。收集上清液，洗滌沉淀，干燥得到益智方多糖組分，收率為13.28%。上清液濃縮，放置水浴鍋80 ℃至無醇味，加水至益智方1倍量，用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇依次萃取至無色，回收試劑，萃取物水浴至無味得干膏。各組分的收率為石油醚(11.20%)、乙酸乙酯(4.68%)、正丁醇(2.43%)、多糖(13.28%)。

2.2 給藥與造模 益智方臨床擬用量為生藥59 g/d，根據前期Morris水迷宮實驗結果確定益智方有效劑量為35.80 g/kg，相當于臨床擬用量4倍(按照人與小鼠體表面積比換算給藥等效劑量)。85只小鼠，進行水迷宮訓練，去掉不會游泳鼠以及差異性大的鼠。取80只小鼠隨機分為8組，每組10只。對照組和模型組生理鹽水灌胃，陽性組吡拉西坦(0.686 g/kg)灌胃，石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組分別灌胃益智方水提物不同萃取部位(35.80 g/kg)，多糖組灌胃益智方多糖組分(35.80 g/kg)，水煎液組灌胃益智方水煎液(35.80 g/kg)，灌胃體積為0.1 mL/10 g，連續給藥7 d，第7天每組小鼠灌胃給藥益智方相應萃取部位，60 min后除對照組外腹腔注射氫溴酸東莨菪堿(2 mg/kg)，30 min后進行Morris水迷宮實驗和跳臺實驗。

2.3 益智方水提物及其拆分組分改善小鼠學習記憶障礙的研究

2.3.1 跳臺實驗 先斷開電源，將小鼠放置于平臺上，讓小鼠在跳臺內自由活動適應3 min，再將小鼠取出重新放入跳臺平臺上，同時打開電刺激。當小鼠受到箱底電柵刺激時會跳至平臺。記錄小鼠跳臺潛伏期和錯誤次數，即為學習成績。訓練完畢1 d后，再次進行實驗，記錄其3 min內跳臺潛伏期和錯誤次數，即為小鼠的記憶成績。

2.3.2 Morris水迷宮實驗 將平臺放置于第Ⅲ象限，小鼠面朝水池壁緩緩放入水中，記錄120 s內小鼠上臺的逃避潛伏期，若120 s內小鼠未能上臺則逃避潛伏期記為120 s，并將小鼠引導上臺，在平臺停留10 s。每天進行一次獲得性訓練，訓練3天。定位航行實驗在第4天進行，記錄小鼠的逃避潛伏期，導出小鼠的游泳軌跡圖。24 h后進行空間探索實驗，將位于第Ⅲ象限的平臺撤去，將小鼠從同一象限面朝池壁放入水池，記錄120 s內小鼠穿越平臺次數。

2.3.3 腦組織HE染色 行為學實驗結束后，腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，固定小鼠顱骨，用剪刀從枕骨大孔朝向同側眼眶剪，取出小鼠腦組織，放入4%多聚甲醛固定，梯度乙醇，二甲苯處理，石蠟包埋。切片，脫蠟后進行常規HE染色，觀察小鼠腦組織海馬區神經元細胞形態、數量等病理變化。

3 結果

3.1 跳臺實驗結果 由表1可知，模型組小鼠與對照組小鼠相比跳臺潛伏期明顯縮短(P<0.01)，錯誤次數明顯增加(P<0.01)，說明造模成功。與模型組小鼠比較，益智方水提物及其不同部位給藥組小鼠的錯誤次數降低(P<0.01)，跳臺潛伏期延長(P<0.01)，不同組分中石油醚組分效果最為明顯(<0.01)，乙酸乙酯組分、水煎液和多糖組分次之(P<0.01)，正丁醇相對于其他組分最弱(P<0.01)。

表1 跳臺實驗結果

表2 水迷宮實驗結果

3.2 水迷宮實驗結果 由表2、圖1可知，模型組小鼠與對照組小鼠相比到達平臺的潛伏期明顯增加(P<0.01)，穿越平臺次數增加(P<0.01)，說明造模成功。與模型組比較，益智方不同組分都能使小鼠逃避潛伏期變短(P<0.01)，穿越平臺次數增加；其中石油醚組小鼠和模型組小鼠相比，在120s內上臺潛伏期明顯變短(P<0.01)，穿越平臺次數明顯增加(P<0.01)；乙酸乙酯組分也能對模型小鼠有明顯的改善作用但較石油醚組分弱(P<0.01)。多糖組分和水煎液的改善作用次之。正丁醇組分也有較好的改善作用，但是相對于其他組分不明顯。

圖1 小鼠游泳軌跡圖

3.3 HE染色結果 由圖2可知，對照組海馬區錐體細胞數量多，細胞帶完整，神經元形態正常，核染均勻；模型組小鼠海馬區錐體細胞數量變少，細胞膜出現破裂腫脹，排列松散雜亂，出現核固縮。與模型組相比吡拉西坦陽性對照組和石油醚組錐體細胞形態較為正常，染色均勻，神經元細胞排列比較緊密，基本無神經元缺失的情況。

圖2 小鼠腦組織染色圖(×200)

4 討論

目前AD的發病機制尚未完全明確，其作為一種神經退行性疾病常常會伴隨記憶障礙和認知障礙[13-14]。在眾多的誘發原因中，膽堿功能受損是導致學習記憶障礙的原因之一。乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)作為一種神經遞質可與膽堿受體特異性結合，當其在人體中的含量增多時可顯著改善阿爾茨海默病[15]。東莨菪堿可以與ACh受體競爭性發生結合，阻止擬膽堿藥的激動作用，使人體ACh含量下降[16]。制備阿爾茨海默病以及學習記憶障礙模型時常常選擇東莨菪堿。根據中醫藥傳統理論，學習記憶障礙和認知障礙常常被稱為健忘，多歸于虛證，中醫一般認為與肝腎有關，精血虧虛，氣血不足都會導致記憶力減退、學習障礙等[17]。時間久后導致對智力的影響，從而引發阿爾茨海默病。

研究通過對益智方水提物不同部位進行萃取，實現了對益智方組分的拆分。通過跳臺以及Morris水迷宮行為學實驗，HE染色觀察海馬組織以期望找到益智方改善學習記憶障礙小鼠模型的活性部位。跳臺實驗中，益智方各個拆分組分均能不同程度地改善模型小鼠的學習記憶能力，使小鼠錯誤次數減少，跳臺潛伏期時間增加。水迷宮實驗中益智方各個拆分組分也均能對學習記憶障礙模型小鼠有不同程度的改善作用。其中石油醚組分的改善效果最為明顯，乙酸乙酯組分、水煎液和多糖組分次之，正丁醇組分相對不明顯。石油醚組分作為益智方有效部位給藥后，能維持模型小鼠錐體細胞數量，使細胞帶保持完整，對神經元形態起到保護作用，從而使小鼠行為學發生變化。綜上所述，益智方水提物及其不同萃取部位對東莨菪堿致小鼠記憶障礙都有不同程度的改善作用，其中石油醚組分最為顯著，其機制可能是通過對中樞膽堿能系統的調節從而對學習障礙起到改善作用。