丹酚酸B對高糖誘導的視網膜Müller細胞凋亡、自噬及AMPK信號通路的影響

唐 霞 代 艷 楊效竹

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病最常見且嚴重的并發癥之一，也是老年人視力受損的主要原因之一[1-2]。目前對DR的治療包括視網膜激光光凝術和玻璃體切割術，但這些只能緩解癥狀，不能從根本上阻止疾病的進展。因此，確定DR的機制并探索治療DR患者的新方法非常重要。Müller細胞是視網膜中最常見的膠質細胞類型，跨越整個神經視網膜層，在維持視網膜的生理功能方面發揮著重要作用[1,3-4]。近年來，人們逐漸認識到Müller細胞的變性和凋亡與DR的發病機制有關，然而，具體機制尚不完全清楚。慢性高血糖可誘導Müller細胞凋亡，導致谷氨酸循環異常和視網膜微環境改變，加速神經元凋亡，導致DR視力下降，抑制Müller細胞凋亡可能是預防DR病理變化的一種治療策略[5]。有研究表明，丹酚酸B可通過抗脂質過氧化、抗氧自由基產生、提高細胞耐缺氧能力等預防糖尿病誘導的視網膜病變[6-8]。本研究旨在探究丹酚酸B對高糖誘導的視網膜Müller細胞凋亡、自噬及AMPK信號通路的影響，從AMPK-自噬-凋亡角度解析丹酚酸B防治DR的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑AMR-100型多功能酶標儀(杭州奧盛儀器有限公司)；6010可見-紫外分光光度計(美國安捷倫上海分析儀器廠)；ABI 7500型Real-time PCR系統(美國Applied Bio-Systems Instruments公司)；丹酚酸B(上海禾午生物科技有限公司)；成骨分化培養基(Cyagen Bioscience公司)；MTT(Sigma-Aldrich美國公司)；胎牛血清、10 g·L-1苯基甲烷磺酰氟、Hoechst 33258染色(Beyotime 公司)；兔抗大鼠Bax、AMPK、Bcl-2、p-AMPK單克隆抗體(武漢博士德公司)；兔抗鼠GS抗體(美國Abcam公司)；山羊抗兔IgG抗體(Bioker公司)；RIPA組織裂解液(南京碧云天生物制劑公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒、實時定量PCR反應體系試劑盒(美國Promega公司)。AMPK抑制劑Dorsomorphin (DS;亦名Compound C或 BML-275)、AMPK激活劑AICAR(美國Selleck公司)。

1.2 Müller細胞提取、培養及鑒定取出生4～7 d的SD大鼠5只(體重25～45 g，購自北京維通利華生物科技有限公司)，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后取出眼球，在碘伏及含100 U·mL-1青、鏈霉素混合液的D-Hank液中各浸泡10 min，D-Hank液沖洗，去除眼球外筋膜組織，沿角膜緣后1 mm剪開眼球壁，去除眼前節及玻璃體，分離視網膜，將視網膜剪成小碎片，2.5 g·L-1胰蛋白酶-EDTA消化液消化20 min，吸管吹打，用含體積分數10%胎牛血清、10 g·L-1青、鏈霉素混合液的RPMI-1640培養液終止消化，銅網過濾，將過濾液離心，棄上清液，沉淀物加細胞培養液吹打稀釋，接種于塑料培養瓶中，置于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養，每3 d換液1次，去除懸浮細胞，待細胞貼壁達到80%融合后按12傳代。

取第2代細胞接種于放置經多聚賴氨酸處理的蓋玻片的六孔板內，細胞貼壁后棄培養液，PBS液清洗；40 g·L-1多聚甲醛固定10 min，PBS液清洗；體積分數0.5% Triton穿孔15 min，PBS液清洗；體積分數5%山羊血清封閉30 min，加Müller細胞特異性標志物谷氨酰胺合成酶一抗(1200) 4 ℃過夜，PBS液漂洗；加山羊抗兔IgG二抗( 1500) 37 ℃雜交1 h，PBS液漂洗；加DAPI染核，PBS液漂洗，甘油封片，光鏡和熒光顯微鏡下觀察計數。

