分子標記技術在花椰菜品種鑒定上的應用研究進展

宋曉玉 甘德芳 楊 琳 宋順華 孟淑春*

〔1 安徽農業大學園藝學院，安徽合肥 230036；2 北京市農林科學院蔬菜研究所，農業農村部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，農業農村部都市農業（北方）重點實驗室，北京 100097；3 中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081〕

隨著我國蔬菜種子產業的高速發展，越來越多的新品種涌入市場，同時也出現了種子摻假銷售、品種混雜以及同名異物、同物異名等現象。調查發現，假種子在生產過程中可能會出現產量低、長勢弱、產品品質下降等問題，使蔬菜產品經濟價值降低，種子市場紊亂，嚴重影響了蔬菜種子的生產、銷售和種業發展。因此，進行品種鑒定，打擊假冒偽劣種子，是保障種子質量，減少農戶經濟損失以及維護種子市場秩序的重要舉措。

花椰菜（Brassica oleraceaL.var.botrytisL.）屬于十字花科蕓薹屬，由歐洲野生甘藍演變而來（王冬梅，2011），起源于地中海沿岸，在我國各地均有種植，是重要的蔬菜作物之一。當前，我國已成為花椰菜種植面積最大的國家（單曉政等，2019），其中栽培面積較大的有山東、河南、甘肅、福建、廣東、浙江、上海、天津等地（朱煥煥，2019）?；ㄒ送庑蚊烙^、風味鮮美，具有極高的營養價值，其富含的鉀元素可有效預防心血管疾病的發生（丁云花 等，2016）?；ㄒ诉€含有蛋白質、碳水化合物、VC、多酚、類黃酮、萊菔硫烷等，丁燕等（2021）和陳敏氡等（2022）研究發現長期食用花椰菜可以降低癌癥發生的機率?；ㄒ似贩N主要以一代雜種的形式存在，具有生活力高、適應性強、品質優良等優點，但不可避免也會伴隨雜交種不純的現象產生。從種子生產過程來看，花椰菜雜交種的生產多是通過自交不親和系來繁育（趙振卿 等，2016），在繁育、采收以及加工過程可能混入其他基因型的種子而造成種子混雜，影響雜交種種子的純度（王夢夢 等，2022），進而造成生產損失。不僅如此，由于種子市場存在套牌、假冒的情況，品種侵權問題比較突出，對正規種子企業的切身利益產生負面影響，同時也給農民增收和農業經濟發展帶來無法估量的損失，因此開展花椰菜品種鑒定迫在眉睫。

傳統的形態學鑒別方法雖然存在一定的局限性，費工費時，易受外界環境因素影響，但是該方法相對簡易、直觀，在品種鑒定中仍然被廣泛采用且發揮重要作用（林琿 等，2012）。生化標記鑒定技術受環境因子影響小，已廣泛應用于玉米、水稻、麥類等糧食作物，且對多種蔬菜作物亦成功進行了品種鑒定，如辣椒、豌豆、番茄、大白菜、茄子等（周金蒙，2015），但利用生化標記技術對花椰菜進行品種鑒定的相關研究鮮有報道。生化標記雖能克服傳統形態學鑒別方法的缺點，但是多態性較低、穩定性較差，且不適合親緣關系近的品種鑒定（孫秀霞 等，2017），因此無法滿足種質資源鑒定和育種工作發展的需要。隨著DNA 分子標記技術的迅猛發展，根據物種之間遺傳物質DNA 的差異進行品種鑒定成為可能，并且取得顯著成效。DNA 分子標記技術逐步克服了傳統品種鑒定方法的不足，且不受環境因素和生長發育階段的影響，具有高效、快速、穩定、準確、經濟等優點，已在糧食作物、果樹、蔬菜、花卉等作物的品種鑒定中廣泛應用。本文對常用的分子標記技術主要包括RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段長度多態性）、RAPD（random amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態性）、SSR（simple sequence repeat，簡單重復序列）、ISSR（inter-simple sequence repeat，簡單序列重復區間擴增多態性）、SNP（single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態性）等，以及新發展起來的InDel（insertion-deletion length polymorphism，插入缺失長度多態性）和DNA 條形碼（DNA barcoding）在品種鑒定方面的研究進展進行了綜述，以期為花椰菜品種鑒定技術的選擇提供參考依據。

