KIF11通過激活Wnt/β-catenin通路調控高糖誘導的人視網膜微血管內皮細胞損傷△

韓昌婧 徐 麗 段雪娟 艾 欣

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病患者常見的微血管并發癥之一，它可能導致患者嚴重的視力障礙甚至失明[1]。近年來，隨著糖尿病的發病率逐漸增加，DR成了威脅中青年人群視力的常見因素[2]。DR的發病機制相當復雜，與視網膜炎癥、視網膜血管滲透性增加以及血-視網膜屏障破壞有關。這些過程會引起視網膜微血管內皮細胞無序地增殖和遷移以及毛細血管形成，最終導致視網膜新生血管形成[3-5]。KIF11是一種紡錘體驅動蛋白，在紡錘體雙極性的形成和維持中發揮重要作用[6]。近年來的研究發現，KIF11在多種腫瘤中過度表達，與腫瘤的發生發展密切相關[7-8]。下調KIF11可抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[9]。Shao等[10]分析GSE60436數據庫發現，KIF11在增生型DR視網膜組織中表達上調，且可能與血管生成和視網膜血管內皮細胞的增殖有關。但是KIF11在DR中的作用還未見報道。因此，本研究擬通過高糖誘導人視網膜微血管內皮細胞(HRMECs)損傷建立DR模型，分析KIF11在DR中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料HRMECs(中科院細胞庫)，DMEM培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，LiCl、總RNA提取試劑盒、通用逆轉錄PCR試劑盒(M-MLV)和Real-time PCR試劑盒(北京索萊寶公司)，Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)，CCK-8試劑盒(美國MedChemExpress公司)，Transwell小室(美國BD公司)，RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天公司)，抗KIF11、缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、β-catenin、cyclin D1和c-Myc兔單克隆抗體(美國Cell signaling technology公司)，抗VEGF小鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，抗GAPDH鼠單克隆抗體、HRP標記的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG二抗(北京康為試劑公司)。KIF11 siRNA序列(si-KIF11)、對照序列(si-NC)和Real-time PCR引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，ABI 7500 Real-time PCR儀和NanoDrop 2000C超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)，Tanon 4600 全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組將HRMECs培養在含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃，含體積分數5% CO2恒溫細胞培養箱中培養。正常培養24 h后，將細胞隨機分成4組：正常組、高糖組、高糖+si-NC組、高糖+si-KIF11組。正常組細胞在含5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養基中培養；高糖組細胞在含30 mmol·L-1葡萄糖的培養基中培養；高糖+si-NC組和高糖+si-KIF11組先使用Lipofectamine 3000將100 nmol·L-1si-NC或100 nmol·L-1si-KIF11分別轉染至細胞中，6 h后更換為完全培養基繼續培養48 h，然后再給予含30 mmol·L-1葡萄糖的培養基繼續孵育24 h。

另外，將正常培養的HRMECs隨機分成高糖組、高糖+si-KIF11組、高糖+si-KIF11+NC組和高糖+si-KIF11+LiCl組來驗證KIF11是否通過Wnt/β-catenin通路發揮作用。高糖組和高糖+si-KIF11組細胞處理方法同前。高糖+si-KIF11+NC組和高糖+si-KIF11+LiCl組在轉染si-KIF11后分別加入20 mmol·L-1NaCl或20 mmol·L-1LiCl孵育2 h后給予含30 mmol·L-1葡萄糖的培養基繼續孵育24 h。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力將HRMECs按照每孔1×103個接種到96孔板中，培養箱中培養24 h，分組處理后，每孔中加入10 μL CCK-8溶液繼續孵育2 h，用酶標儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度。

1.2.3 Transwell實驗檢測細胞遷移將分組處理后的HRMECs用胰蛋白酶消化后，無血清的DMEM培養基稀釋成濃度為105個·mL-1的細胞懸液。取200 μL細胞懸液加入到Transwell上室，下室加入含不同濃度的葡萄糖及體積分數20%胎牛血清的培養基。在細胞培養箱中孵育24 h后，用棉簽輕輕地將上層未遷移的細胞擦掉，下層PBS清洗后，40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色20 min，然后于顯微鏡下觀察拍照并對細胞進行計數。實驗重復3次。