1.3 實驗分組取第3代或第4代Müller細胞隨機分為對照組、高糖組、高糖+丹酚酸B組、高糖+DS組、高糖+DS+丹酚酸B組、高糖+AICAR組和高糖+AICAR+丹酚酸B組。對照組細胞給予5 mmol·L-1低濃度葡萄糖孵育；高糖組細胞給予35 mmol·L-1高濃度葡萄糖孵育；高糖+丹酚酸B組細胞在35 mmol·L-1葡萄糖基礎上同時給予40 μmol·L-1丹酚酸B孵育；高糖+DS組細胞在35 mmol·L-1葡萄糖基礎上同時給予10 μmol·L-1DS孵育；高糖+DS+丹酚酸B組細胞在35 mmol·L-1葡萄糖基礎上同時給予40 μmol·L-1丹酚酸B和10 μmol·L-1DS孵育；高糖+AICAR組細胞在35 mmol·L-1葡萄糖基礎上同時給予1 mmol·L-1AICAR孵育；高糖+AICAR+丹酚酸B組細胞在35 mmol·L-1葡萄糖基礎上同時給予1 mmol·L-1AICAR和40 μmol·L-1丹酚酸B孵育。

1.4 檢測指標與檢測方法

1.4.1 MTT法檢測細胞活力細胞分組處理后48 h，分別加入1 g·L-1MTT于37 ℃、體積分數5% CO2中孵育5 h，去除MTT后，繼續孵育1 h，加入1 mL異丙醇，于570 nm波長下測量各組細胞光密度。

1.4.2 Hoechst 33258染色觀察細胞形態各組細胞以每孔5×104個接種于24孔板，培養24 h后，在40 g·L-1多聚甲醛中固定30 min，PBS液輕輕沖洗細胞3次，每孔加入1 mL Hoechst 33258于37 ℃ 染色45 min，PBS緩沖液輕輕沖洗細胞3次，熒光顯微鏡下觀察各組細胞凋亡情況。

1.4.3 Western blot檢測蛋白表達各組細胞培養7 d后，采用1 mL預冷RIPA組織裂解液裂解細胞，添加10 g·L-1苯基甲烷磺酰氟蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑制備細胞總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度。20 μg蛋白在100 g·L-1SDS-PAGE凝膠上電泳，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。在TBS-Tween 20中用50 g·L-1脫脂牛奶封閉后，4 ℃一抗(兔抗大鼠Beclin1、LC3-I、LC3-II、p-AMPK、AMPK、Bax和Bcl-2單克隆抗體，稀釋度均為11000)孵膜。然后用TBS-Tween 20洗滌3次，每次15 min，再與二抗山羊抗兔IgG抗體(1500)室溫孵育2 h，利用Image Lab軟件對各組蛋白灰度值進行檢測和量化。實驗重復3次。

1.4.4 qRT-PCR檢測自噬相關基因Beclin1和LC3-II mRNA表達各組細胞培養18 d后，Trizol試劑提取細胞總RNA，6010可見-紫外分光光度計檢測各組細胞RNA含量及質量，使用高效cDNA逆轉錄試劑盒制備cDNA，qRT-PCR檢測Beclin1、LC3-II mRNA表達，并使用2-ΔΔCt方法計算各組細胞mRNA相對表達量。引物序列：Beclin1上游引物為3’-GATCCACTGAGCACCGA-5’，下游引物為3’-CTCACCTGGTGGCATTGTG-5’；LC3-II上游引物為3’-CCAAGCGGAGACAGAAAC-5’，下游引物為3’-CCCAGGTCAGGGGATCTT-5’；β-actin上游引物為3’-ACGGTCAGGCATCACTATC-5’，下游引物為3’-TGCCACAGGATCCATACC-5’。實驗重復3次。

1.5 統計學處理采用SPSS 22.0進行統計學分析，計量資料均用均數±標準差表示，多組樣本均數間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。 檢驗水準:α=0.05。

