杏鮑菇副產物多糖超聲提取工藝優化及其體外抗氧化活性研究

李 泉，潘少香，張青青，王文昌，劉雪梅*，李苗苗

（1.中華全國供銷合作總社濟南果品研究所，山東濟南 250220；2.山東農業工程學院，山東濟南 250100）

杏鮑菇，因兼具杏仁和鮑魚的風味而得名，質厚爽口，脆嫩鮮美，是高蛋白低脂肪的食藥兩用健康食用菌。杏鮑菇產業規模僅次于金針菇，是全國第二大工業化生產食用菌品種，我國年生產總量接近160 萬t，其中70%以上是工業化生產的杏鮑菇[1]。杏鮑菇副產物中富含糖類、含氮物質、礦物質等各種營養物質，重金屬含量遠低于國家安全標準的限量要求[2]，目前未見關于其存在食品安全問題的報道。

杏鮑菇在生產加工過程中產生的副產物較多，在工廠化栽培中產生的副產物約占成品菇產量的24%[3]，深加工產品種類少，商品的附加值較低。杏鮑菇副產物的直接廢棄，造成了極大的資源浪費和環境污染，亟待研究其綜合利用技術。已有研究將杏鮑菇副產物的生物活性物質提取再利用，作為食品原料加工制成面點產品、飲品、休閑食品，還能與肉類、面粉等原料進行搭配混合，研制出更有營養價值的復合制品，市場發展未來可期[4-6]。

杏鮑菇中富含食用菌多糖，占其總糖的50.29%[7]，具有降血糖[8]、降血脂[9-10]、免疫調節[11-12]、抗氧化[13]、抗病毒[14-15]等多種活性功能，是一種國內外公認的重要生物活性成分。目前植物多糖的提取方法有水浴提取法、酶法、亞臨界法和超聲提取法，傳統多糖提取方法以熱水提取法為主，提取時間長、效率低[16]。超聲提取法利用超聲波產生的空化作用和熱效應，提高多糖溶解速度的同時，可有效保持生物活性。本研究采用超聲輔助法提取杏鮑菇副產物中的多糖，優化提取工藝并對其體外抗氧化性做初步分析，以期為杏鮑菇副產物的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料

本試驗所用杏鮑菇副產物鮮品，包括菌腳、邊角料和幼菇，來自于山東恒發食用菌有限公司。

1.2 試劑

無水乙醇，天津市富宇精細化工有限公司；葡萄糖，天津市致遠化學試劑有限公司；結晶蒸餾抽提液、抗壞血酸，天津市科密歐化學試劑有限公司；硫酸，煙臺遠東精細化工有限公司；以上試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

高速多功能粉碎機，SZ-500B，浙江銳騰食品機器有限公司；1P 空氣能熱泵柜式烘干機，DH-15HC 型，山東大琨能源科技有限公司；分析天平，MS304S，深圳市君達時代儀器有限公司；超聲波清洗器，KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司；醫用離心機，Centrifuge-V，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱，DHG-9202·0型，上海三發科學儀器有限公司；渦旋混合器，REAX-2000，海道尓夫儀器設備（上海）有限公司；紫外可見分光光度計，TU-1810，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 杏鮑菇副產物的預處理

取杏鮑菇鮮品的副產物包括菌腳、邊角料和幼菇三類，分別切片后平鋪于托盤上，放到熱泵烘干機中55 ℃恒溫烘干，用高速粉碎機粉碎成粉末后，過40 目篩，收集過篩粉末，備用。

1.4.2 超聲法提取多糖

稱取1.000 0 g 杏鮑菇副產物粉于離心管中，加適量的去離子水混合均勻，在500 W 功率下超聲萃取一定時間，離心后取上清液與4 倍體積的無水乙醇混合，放入4 ℃冷藏醇沉，12 h 后取出，離心后將沉淀轉移到烘干至恒質量的濾紙上，50 ℃真空恒溫干燥得到杏鮑菇副產物粗多糖粉末。

