直投式乳酸菌發酵蘋果汁飲料工藝優化

宋 曦，王 菲，王應強

（隴東學院農林科技學院，甘肅慶陽 745000）

慶陽位于甘肅省東部，是我國蘋果優質產區之一，已形成規?；a、銷售模式，晝夜溫差大，日照時間長，因此慶陽蘋果各類營養素含量較高[1-4]。隨著蘋果種植業的發展，目前慶陽市已經形成了“龍頭企業＋合作社＋農戶”的生產模式，但蘋果采后以簡單貯藏為主，缺乏大型商業化冷庫，影響蘋果的貯藏期，產品損耗較大[5]。慶陽蘋果銷售以鮮果為主，非商品果主要加工成果汁，產品單一，且不同品種蘋果加工果汁品質難以控制，酸度不夠，導致其市場競爭力較弱，所以開發新的蘋果加工產品，對提高果農種植收益，豐富蘋果加工品非常重要[5-6]。

乳酸菌作為益生菌，目前在發酵果汁飲料的開發中應用較多，通過乳酸菌發酵可以提高果汁酸度，增加果汁中功能因子含量，提高果汁營養價值和商品價值[7-8]。直投式乳酸菌是一類不需要活化、增殖，是可以直接投入生產中使用的產品，具有安全性高、活菌數量多等優點，能夠縮短發酵生產周期，同時產生益生因子，提高機體免疫力，調整腸道微生態等，直投式乳酸菌在發酵泡菜中應用較廣，在發酵蘋果汁中應用較少[9-12]。慶陽作為蘋果產區，開發直投式乳酸菌發酵蘋果汁產品，可以豐富蘋果加工產品種類，增加果農收入，提高農產品的商業價值，為當地的經濟社會發展做出貢獻。本試驗利用Design-Expert 軟件進行了Box-Behnken 響應面試驗設計，優選出最適的直投式乳酸菌發酵蘋果汁飲料的工藝條件，為生產發酵型蘋果汁提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蘋果汁，果汁濃度100%，經銷商為鎮江泛亞進出口貿易有限公司；乳酸菌種YO-MIX883 LYO，法國丹尼克斯。

乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、水蘇糖、棉籽糖、牛皮膠原蛋白（含量99%）、玉米低聚肽、大豆分離蛋白、乳清蛋白粉，均為食品級，山東齊魯生物科技公司生產。

1.1.2 儀器與設備

電子天平，200706880，美國雙杰兄弟有限公司；立式全溫振蕩培養箱，ZQPL-200，天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；酸度計，PHS-25，上海越平科學儀器有限公司；手持糖度計，OKW-15，山東恒安電子科技有限公司；冷藏冷凍箱，BCD-206STPH，青島海爾股份有限公司。

1.2 方法

將100 mL 蘋果汁加入200 mL 經滅菌的玻璃酸奶瓶中，添加不同的無菌碳源、氮源，在超凈工作臺上接種直投式乳酸菌發酵劑后，放置于恒溫培養箱中發酵，最終得到發酵蘋果汁飲料。

1.3 單因素試驗

1.3.1 果汁濃度對發酵蘋果汁飲料的影響

將原蘋果汁濃度設置成15%、25%、35%、45%、55%、65%的水溶液，接種0.3%直投式乳酸菌，37 ℃發酵24 h，測定pH 值，根據感官評分選出最適蘋果果汁濃度。

1.3.2 碳源對發酵蘋果汁的影響

將乳糖、葡萄糖、水蘇糖、棉籽糖、蔗糖、結晶果糖按照10%的比例分別加入35%的蘋果汁中，接種0.3%乳酸菌，37 ℃發酵24 h，考察不同碳源對發酵蘋果汁品質的影響，測定果汁pH 值，根據感官評分篩選乳酸菌發酵的最適碳源。

1.3.3 氮源對發酵蘋果汁的影響

將牛皮膠原蛋白、天然玉米低聚肽、大豆分離蛋白、乳清蛋白粉按照6%的比例分別加入濃度為35%的蘋果汁中，添加10%的葡萄糖，接種0.3%的乳酸菌，37 ℃發酵24 h，測定果汁pH 值，根據感官評分篩選乳酸菌發酵最適氮源。

1.3.4 碳源添加量對發酵果汁的影響

將乳酸菌發酵最適碳源分別按照8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%添加到發酵果汁中，接種0.3%的乳酸菌，37 ℃發酵24 h，根據感官評價確定最適的碳源添加量。

1.3.5 氮源添加量對發酵果汁的影響

將乳酸菌發酵最適氮源分別按照5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%添加到發酵蘋果汁中，接種0.3%乳酸菌，37 ℃發酵24 h，根據感官評價確定最適氮源添加量。