2 結果

2.1 Müller細胞的鑒定光鏡下可見，細胞形態呈不規則梭形；熒光顯微鏡下可見，Müller細胞特異性標志物谷氨酰胺合成酶被標記為紅色，細胞核被標記為藍色，確定所獲得的細胞為Müller細胞，滿足研究需求(圖1)。

A：光鏡下觀察；B：熒光顯微鏡下觀察。圖1 Müller細胞鑒定結果

2.2 MTT法檢測結果MTT法檢測結果顯示，對照組、高糖組、高糖+丹酚酸B組、高糖+DS組、高糖+DS+丹酚酸B組、高糖+AICAR組和高糖+AICAR+丹酚酸B組Müller細胞活力分別為(100±22)%、(59±33)%、(98±2)%、(62±2)%、(63±3)%、(89±4)%和(91±5)% 。與對照組比較，高糖組Müller細胞的活力明顯降低，差異具有統計學意義(t=8.914,P<0.01)。與高糖組比較，高糖+DS組和高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞活力無顯著變化(t=0.194、0.404,均為P>0.05)，高糖+丹酚酸B組、高糖+AICAR組和高糖+AICAR+丹酚酸B組Müller細胞活力均顯著增加(t=8.114、7.004、5.144,均為P<0.01)。與高糖+丹酚酸B組比較，高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞活力顯著降低(t=7.404,P<0.01)，高糖+AICAR+丹酚酸B組Müller細胞活力無明顯變化(t=0.124,P>0.05)。

2.3 Hoechst 33258染色結果Hoechst 33258染色結果顯示，與對照組比較，高糖組Müller細胞的細胞核濃縮和DNA片段化顯著增加；與高糖組比較，高糖+丹酚酸B組、高糖+AICAR組Müller細胞的細胞核濃縮和DNA片段化顯著減少，高糖+DS組、高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞的細胞核濃縮和DNA片段化無顯著變化；與高糖+丹酚酸B組比較，高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞的細胞核濃縮和DNA片段化顯著增加，高糖+AICAR +丹酚酸B組Müller細胞的細胞核濃縮和DNA片段化無顯著變化(圖2)。

A：對照組；B：高糖組；C：高糖+丹酚酸B組；D：高糖+DS組；E：高糖+DS+丹酚酸B組；F：高糖+AICAR組；G：高糖+AICAR+丹酚酸B組。白色箭頭示發生細胞核濃縮和DNA片段化的Müller細胞。圖2 Hoechst 33258染色檢測各組細胞凋亡情況

2.4 各組細胞Bax及Bcl-2蛋白表達情況Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，高糖組、高糖+DS組和高糖+DS+丹酚酸B組Müller 細胞中Bcl-2蛋白表達均顯著減少，而Bax蛋白表達均顯著增加(均為P<0.01)，高糖+丹酚酸B組、高糖+AICAR組和高糖+AICAR+丹酚酸B組Müller 細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達差異均無統計學意義(均為P>0.05)。與高糖組比較，高糖+丹酚酸B組、高糖+AICAR組、高糖+AICAR+丹酚酸B組Müller細胞中Bcl-2蛋白表達均顯著增加，而Bax蛋白表達均顯著減少(均為P<0.01)，高糖+DS組、高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達差異均無統計學意義(均為P>0.05)。與高糖+丹酚酸B組比較，高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞中Bcl-2蛋白表達顯著減少，而Bax蛋白表達顯著增加(均為P<0.05)，高糖+AICAR+丹酚酸B組Müller細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達差異均無統計學意義(均為P>0.05)(圖3)。

1：對照組；2：高糖組；3：高糖+丹酚酸B組；4：高糖+DS組；5：高糖+DS+丹酚酸B組；6：高糖+AICAR組；7：高糖+AICAR+丹酚酸B組。與對照組比較，**P<0.01；與高糖組比較，##P<0.01；與高糖+丹酚酸B組比較，△P<0.05。圖3 Western blot檢測各組細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達情況