1 常用分子標記技術比較

DNA 分子標記技術主要分為三大類，第一類是以Southern 雜交為核心技術的分子標記，其中以RFLP 為代表；第二類是以PCR 擴增技術為基礎發展起來的分子標記，常見的有RAPD、AFLP、ISSR、SSR 等；第三類主要是基于高通量測序和DNA 芯片技術的分子標記，包括SNP 等。不同類型的分子標記各有優勢和不足（表1），RFLP、RAPD、AFLP 豐富度高，但是多態性表現為中等；SSR、SNP 多態性水平高；RFLP、AFLP、SSR、SNP 重復性好，其中RFLP、AFLP、SNP 對DNA 質量要求高；RFLP、SSR、SNP 為共顯性標記，且輔助選擇效率較好；RFLP、SNP 對技術要求高，故成本也高。

表1 常用DNA 分子標記技術比較

隨著DNA 分子標記技術的普及應用，RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SNP 等技術已經廣泛應用到蔬菜、果樹、糧食作物、藥用植物以及園林植物的品種鑒定、遺傳連鎖圖譜構建、遺傳多樣性分析、基因定位等研究中。其中，SSR 和SNP 技術在農作物品種鑒定中的應用最為廣泛，RFLP、AFLP、ISSR 以及DNA 條形碼技術在藥用植物鑒定中較常見。在過去很長一段時間內，RAPD 技術在十字花科作物研究中的應用最多，隨著分子標記技術的發展，ISSR、SSR、SNP 等技術已經替代了RAPD 技術，廣泛應用于十字花科蔬菜的品種鑒定、DNA 指紋圖譜構建、親緣關系與遺傳多樣性分析、基因定位等領域。

2 國內外花椰菜品種鑒定技術

2.1 RFLP 技術

RFLP 是以Southern 雜交技術為基礎，將DNA 樣品的酶切片段與特異性探針雜交結合，根據DNA 探針的不同呈現出多態性從而達到品種鑒定的目的。RFLP 是最早開發的一款分子標記鑒定技術（Grover &Sharma，2016），已在玉米、小麥、辣椒、番茄等作物上成功應用（朱小濤，2018）。但由于其操作技術難度大、成本高，對DNA 多態性檢出的靈敏度較低，且在試驗過程中需要使用放射性同位素及核酸雜交技術，既不安全又不利于自動化，導致應用受到限制，在花椰菜品種鑒定方面應用較少。

2.2 RAPD 技術

RAPD 是以PCR 擴增技術為基礎，基因組DNA 為模板，人工合成的單鏈引物為原料，使DNA 鏈擴增，擴增產物通過凝膠電泳技術進行檢測。眾多學者利用RAPD 技術對甘藍、辣椒、番茄、花椰菜、南瓜等蔬菜作物進行了品種鑒定研究，獲得了理想的試驗結果（劉子記等，2013）。RAPD 技術操作簡單、DNA 用量少、檢測速度快、成本低，已在花椰菜親緣關系研究、遺傳距離判斷以及品種鑒定等領域普遍應用。Astarini 等（2004）利用RAPD 技術對25 個花椰菜栽培品種的親緣關系進行分析，其中18 個樣本屬于不同品種，另外7 個樣本中的Donner 和SPS3074 屬于同一品種，認為RAPD 技術可有效區分同物異名現象。在此基礎上，Astarini 等（2006）利用4 個RAPD 引物成功區分了6 個花椰菜品種，再次證實了RAPD 技術可有效區分花椰菜種質。遺傳多樣性研究對花椰菜種質資源的收集、保存和利用具有重要意義。林琿（2007）和陳陽（2010）先后對花椰菜品種的遺傳多樣性進行分析，進一步證明了RAPD 技術對于花椰菜遺傳多樣性研究的可行性。綜上所述，RAPD技術雖然適用于花椰菜種質鑒定和遺傳多樣性分析，但是由于其顯性遺傳的特性，不能識別雜合子，且存在共遷移問題，只有不同長度DNA 片段能夠被凝膠電泳區分，而無法分離那些分子量相同但堿基序列不同的DNA 片段（劉麗華，2010）。除此以外，RAPD 技術對于反應條件極為敏感，試驗的穩定性和重復性都較低，在選擇合適的花椰菜品種鑒定技術時，這些不利因素均需考慮在內。