1.4 響應面優化工藝試驗

根據單因素試驗結果，利用Design-expert 8.0.6 分析軟件進行Box-Behnken 響應面試驗設計，以感官評價值（Y）為響應值，分別選取果汁濃度、碳源添加量、氮源添加量3 個因素，設計三因素三水平響應面試驗，試驗因素水平表見表1（見下頁）。

表1 Box-Behnken 試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.5 測定指標與方法

1.5.1 還原糖含量測定

參照GB 5009.7—2016 測定食品中還原糖含量[14]。

1.5.2 果汁pH 值測定

1.5.3 感官評定

邀請8 名工作人員對乳酸菌發酵蘋果汁進行感官評價，考察指標為組織形態、香味、滋味、色澤，滿分100 分，具體評分標準如表2 所示[15]。

表2 發酵蘋果汁感官評分標準Table 2 Sensory standards for apple juice

1.6 數據處理

用Origin 8.0 作圖，采用Design-expert 8.0.6 軟件對響應面試驗數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 果汁濃度對發酵蘋果汁品質的影響

由表3 可知，隨著蘋果汁濃度升高，發酵蘋果汁酸度也逐漸增大，當果汁濃度達到65%時，發酵蘋果汁pH 值為4.1，主要原因是果汁中營養成分越多，乳酸菌的生長越快，產乳酸量越多，所以酸度越大，酸的強度與其果汁的含量有顯著的關系[16]。

中國營養保健食品協會發布的數據顯示，當前我國特殊食品（包括保健食品、嬰幼兒配方乳粉、特殊醫學用途配方食品以及嬰幼兒輔食等）年產值約6000億元，并保持持續增長態勢。

表3 不同蘋果汁濃度對發酵蘋果汁感官評價的影響Table 3 Sensory evaluation of fermented juice with different juice concentration

感官評價結果顯示，發酵蘋果汁的質地、色澤和口感都會隨果汁濃度的變化而變化。隨著果汁濃度的增大，感官評價得分先增加后降低。當蘋果汁濃度為15%、25%時，果汁含量低，發酵果汁雖然質地透亮，但色澤較淡，不具有典型的蘋果香氣。當果汁濃度為35%時，發酵蘋果汁的感官評分最高，為80.25。當果汁濃度為45%、55%時，制得的產品有沁人心脾的蘋果香味，但發酵風味不顯著，且存在沉積物，口感略微酸澀，果汁濃度大提高了生產成本。因此，在保證口感俱佳的前提下，選擇35%的蘋果汁濃度進行后續試驗。

2.1.2 碳源對發酵蘋果汁品質的影響

碳源是微生物的6 大營養物質之一，乳酸菌可以通過糖發酵產生乳酸，但不同的糖利用程度不同。從表4 可以看出，與其他糖類相比，直投式乳酸菌在蘋果汁中對碳源的利用率從大到小依次為葡萄糖、棉籽糖、乳糖、蔗糖、果糖、水蘇糖，可以看出當碳源為葡萄糖時，發酵蘋果汁的感官評分最高，其滋味和香味更容易被人接受。因此選用葡萄糖作為碳源。

表4 碳源對發酵蘋果汁的影響Table 4 Effects of carbon source on fermented apple juice

2.1.3 氮源對發酵蘋果汁品質的影響

添加不同氮源發酵蘋果汁，結果表明添加乳清蛋白粉發酵蘋果汁酸度最大，可以達到4.43，變化最為明顯。在相同的發酵條件下，采用乳清蛋白粉進行發酵的蘋果汁具有更好的香味和滋味，感官評價得分見表5。

表5 不同氮源對發酵蘋果汁品質的影響Table 5 Effect of different nitrogen sources on the quality of fermented apple juice

乳酸菌可以通過將不同氮源分解形成低分子的寡肽以適應其自身的生長需求。結果表明，添加氮源有利于促進乳酸菌的生長和風味成分的產生，從而使產品感官質量更好[17]。乳清蛋白粉經過乳酸菌發酵后可產生大量的功能性多肽，具有抑制血管緊張轉化酶活性、抗氧化等功能[18]。由表5 可知，添加乳清蛋白粉發酵的蘋果汁感官評分最高，具有乳香味，更容易被人們接受。因此，氮源選擇乳清蛋白粉。

2.1.4 碳源添加量對發酵果汁品質的影響

由表6 可知，隨著葡萄糖添加量的增加，發酵蘋果汁的感官評分先增大后減小，當添加量為12%時，發酵蘋果汁感官評分最高，為82.63 分。微生物繁殖過程中，不同碳源對果汁的發酵風味有一定影響。感官評價結果表明乳酸菌發酵蘋果汁中以葡萄糖為碳源，添加量低時果汁發酵風味較差，口感酸澀，添加量過高果汁過甜，酸度不夠。因此，將葡萄糖添加量設置為12%。