1.4.3 超聲法提取杏鮑菇副產物多糖工藝參數優化

（1）單因素試驗

固定超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃，料液比1∶20（g/mL），改變其中一個因素進行單因素試驗。料液比設置為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），超聲溫度設置為30、40、50、60、70 ℃，在超聲時間設置為10、20、30、40、50 min 進行超聲提取、醇沉、復溶，測其吸光度值，進行3 次平行試驗，以粗多糖含量為評價指標。

（2）響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken 試驗設計原理[17]，設置料液比（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）為響應面因子，以杏鮑菇副產物多糖含量為響應值，設計三因素三水平響應面分析試驗，對杏鮑菇副產物多糖超聲提取條件參數進行優化。響應面因子和水平見表1。

表1 響應面因子和水平表Table 1 Factors and levels and response surface

1.4.4 杏鮑菇副產物多糖含量的測定

（1）葡萄糖標準曲線的繪制

分別精密移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 標準葡萄糖工作液（100 μg/mL）于10 mL 具塞試管中，加去離子水至1.0 mL 搖勻，加入1.00 mL 5%苯酚、5.00 mL 濃硫酸，充分混合后反應40 min，測定反應液在490 nm 的吸光度值。以葡萄糖質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。葡萄糖的標準曲線為y=0.004 1x-0.005 2（R2=0.999 1）。

（2）多糖含量的測定

將醇沉得到的烘干并冷卻的杏鮑菇副產物粗多糖粉末轉移至燒杯中，加一定量去離子水，經超聲充分溶解后，定容于100 mL 容量瓶中，取上清液5.00 mL 定容至25 mL，搖勻后取2.00 mL 置于10 mL 具塞試管中，向其中加1.00 mL 5%苯酚、5.00 mL 濃硫酸，混合均勻后反應40 min，在490 nm 處測其吸光度值，空白試樣加入2.00 mL 去離子水置于10 mL 具塞試管中，其余同樣品操作。將測得的吸光度值代入標準曲線公式中計算杏鮑菇副產物中粗多糖質量濃度，單位以百分含量表示，多糖含量根據公式（1）計算。

式中，m1為從標準曲線上查得多糖提取液中的含糖量，μg；V1為多糖提取液定容體積，mL；V2為比色測定時所移取多糖提取液的體積，mL；m2為提取得到的杏鮑菇副產物粗多糖量，g；0.9 為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數；m為杏鮑菇副產物粉稱樣量，g。

1.4.5 粗多糖體外抗氧化活性研究

將提取得到的杏鮑菇副產物多糖粉末復溶后，配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的多糖溶液，分別移取4 mL于具塞刻度試管中，再向其中加入配制好的0.2 mmol/L的DPPH 溶液4.00 mL，充分混合后放入暗環境中反應30 min，經過離心后取上清液在517 nm 處測定反應溶液的吸光度值，記作A1，另取一只具塞試管加入4.00 mL 無水乙醇和4.00 mL 去離子水作為空白調零試樣。陽性對照組是將1 mg/mL 維生素C 溶液配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的溶液，其余處理步驟同杏鮑菇副產物粗多糖相同，測其吸光度A2?？瞻讓φ占尤?.00 mL 去離子水和4.00 mL DPPH 溶液，其余處理步驟同杏鮑菇副產物粗多糖相同，測其吸光度A0。杏鮑菇副產物中粗多糖對DPPH 清除率按式（2）計算。

式中，A0為空白對照的吸光度值；Ai為不同質量濃度的樣液吸光度值，i=1,2，A1為杏鮑菇多糖吸光度值，A2為維生素C 的吸光度值。

1.5 數據處理

數據采用DPS 9.0 軟件處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對杏鮑菇副產物提取多糖含量的影響

由圖1 可知，隨著料液比的提高，杏鮑菇副產物多糖含量先增加后減少，在料液比為1∶20（g/mL）時達到峰值，為26.90%，與其他水平間均存在顯著性差異（P＜0.05），1∶25、1∶30 之間無顯著性差異（P＞0.05），1∶15、1∶35 之間也無顯著性差異（P＞0.05）。說明在一定范圍內增加溶劑體積能夠有效促進杏鮑菇副產物中水溶性多糖的溶出，從而使得含量增加，但隨著溶劑比例的繼續增大，由于滲透壓的改變[18]，其他水溶性成分也會一同溶出，從而降低多糖含量。同時液料比過大，后續沉淀消耗的乙醇量也會增加，造成浪費，也會增加多糖的損失，因此選擇1∶20（g/mL）為最佳料液比。