2.5 各組細胞Beclin1和LC3-II mRNA表達情況與對照組比較，高糖組、高糖+DS組和高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞中Beclin1和LC3-II mRNA表達均顯著減少(均為P<0.01)，高糖+丹酚酸B組、高糖+AICAR組和高糖+AICAR+丹酚酸B組Müller細胞中Beclin1和LC3-II mRNA表達均無顯著變化(均為P>0.05)。與高糖組比較，高糖+丹酚酸B組、高糖+AICAR組、高糖+AICAR+丹酚酸B組Müller細胞中Beclin1和LC3-II mRNA表達均顯著增加(均為P<0.05)，高糖+DS組、高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞中Beclin1和LC3-II mRNA表達均無顯著變化(均為P>0.05)。與高糖+丹酚酸B組比較，高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞中Beclin1和LC3-II mRNA表達均顯著減少(均為P<0.05)，高糖+AICAR+丹酚酸B組Müller細胞中Beclin1和LC3-II mRNA表達均無顯著變化(均為P>0.05)(表1)。

表1 各組細胞Beclin1和LC3-II mRNA表達情況

2.6 各組細胞Beclin1及LC3蛋白表達情況與對照組比較，高糖組、高糖+DS組和高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞中Beclin1和LC3-II 蛋白表達均顯著減少(均為P<0.01)，高糖+丹酚酸B組、高糖+AICAR組和高糖+AICAR+丹酚酸B組均無顯著變化(均為P>0.05)。與高糖組比較，高糖+丹酚酸B組、高糖+AICAR組、高糖+AICAR+丹酚酸B組Müller細胞中Beclin1和LC3-II 蛋白表達均顯著增加(均為P<0.05)，高糖+DS組、高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞中Beclin1和LC3-II蛋白表達均無顯著變化(均為P>0.05)。與高糖+丹酚酸B組比較，高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞中Beclin1和LC3-II蛋白表達均顯著減少(均為P<0.05)，高糖+AICAR+丹酚酸B組Müller細胞中Beclin1和LC3-II 蛋白表達均無顯著變化(均為P>0.05)。各組細胞間LC3-I蛋白表達差異均無統計學意義(均為P>0.05)(圖4)。

2.7 各組細胞AMPK及p-AMPK蛋白表達情況與對照組比較，高糖組、高糖+DS組和高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞中p-AMPK蛋白表達均顯著減少(均為P<0.01)，高糖+丹酚酸B組、高糖+AICAR組和高糖+AICAR+丹酚酸B組均無顯著變化(均為P>0.05)。與高糖組比較，高糖+丹酚酸B組、高糖+AICAR組、高糖+AICAR+丹酚酸B組Müller細胞中p-AMPK蛋白表達均顯著增加(均為P<0.01)，高糖+DS組、高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞中p-AMPK蛋白表達均無顯著變化(均為P>0.05)。與高糖+丹酚酸B組比較，高糖+DS+丹酚酸B組Müller細胞中p-AMPK蛋白表達均顯著減少(均為P<0.05)，高糖+AICAR+丹酚酸B組Müller細胞中p-AMPK蛋白表達無顯著變化(P>0.05)。各組細胞間AMPK蛋白表達差異均無統計學意義(均為P>0.05)(圖5)。

1：對照組；2：高糖組；3：高糖+丹酚酸B組；4：高糖+DS組；5：高糖+DS+丹酚酸B組；6：高糖+AICAR組；7：高糖+AICAR+丹酚酸B組。與對照組比較，**P<0.01；與高糖組比較，#P<0.05，##P<0.01；與高糖+丹酚酸組比較，△P<0.05。圖4 Western blot檢測各組細胞中Beclin1和LC3蛋白表達情況

1：對照組;2：高糖組;3：高糖+丹酚酸B組;4：高糖+DS組;5：高糖+DS+丹酚酸B組;6：高糖+AICAR組;7：高糖+AICAR+丹酚酸B組。與對照組比較，**P<0.01；與高糖組比較，##P<0.01；與高糖+丹酚酸B組比較，△P<0.05。圖5 Western blot檢測各組細胞中AMPK和p-AMPK蛋白表達情況