1.2.4 Real-time PCR檢測細胞分組處理后，棄培養基，冰冷的PBS清洗細胞3次，用總RNA提取試劑盒提取細胞的總RNA，將總RNA沉淀溶解到無RNA酶的水中。然后根據試劑盒說明書配制20 μL的反應體系，將1 μg總RNA逆轉錄成cDNA。取1 μL cDNA根據Real-time PCR試劑盒說明書操作，進行PCR擴增。KIF11、VEGF和HIF-1α mRNA水平根據公式2-△△Ct計算，以GAPDH為內參，引物序列見表1。實驗重復3次。

1.2.5 Western blot檢測細胞分組處理后，加入100 μL RIPA裂解液裂解30 min，4 ℃條件下15 000 r·min-1離心10 min，吸取含總蛋白的上清液，用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，每個樣品取30 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將分離的蛋白轉移至PVDF膜上后，用50 g·L-1脫脂奶粉對膜進行封閉，之后加入提前稀釋好的一抗KIF11(11000)、HIF-1α(11000)、β-catenin(11000)、cyclin D1(1800)、c-Myc(1800)、VEGF(1600)和GAPDH (12000)在4 ℃過夜孵育。用TBST充分洗膜3次，加入二抗(15000)室溫孵育1 h。用ECL發光液對蛋白條帶進行顯色，并用ImageJ軟件分析各個蛋白條帶的吸光度。以GAPDH為內參，計算目的蛋白的表達量。實驗重復3次。

1.3 統計學分析采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，計量資料用均數±標準差表示。多組間數據的比較采用單因素方差分析，并用LSD-t方法進行兩兩比較。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 KIF11在高糖誘導的HRMECs中表達增加Real-time PCR和Western blot檢測KIF11 mRNA和蛋白表達，結果見圖1。高糖組HRMECs的KIF11 mRNA和蛋白表達均較正常組顯著升高(均為P<0.05)，高糖+si-KIF11組HRMECs的KIF11 mRNA和蛋白表達均低于高糖組(均為P<0.05)，而高糖+si-NC組與高糖組HRMECs的KIF11 mRNA和蛋白表達相比差異均無統計學意義(均為P>0.05)。

圖1 各組HRMECs的KIF11 mRNA和蛋白表達 A：Real-time PCR檢測結果；B：Western blot檢測結果；C：KIF11蛋白相對表達量。1：正常組；2：高糖組；3：高糖+si-NC組；4：高糖+si-KIF11組。與正常組相比，*P<0.05；與高糖組相比，#P<0.05。

2.2 降低KIF11表達對高糖誘導的HRMECs增殖的影響CCK-8法檢測結果顯示，正常組、高糖組、高糖+si-NC組和高糖+si-KIF11組HMRECs細胞活力分別為100.0%±4.0%、149.3%±6.5%、148.4%±8.5%、110.0%±5.6%。兩兩比較結果顯示，高糖組HRMECs細胞活力較正常組增加(P<0.05)，高糖+si-KIF11組HRMECs細胞活力低于高糖組(P<0.05)，而高糖+si-NC組與高糖組HRMECs細胞活力相比差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 降低KIF11表達對高糖誘導的HRMECs遷移的影響Transwell實驗檢測結果顯示，正常組、高糖組、高糖+si-NC組和高糖+si-KIF11組遷移細胞數分別為(48.3±4.7)個、(103.4±8.1)個、(100.3±9.1)個、(60.0±6.2)個。兩兩比較結果顯示，高糖組HRMECs遷移細胞數較正常組增多(P<0.05)，高糖+si-KIF11組HRMECs遷移細胞數低于高糖組(P<0.05)，而高糖+si-NC組與高糖組HRMECs遷移細胞數相比差異無統計學意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 各組HRMECs遷移情況 A：正常組；B：高糖組；C：高糖+si-NC組；D：高糖+si-KIF11組。