圖1 料液比對杏鮑菇副產物多糖含量的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the content of polysaccharide in by-products of P. eryngii

2.1.2 超聲溫度對杏鮑菇副產物提取多糖含量的影響

由圖2 可知，隨著超聲溫度增加時，杏鮑菇副產物多糖含量先增加后減小，當超聲溫度為60 ℃時，達到最大值，此時多糖含量為24.07%，與其他水平間均存在顯著性差異（P＜0.05），50 ℃和70 ℃之間無顯著性差異（P＞0.05），30 ℃、40 ℃之間也無顯著性差異（P＞0.05）。分析其原因可能是隨著溫度的升高，細胞中的分子運動加快，使得多糖浸出量增加，但如果萃取溫度過高，可能引起多糖的分子結構被破壞，降低其萃取效率[19]。所以最佳超聲溫度為60 ℃。

圖2 超聲溫度對杏鮑菇副產物多糖含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the content of polysaccharide by-products of P. eryngii

2.1.3 超聲時間對杏鮑菇副產物提取多糖含量的影響

由圖3 可知，隨著超聲時間的延長，杏鮑菇副產物多糖提取含量也總體呈現先升高后下降的趨勢，當超聲時間為30 min 時，其最大含量為25.45%，與其他水平間均出現了顯著性差異（P＜0.05）；當超聲時間為50 min 時，出現了第二個峰值，其多糖含量為23.18%。分析原因是在一定范圍內增加超聲時間，能夠有效破壞杏鮑菇細胞壁，利于多糖溶解在提取液中。在超聲時間為40 min 時，杏鮑菇副產物中多糖的含量降低主要是因為超聲的機械作用引起的。在超聲時間為50 min 時發現多糖含量再次升高，這可能是在長時間超聲作用下，導致杏鮑菇細胞中的其他長鏈物質分解為短鏈物質，從而提高了杏鮑菇副產物多糖的提取含量[20]。所以選定超聲時間為30 min 為最佳工藝參數。

圖3 超聲時間對杏鮑菇副產物多糖含量的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on the content of polysaccharide in by-products of P. eryngii

2.2 響應面優化杏鮑菇多糖超聲提取工藝參數結果

2.2.1 響應模型的建立與分析

為明確超聲輔助提取杏鮑菇下腳料多糖工藝的最佳參數，基于單因素試驗結果，采用Box-Behnken 的設計方法，響應面優化杏鮑菇多糖超聲提取工藝參數結果如表2（見下頁）所示，對17個實驗點進行回歸模型擬合，得到杏鮑菇下腳料多糖含量相關料液比（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）的回歸模型方程為：杏鮑菇下腳料多糖含量（%）=28.60-0.50A-0.78B-0.090C+1.43AB-1.82AC-0.16BC-2.50A2-2.36B2-5.49C2。

表2 響應面結果Table 2 Response surface results

該公式的二次項系數都是負值，由此說明有最大值，可以進行最優解的求解。通過一次項系數的絕對值大小，可以推測出三種因素對多糖提取含量的影響程度，其中超聲溫度對杏鮑菇副產物多糖含量的影響最大，其次是料液比，超聲時間影響較小。

2.2.2 響應模型的方差分析

由表3 可得，模型的F=116.99，其對應的P值＜0.000 1，說明模型的差異非常顯著，具有統計學意義。失擬項P=0.553 1＞0.05，意味著失擬項相對于純誤差并不顯著，無失擬項因子存在。R2=0.993 4（＞0.8），這表明所建立的模型具有很好的擬合性，且誤差較小，與實際情況比較相符，可以用此回歸公式來代替實測值。校正決定系數R2Adj為0.984 9（＞0.80）和變異系數（CV）為1.92%，表示此模型可說明98.49%的變化，因此能夠做出準確的預測。