2.3 AFLP 技術

AFLP 是將RFLP 與PCR 技術相結合，兼具RFLP 和RAPD 技術的優點，具有較高的穩定性，且通過少量高效的引物組合即可獲得覆蓋整個基因組的AFLP 標記。AFLP 技術在進行花椰菜品種鑒定時既保證了可靠性，又維持了靈敏性。Seyis 等（2003）利用3 對AFLP 引物組合對源自印度黃油菜與5 個花椰菜品種雜交產生的165 個RS 油菜品系進行分析，共獲得467 條多態性條帶，表明RS系品種遺傳差異性較大，較容易被區分，該研究結果對花椰菜新品種選育和鑒定具有重大意義。古瑜等（2007）利用AFLP 和NBS profiling 技術鑒定花椰菜F2分離群體，成功構建了第1 個花椰菜遺傳連鎖圖譜，表明AFLP 技術適用于花椰菜品種的遺傳多樣性分析。EI-Esawi 等（2016）利用AFLP 分子標記對包括花椰菜在內的25 份蕓薹屬材料進行遺傳多樣性分析，11 對引物共擴增出471 個AFLP片段，其中423 個具有多態性，引物多態率高達90%，可以成功區分25 份參試材料。以上研究結果均表明，AFLP 技術不僅能對高代自交系進行遺傳多樣性分析鑒定，還能對不同品種雜交產生的品系和品種間的遺傳親緣關系進行驗證，從而選擇親緣關系遠、遺傳差異大的材料作為親本，通過雜種優勢將優良基因轉移到栽培種中，為新種質創制提供選擇依據。作為一種高效的鑒定技術，AFLP 具有多態性較好、穩定性高等優點，已在花椰菜遺傳育種、遺傳多樣性分析中發揮其優勢。但AFLP 技術對基因組DNA 純度、內切酶的質量和反應條件要求高；用于遺傳作圖時，少數標記與圖譜遺傳連鎖度存在偏差，使得該技術在遺傳連鎖圖譜構建方面的普及應用受到限制。

2.4 SSR 技術

SSR 又名微衛星DNA，通常存在于真核生物體中，是一類由1～6 個核苷酸組成的短串聯序列，由于SSR 中每個堿基的串聯重復數目不同以及重復單位數目的高度變異，故其具有豐富的多態性，有利于進行快速品種鑒定（楊夢婷等，2019）。在進行花椰菜品種鑒定時，可以先根據SSR 側翼序列的高度保守性設計引物，再利用PCR 技術進行目的片段的擴增，最后通過凝膠電泳技術檢測擴增產物，獲得含有目的條帶的電泳圖，并根據電泳圖上的條帶有無和數量多少來確定SSR 引物擴增的結果（楊金雪，2014；趙雅楠等，2015）。SSR 標記不僅能夠鑒定雜合體和純合體，而且結果可靠、方法簡單、省時省力，已經廣泛應用在花椰菜品種鑒定、分子標記輔助育種、基因定位和遺傳多樣性分析等領域。Ram 等（2016）利用SSR 引物BoGMS1041 產生的特異性位點，成功將花椰菜品種Sel-26 和Suprimax Late 區分開來。Pattanaik 等（2018）根據SSR 引物具有共顯性標記的特點，篩選出共顯性SSR 標記BrgMS565，成功鑒別出花椰菜雜交種中存在的親本株和異品種株。諸云霞等（2020）同樣利用SSR 標記成功鑒定了109 個花椰菜品種。綜上所述，針對花椰菜品種鑒定，SSR 分子標記是一項高效、穩定的技術。Verma 等（2017）利用SSR 和RAPD 技術鑒定花椰菜種質，成功區分開早熟和中熟花椰菜品種，并且根據鑒定結果可以推測出最優的花椰菜品種雜交組合，為花椰菜良種繁育提供了技術支持。SSR 技術不僅應用于花椰菜品種鑒定和育種方面，在遺傳多樣性分析中亦有廣泛應用。Rakshita 等（2021）以92 個花椰菜品種、2 個甘藍品種和2 個青花菜品種為試材，利用90 對多態性高的SSR 引物進行遺傳多樣性分析，通過聚類分析對參試材料間的親緣關系進行判斷，根據親緣關系的遠近可以有效區分這96 份材料。劉春晴等（2018）和Zhu 等（2018）利用SSR技術對花椰菜材料進行遺傳多樣性研究，并進行聚類分析，二者都證實了花椰菜遺傳多樣性與成熟度相關。由此可見，通過遺傳關系的分析，判斷不同花椰菜品種之間的遺傳距離，進而評價品種之間的異質性，是選擇優勢品種的依據。