2.4 降低KIF11表達對高糖誘導的HRMECs血管生成相關因子表達的影響Real-time PCR和Western blot檢測血管生成相關因子VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白表達,結果見圖3。與正常組相比，高糖組HRMECs的VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白相對表達量均顯著升高(均為P<0.05)；高糖+si-KIF11組HRMECs的VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白相對表達量均低于高糖組(均為P<0.05)，而高糖+si-NC組與高糖組相比，HRMECs的VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白相對表達量差異均無統計學意義(均為P>0.05)。

圖3 各組HRMECs的VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白表達 A：VEGF mRNA相對表達量；B：HIF-1α mRNA相對表達量；C：Western blot檢測結果；D：VEGF蛋白相對表達量；E：HIF-1α蛋白相對表達量。1：正常組；2：高糖組；3：高糖+si-NC組；4：高糖+si-KIF11組。與正常組相比，*P<0.05；與高糖組相比，#P<0.05。

2.5 降低KIF11表達對Wnt/β-catenin通路的影響Western blot檢測Wnt/β-catenin通路的活化情況，結果見圖4。與正常組相比，高糖組HRMECs的β-catenin及下游分子cyclin D1和c-Myc蛋白相對表達量均顯著升高(均為P<0.05)；高糖+si-KIF11組HRMECs的β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白相對表達量均低于高糖組(均為P<0.05)，而高糖+si-NC組與高糖組相比，HRMECs的β-catenin、cyclin D1和c-Myc 蛋白相對表達量差異均無統計學意義(均為P>0.05)。

圖4 各組HRMECs的β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白表達 A：Western blot檢測結果；B：β-catenin蛋白相對表達量；C：cyclin D1蛋白相對表達量；D：c-Myc蛋白相對表達量。1:正常組；2：高糖組；3：高糖+si-NC組；4：高糖+si-KIF11組。與正常組相比，*P<0.05；與高糖組相比，#P<0.05。

2.6 Wnt/β-catenin通路激活劑可逆轉KIF11下調對高糖誘導的HRMECs損傷的影響CCK-8檢測和Transwell檢測結果顯示，高糖組、高糖+si-KIF11組、高糖+si-KIF11+NC組和高糖+si-KIF11+LiCl組HRMECs細胞活力分別為100.0%±5.3%、65.1%±5.6%、66.7%±6.4%、90.3%±5.7%，遷移細胞數分別為(106.0±7.5)個、(59.7±4.6)個、(57.7±7.0)個、(94.6±8.4)個。經統計學處理，高糖+si-KIF11+LiCl組細胞活力和遷移細胞數均較高糖+si-KIF11組增加(均為P<0.05)。Western blot檢測結果顯示，與高糖+si-KIF11組相比，高糖+si-KIF11+LiCl組HRMECs的VEGF和HIF-1α蛋白相對表達量均顯著升高(均為P<0.05)。高糖+si-KIF11+NC組與高糖+si-KIF11組相比，HRMECs的細胞活力、遷移細胞數、VEGF和HIF-1α蛋白相對表達量差異均無統計學意義(均為P>0.05)(圖5)。

圖5 LiCl對各組HRMECs的遷移及VEGF、HIF-1α蛋白表達的影響 A：Transwell檢測細胞遷移；B：Western blot檢測結果；C：VEGF蛋白相對表達量；D：HIF-1α蛋白相對表達量。2：高糖組；4：高糖+si-KIF11組;5：高糖+si-KIF11+NC組;6：高糖+si-KIF11+LiCl組。與高糖組相比，*P<0.05；與高糖+si-KIF11組相比，#P<0.05。