表6 碳源添加量對發酵果汁品質影響Table 6 Effect of carbon source addition on the quality of fermented apple juice

2.1.5 氮源添加量對發酵果汁品質影響

乳清蛋白粉可作為食品營養強化劑，本身具有獨特的牛乳香氣，控制其添加量，可為發酵果汁提供新的風味。由表7 可以看出，隨著乳清蛋白粉含量的增加，發酵蘋果汁感官評得分逐漸降低。當乳清蛋白粉添加量少時，發酵香味較好，這是由于果汁中的氮源適宜，有利于乳酸菌繁殖，發酵產品品質較好。當乳清蛋白粉的含量增加時，發酵果汁色澤明顯加深，果汁更加濃稠，同時乳清蛋白粉本身具有獨有的風味，會影響果汁整體的風味，而乳清蛋白粉添加量低于5.0%時，果汁色澤較淡，酸度較低，整體風味不足，所以乳清蛋白粉添加量設置為5.0%。

表7 氮源添加量對發酵果汁品質影響Table 7 Effect of nitrogen source addition on the quality of fermented juice

2.2 響應面回歸模型的建立與分析

2.2.1 響應面試驗設計與結果

選取蘋果汁濃度（A）、氮源添加量（B）、碳源添加量（C）三個因素，以感官評價得分為響應值，設計3 因素3水平響應面試驗，結果見表8（見下頁）。

表8 響應面Box-Behnken 試驗設計及結果Table 8 Design and results of response surface Box-Behnken test

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對所得數據進行回歸分析，感官評價得分（y）對自變量果汁濃度（A）、氮源添加量（B）、碳源添加量（C）建立回歸模型，得到的方程為y=80.12+2.40A-0.29B+0.89C-0.020AB-0.15AC-0.006BC+0.038A2-1.16B2-0.87C2。

回歸模型方程方差分析結果見表9。

由表9 可知，響應面試驗設計擬合模型呈極顯著水平（P＜0.01），且失擬項不顯著（P＞0.05），說明回歸方程預測響應值有較好的擬合度，試驗設計準確可靠，可以用此模型分析和預測乳酸菌發酵蘋果汁的工藝。在響應值為感官評價結果的模型中，A（蘋果汁濃度）、B（氮源添加量）、C（碳源添加量）及B2、C2的交互作用對蘋果汁的感官評價有顯著的影響，AB、AC、BC 和A2對其影響不顯著。因此，影響蘋果發酵汁感官質量的主要因素依次是蘋果汁濃度、碳源添加量、氮源添加量。

表9 響應面試驗方差分析表Table 9 The results of variance analysis

2.2.2 因素交互作用分析

由圖1 響應曲面圖可以直觀地看出，蘋果汁濃度和氮源添加量有較為明顯的坡度，且等高線圖呈橢圓形，交互作用顯著，果汁濃度和碳源添加量之間交互作用較為顯著，氮源添加量和碳源添加量對果汁口感影響顯著。

圖1 各因素交互作用對感官評價的響應面圖Fig.1 Response surface diagram of the interaction of factors on sensory evaluation

2.2.3 驗證試驗

響應面試驗結果得出：發酵蘋果汁最佳工藝條件為乳酸菌接種量0.3%、果汁濃度35%、氮源5.18%、碳源12.42%、發酵溫度37 ℃、發酵時間24 h，感官評價可達到86.32。為便于試驗操作，將最佳工藝參數調整為接種量0.3%、果汁濃度35%、氮源5%、碳源12.5%、發酵溫度37℃、發酵時間24 h，經過試驗感官評價后得到86.96。通過與驗證試驗結果比較，說明最終試驗結果與該回歸模型擬合度良好。因此，采用響應面分析法優化得到的乳酸菌發酵蘋果汁條件具有較高的精準度和可靠性。

3 結論

本研究主要是以蘋果汁為原料，對發酵蘋果汁的條件進行優化，單因素試驗得出：當果汁濃度為35%時，發酵果汁口感色澤俱佳；在果汁中添加5%葡萄糖，此時蘋果汁色澤呈現原果汁光亮，有原蘋果汁香氣，口感酸甜可口；添加12%乳清蛋白粉，果汁有乳清蛋白粉獨特的風味，使得蘋果汁口感多元化。響應面試驗中根據方差分析可以得出對乳酸菌發酵蘋果汁的影響因素主次為果汁濃度、碳源添加量、氮源添加量。通過Box-Behnken優化試驗，得出直投式乳酸菌發酵蘋果汁的最佳工藝條件是乳酸菌接種量為0.3%、果汁濃度35%、5%乳清蛋白粉、12.5%葡萄糖，37 ℃發酵24 h，經過驗證試驗感官評價后得到86.96 分。