2.5 ISSR 技術

ISSR 是基于SSR 技術發展而來的一種新型標記技術。該技術根據SSR 序列本身來設計引物，即在SSR 引物序列的一端插入2～4 個任意核苷酸，克服了SSR 標記應用時需要對研究材料進行DNA 測序的不足。ISSR 標記分布廣泛，進化變異速度快，具有很好的穩定性和多態性，在花椰菜品種鑒定中已有少量應用。馬二磊等（2010）利用1對ISSR引物NAUISR42區分開了9個花椰菜品種，證實ISSR 標記可用于花椰菜品種鑒定。在進行花椰菜新品種選育研究中，陶興林（2017）成功篩選出與花椰菜溫敏雄性不育基因連鎖的ISSR 分子標記，該研究成果加快了雜交花椰菜新品種選育的進程。ISSR 技術不僅應用于品種鑒定及新品種選育，在篩選抗病基因中同樣發揮重要作用。Saha 等（2014）利用RAPD、ISSR 和SSR 技術對花椰菜F2抗黑腐病群體和易感黑腐病群體進行分析，成功篩選出抗性植株；此外，RAPD 技術與ISSR 技術結合可提高抗黑腐病花椰菜品種選擇的準確性。Singh 等（2015）以高品質易感霜霉病和低品質抗霜霉病花椰菜的雜交品種為材料，利用6 個RAPD多態性標記和7 個ISSR 多態性標記成功定位花椰菜基因組中抗霜霉病基因Ppa3。雖然ISSR 技術已被證實可用于品種鑒定、抗病種質篩選等研究中，但是由于其通常為顯性標記，無法準確區分檢測位點的雜合與純合，因此未能在生產上廣泛應用。

2.6 SNP 技術

SNP 是指基因組中單個核苷酸的突變導致DNA 分子序列發生變化，從而具有多態性。SNP標記是當前用于檢測種內個體間遺傳變異的分子單位最小的技術（李貝貝 等，2017），具有數量多、穩定性好、分布廣泛等優點。SNP 技術已經應用于基因分型、基因定位、高密度遺傳連鎖圖譜構建、分子標記輔助育種等領域（Heet al.，2014；Yang et al.，2020）。趙振卿等（2019）找到一種與花椰菜花球毛花性狀連鎖的SNP 位點，設計引物并成功區分出不同花球性狀的花椰菜品種，該方法可在苗期對花椰菜材料進行檢測，淘汰含有易毛花基因型的材料，大幅度減少花椰菜種植過程中的田間管理和表型鑒定的工作量。盛小光等（2020）開發了一種用于鑒別浙農松花80 天的SNP 引物，采用KASP 標記技術，成功鑒定208 份花椰菜材料的純度，鑒定結果與形態學檢測的結果完全一致，充分證明了該研究方法在花椰菜品種純度鑒定中的可靠性。Yousef 等（2018）開發SNP 標記用于191 份花椰菜材料的遺傳多樣性分析，結果表明花椰菜品種的親緣關系遠近與產地相關。