3 討論

DR是與糖尿病相關的慢性、嚴重的眼部并發癥，并且DR患者出現糖尿病相關的其他微血管和大血管并發癥的風險增加[11]。高血糖與DR的病理變化密切相關，可誘導血管新生、炎癥、氧化應激和細胞增殖[11]。VEGF是DR血管病理變化中一個重要的血管生成因子[12]。VEGF在多種視網膜細胞中表達，如視網膜血管內皮細胞、視網膜色素上皮細胞、Müller細胞、星形膠質細胞和神經節細胞[13]。在DR發病過程中，視網膜血管內皮細胞在血管形成中反應最為迅速[14]。過表達VEGF是引起血管新生和血管滲漏的主要因素。VEGF可通過自分泌信號促進人視網膜血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，在視網膜中也可通過旁分泌信號調節血管生成過程中與其他細胞的合作[15]。HIF-1α是調控VEGF表達的一個重要轉錄因子，在視網膜血管內皮細胞中可被高糖誘導表達[16]。因此，本研究通過體外高糖誘導HRMECs損傷來探究DR的分子機制。本研究中，經高糖處理后HRMECs的增殖、遷移能力增加，且血管生成相關因子VEGF和HIF-1α表達上調，這表明體外模型建立成功。

KIF11基因位于10q24.1，其結構在多個物種間具有保守性，主要由運動結構域、內部莖結構域和尾部結構域組成。研究證實，KIF11是調控細胞有絲分裂的一個重要分子[7]。近年來的研究顯示，KIF11在多種腫瘤細胞中表達增加，參與了腫瘤的發展進程[7-8]。KIF11與腫瘤發展中血管生成也存在一定聯系，如Luo等[17]等研究顯示，KIF11在腎母細胞瘤中表達升高；KIF11過表達不僅與瘤細胞的增殖有關，還與VEGF表達和瘤內微血管密度有關[17]。Exertier等[18]研究發現，KIF11抑制劑可減弱腫瘤細胞增殖，損傷內皮細胞血管生成能力。KIF11在增生型DR組織中表達上調，且其表達量與血管生成和視網膜血管內皮細胞增殖相關基因表達有關[10]。因此，本研究通過體外實驗探究了KIF11在DR中的作用。結果發現，KIF11在高糖誘導的HRMECs中表達上調，這與其在增生型DR組織中的表達趨勢一致[10]。下調KIF11表達顯著降低了高糖誘導的HRMECs的增殖、遷移以及VEGF和HIF-1α表達，這表明下調KIF11可抑制高糖誘導的HRMECs損傷，這主要與其血管生成被抑制有關。

本研究進一步探究了KIF11可能的作用機制。經典Wnt/β-catenin信號通路在胚胎生成和成體組織穩態中是一個進化保守的調節通路[19-20]。它對于包括眼在內的多種器官的血管形態形成至關重要。Wang等[21]研究發現，Wnt/β-catenin信號通路異常能引起多種眼科疾病。Wnt/β-catenin通路的過度活化與DR中的視網膜炎癥和血管生成有關[22]。Pei等[23]研究表明，KIF11可通過激活Wnt/β-catenin通路增加乳腺癌細胞的自我更新。因此，本研究進一步探究了KIF11是否通過Wnt/β-catenin通路在高糖誘導的HRMECs損傷中發揮作用。結果發現，下調KIF11顯著降低了高糖誘導的β-catenin及下游分子cyclin D1和c-Myc蛋白水平。LiCl通過抑制GSK-3β穩定游離的細胞質β-catenin蛋白，從而激活經典Wnt/β-catenin信號通路[22]。本研究使用LiCl進一步驗證發現，與高糖+si-KIF11組相比，高糖+si-KIF11+LiCl組HRMECs細胞活力和遷移細胞數均顯著增加，且VEGF和HIF-1α蛋白表達水平均顯著上調。這表明KIF11在高糖誘導的HRMECs中是通過活化Wnt/β-catenin通路發揮作用的。

綜上，本研究發現，KIF11在高糖誘導的HRMECs中表達增加，降低KIF11表達可通過阻止Wnt/β-catenin通路活化，抑制高糖誘導的細胞增殖、遷移和血管生成。本研究進一步闡明了DR的發病機制，并為DR的治療提供新的理論基礎。抑制KIF11可能是未來治療DR的新策略。