3 討論

DR是一種嚴重的糖尿病微血管并發癥，約占所有失明致病因素的5%，高血糖會增加視網膜及其毛細血管中的炎癥反應、細胞凋亡和氧化應激紊亂等[5,9-10]。有研究表明，從中藥丹參提取的丹酚酸B化合物可通過增加細胞自噬水平來減少細胞凋亡從而防治糖尿病并發癥，如糖尿病性白內障、糖尿病腎病、糖尿病心臟病和糖尿病腦病等[6]。AMPK信號轉導主要由絲氨酸/蘇氨酸激酶介導，參與調節細胞生長、分化及能量代謝平衡等諸多方面。本研究結果亦表明，丹酚酸B調節Müller細胞自噬及抗Müller細胞凋亡的機制可能是通過激活AMPK信號通路來實現的，為靶向AMPK信號通路開發治療DR新藥提供依據[11]。本研究結果表明，AMPK信號通路與高血糖誘導的Müller細胞凋亡密切相關，此外，增強AMPK活性可起到抗細胞凋亡作用。當AMPK被磷酸化時，它可以靶向激活下游許多分子通路的活性。Kubota等[11]研究證實，DR小鼠視網膜中p-AMPK的表達下調，激活AMPK通路，可能是DR一種有前景的治療策略。本研究結果表明，高血糖抑制了p-AMPK蛋白表達，丹酚酸B干預后促進了p-AMPK蛋白表達，丹酚酸B對AMPK通路的活化作用進一步被AMPK激動劑(AICAR)和AMPK抑制劑(DS)證實。

Müller細胞凋亡的特點是細胞變圓、膜起泡、細胞骨架塌陷、細胞質濃縮和碎裂、核固縮、染色質濃縮和碎裂以及凋亡小體的形成，這些細胞碎片會被巨噬細胞或鄰近細胞迅速吞噬[12-13]。高血糖顯著增加了Müller細胞的細胞核濃縮和DNA片段化，促進了Müller細胞的細胞凋亡，經過丹酚酸B處理后，Müller細胞的凋亡被顯著抑制，凋亡細胞的數量顯著減少，抑制AMPK信號轉導顯著增加了核凝聚并降低了丹酚酸B的抗凋亡作用，激活AMPK信號轉導減少了凋亡細胞的數量并促進了丹酚酸B的抗凋亡作用。高血糖抑制Müller細胞Bcl-2表達，促進Bax表達，誘導Müller細胞凋亡，丹酚酸B處理抑制了Bax表達，促進了Bcl-2表達，從而抑制了Müller細胞的凋亡。抑制AMPK信號轉導顯著增加了Bax表達，而抑制了Bcl-2表達，降低了丹酚酸B的抗凋亡作用，提示丹酚酸B抗細胞凋亡作用是由AMPK信號通路介導的。Müller細胞自噬和凋亡異常在DR的發病機制和/或病程進展中起著關鍵作用。自噬是一種細胞內自我降解過程，負責去除、降解和回收細胞質蛋白和細胞器，它涉及一系列連續的事件，包括雙膜形成、伸長、囊泡成熟和最終將目標物質輸送到溶酶體[1,3,14-16]。本研究結果表明，與對照組比較，高糖組Müller細胞中Beclin1和LC3-II 蛋白表達顯著減少，提示高血糖抑制Müller細胞自噬；丹酚酸B可通過激活自噬保護Müller細胞避免其凋亡。相關研究表明，自噬激動劑雷帕霉素(mTOR蛋白特異性抑制劑)可以抑制DR引起的氧化應激紊亂，改善代謝異常，激活細胞的自噬，可能在DR發生發展過程中發揮保護作用[3-4]。本研究中我們探討了丹酚酸B是否可以保護培養的原代大鼠視網膜Müller細胞免受高糖誘導的細胞凋亡，并探討其調控AMPK信號轉導和細胞自噬潛在的分子機制，為中醫藥干預DR提供依據[17-18]。

綜上，本研究結果表明，高血糖通過抑制AMPK信號通路抑制細胞自噬而誘導Müller細胞凋亡，導致DR發生發展。丹酚酸B可通過激活AMPK信號通路增強細胞自噬而抑制Müller細胞凋亡，維持細胞活力，促使細胞存活，從而對DR起到積極治療作用。本研究結果為臨床防治DR提供了參考和依據。