DNA 基因芯片技術是SNP 標記的檢測方法之一?；蛐酒蟹植即罅康腄NA 探針，這些探針可與目標DNA 產生特異性反應，進而篩選出眾多SNP 位點，具有快速性、高通量、自動化等優勢（王端瑩，2017）?；蛐酒夹g已經在水稻、小麥、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄等作物中逐漸得到應用（Bayer et al.，2017）。在蕓薹屬蔬菜作物中，目前已經開發出油菜高密度Illumina Infinium（60 K）基因芯片，其中包含52 157 個SNP 位點，在油菜遺傳圖譜構建、全基因組關聯分析和重要質量性狀的QTL 定位等方面得到有效的應用（周龍華和蔣立希，2016）。高通量檢測是基因芯片技術的一大優勢，即一次可以對多個SNP 位點進行規模性篩選，大大提高了檢測效率，并且有利于實現分析的自動化，適用于快速、規?；Y查（蘇瑞 等，2019）。進行SNP 檢測的方法有很多，其中最佳方法是基因芯片技術，但是需要進行大量的生物信息學分析，然后設計引物、擴增測序?；蛐酒O計成本高，技術難度大，測序復雜，故SNP 標記的開發和應用在花椰菜品種鑒定方面目前還處于初級階段，尚未得到普遍應用。

2.7 InDel 技術

隨著新一代轉錄組測序技術的快速發展，針對已有參考序列的物種，對其進行全基因組重測序，可發現大量插入缺失位點。InDel 是基于全基因組測序技術的第3 代分子標記，指在近緣種或同種不同個體之間基因組的同一位點插入或者缺失不同大小的核酸片段（吳鑫燕 等，2021）。InDel 標記在基因組中分布廣泛，開發成本低，利用瓊脂糖凝膠電泳即可進行試驗操作。目前在水稻（Moonsap et al.，2019）、大豆（陳正杰 等，2021）、辣椒（Guo et al.，2019）、茄子（吉康娜 等，2019）等作物中均有研究，同時在大白菜（薛銀鴿 等，2014）、甘藍型油菜（倪西源 等，2020）、普通白菜（青梗菜）（王群 等，2021）、花椰菜（王夢夢 等，2022）等十字花科蔬菜作物中亦有應用。王夢夢等（2022）基于花椰菜品種津品70 的兩個親本自交系的重測序，開發InDel 標記成功用于津品70 品種真實性鑒定以及純度鑒定；并構建了16 個花椰菜雜交種的數字核酸指紋圖譜，為花椰菜種質資源鑒定提供了重要的技術支持。吳鑫燕等（2021）依據BSA重測序對花椰菜中松花性狀進行基因定位，開發出2 個InDel 連鎖標記，均能區分出F2分離群體中的極端松花類型和極端緊花類型，該研究為花椰菜雜交育種親本及組合的選配提供了參考依據。張小麗等（2022）利用InDel 標記成功篩選出與白色花椰菜花球變紫性狀連鎖的InDel 標記，該標記在幼苗期即可進行花球不變紫的花椰菜種質資源篩選和鑒定。但是InDel 技術也存在自身的限制，由于一些非模式作物基因組測序尚未完成，導致開發InDel標記存在一些困難，使其應用也受到一定影響（楊潔 等，2016）。

2.8 DNA 條形碼技術

DNA 條形碼是利用較短的標準DNA 片段快速準確的識別動植物群體（Gogoi &Bhau，2018），且在種內具有穩定的保守性，在種間具有豐富的遺傳變異多樣性。已有大量研究表明該技術廣泛應用于動物、藥用植物、真菌等物種的鑒別（楊倩倩 等，2018）。DNA 條形碼技術發展至今已建立了較為完善的生命條形碼數據系統（barcode of life database system，BOLD），根據BOLD 數據庫網站（http：//www.barcodinglife.org）報道，目前已經收錄了包含動物、植物、真菌在內的9 971 821 條DNA條形碼。DNA條形碼作為一種新的鑒定技術，操作方便快捷，準確性高，使用樣本量少，可用于大量品種的鑒別，在很大程度上彌補了傳統鑒定技術的不足，且不局限于物種形態特征和生長發育階段，在沒有分類學的基礎下也可以進行很好的識別（Song et al.，2016）。但需要重視的是，該技術對試驗操作過程要求嚴格，DNA 質量要求高，如若在DNA 提取和PCR 反應試驗過程中造成DNA 污染，則可能會使DNA 條形碼產生虛假識別（Yang et al.，2017）。

3 SSR 分子標記在花椰菜品種鑒定中存在的問題及解決辦法

綜合分析各分子標記技術在花椰菜品種鑒定中的應用研究，SSR 技術表現出獨特的優越性，具有多態性豐富、重復性好、輔助選擇效率高等優勢，且為共顯性標記，對于DNA 質量和操作技術要求不高。但是，在利用SSR 技術進行花椰菜品種鑒定的過程中也發現一些問題，建議采用相應辦法解決。

利用SSR 技術鑒定花椰菜品種時需要篩選出多態性豐富的核心引物，該過程耗時過長，并且需要通過大量材料對核心引物的可行性進行佐證，因此縮短引物篩選時間并篩選出多態性豐富的核心引物是進行花椰菜品種鑒定的關鍵所在。篩選引物時應選擇表型性狀差異大的品種作為鑒定材料，并且設計合適的篩選條件。另外，在進行花椰菜品種鑒定數據分析過程中，根據指紋圖譜檢測種子基因型的位點差異存在片面性，鑒定結果只能說明SSR標記位點相同，不能排除未檢測到的位點存在差異，應盡可能構建完整的花椰菜品種指紋圖譜庫或者給定品種范圍進行檢測鑒定。

盛小光等（2019）采用30 對SSR 引物對187份花椰菜、青花菜材料進行遺傳多樣性分析，擴增出313 個等位位點，根據花球性狀可以將這187 份材料分成4 類，根據等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannon’s 指數等指標分析得出花椰菜類群的遺傳差異較小。Zhao 等（2016）利用SSR 技術分析不同花椰菜品種間的遺傳多樣性，結果表明花椰菜品種的遺傳背景差異較小，遺傳多樣性狹窄，難以用分子標記進行區分。因此對遺傳背景相似的花椰菜品種進行精準區分亟待解決，可選擇遺傳背景遠且性狀有明顯差異的花椰菜品種用于SSR 引物的多態性篩選，同時可與其他分子標記技術結合進行花椰菜品種的區分。

4 小結

我國是花椰菜種植面積最大且種質資源最為豐富的國家。隨著市場對于花椰菜的需求與日俱增，不法分子制售偽劣種子等違法行為愈加猖獗，在很大程度上限制了花椰菜種業的發展。因此，利用分子標記技術構建花椰菜指紋圖譜，進行花椰菜品種鑒定刻不容緩。本文對于當前常用的幾種分子標記技術在花椰菜上的應用研究進行了概述，綜合比較結果表明SSR 技術優勢明顯，具有一定的應用前景與推廣價值。但隨著分子生物學的快速發展，DNA 分子標記技術仍需要與更多的研究及新技術結合加以完善。為了提高花椰菜品種鑒定效率，利用高通量測序技術開發更多微衛星標記，構建花椰菜DNA 指紋圖譜數據庫。同時將花椰菜DNA 指紋數據錄入到互聯網中，并且實時補充新的指紋數據，完善花椰菜指紋圖譜，進行不同實驗室之間的數據共享，從而實現快速鑒定花椰菜品種的目的。不僅如此，健全關于花椰菜品種鑒定的行業標準迫在眉睫，還應建立規范化種子生產指標，從源頭治理種子偽劣問題，加大種子執法力度，確?；ㄒ水a業健康可持續發展。