由表3 可看出，超聲溫度、料液比對杏鮑菇副產物中的多糖含量有明顯的影響。通過對不同因子F、P值的分析，發現不同因素對杏鮑菇副產物多糖含量的影響由大到小的順序為超聲處理溫度、料液比、超聲處理時間。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.2.3 響應面交互作用分析

根據回歸方程建立響應面曲線，結果如圖4 所示。通過等高線圖和3D 圖可以分析響應面所選取的三個響應面因子兩兩之間對杏鮑菇副產物多糖含量的交互影響。從圖4 可以看出，料液比和超聲溫度、料液比和超聲時間以及超聲溫度和超聲時間的等高線圖是橢圓形的，表明各響應面因素兩兩之間彼此均有相互作用，結合響應面的傾斜程度和方差分析結果，發現料液比和超聲處理溫度、料液比和超聲處理時間對杏鮑菇副產物多糖含量有顯著的交互作用。

圖4 各因素間對多糖含量影響的等高線圖和3D 圖Fig.4 Contour map and 3D map of the effect of various factors on polysaccharide content

2.2.4 響應面優化

通過軟件分析，模擬出超聲提取杏鮑菇副產物多糖的最佳工藝條件參數為：料液比1∶20（g/mL），超聲提取溫度57.82 ℃，超聲提取時間30.24 min，杏鮑菇副產物多糖含量的預測值為28.73%，為保證實驗的可操作性，超聲最佳提取溫度設為58℃，超聲最佳提取時間設為30min。在此條件下進行3 次驗證試驗，得到實際多糖含量為29.06%，和預測值接近，說明該模型可用于擬合分析杏鮑菇副產物多糖提取工藝且效果較好，具有一定的應用價值。

2.3 杏鮑菇副產物多糖體外抗氧化活性研究

由圖5 可看出，杏鮑菇副產物粗多糖質量濃度為1.0 mg/mL 時清除能力最強，與0.2、0.4、0.6 mg/mL 間均存在顯著性差異（P＜0.05），略高于0.8 mg/mL 的杏鮑菇副產物多糖的清除率。維生素C 在0.6、0.8、1.0 mg/mL 的質量濃度的清除率無顯著性差異（P＞0.05），但與0.2、0.4 mg/mL 之間存在顯著性差異（P＜0.05）。在杏鮑菇副產物粗多糖提取液的濃度為0.2～0.8 mg/mL 時，杏鮑菇副產物中粗多糖對DPPH 的清除效果與多糖質量濃度成正線性相關（R2=0.955 9）。當粗多糖含量大于0.8 mg/mL時，對DPPH 自由基的抑制效果逐步穩定下來，在杏鮑菇副產物粗多糖提取液的濃度達到1.0 mg/mL 時，對自由基清除率可達56.96%。以維生素C 作為陽性對照，發現在杏鮑菇副產物粗多糖提取液的質量濃度為0.6 mg/mL時，對DPPH 自由基的抑制作用可達到維生素C 清除效果的53.93%。通過回歸擬合，推測杏鮑菇副產物中的粗多糖對DPPH 的清除能力的IC50為0.700 mg/mL。

3 結論

杏鮑菇素有“平菇王”之稱，其營養價值極高，富含杏鮑菇多糖等活性物質，可進行保鮮加工，是一種廣受歡迎的食用菌。杏鮑菇下腳料中含有較高含量的杏鮑菇多糖，具有抗氧化、殺菌、抗病毒等多種功能。本論文采用超聲輔助提取法從杏鮑菇下腳料中提取粗多糖，通過單因素與響應面試驗優化設計，得到粗多糖提取的最佳工藝參數為料液比1∶20（g/mL），超聲溫度58 ℃，超聲功率500 W，超聲時間30 min，在此條件下，從杏鮑菇下腳料中提取的粗多糖含量達到29.06%。所提取的杏鮑菇粗多糖對DPPH 自由基的抑制作用的IC50為0.700 mg/mL，進一步證實了杏鮑菇下腳料中的多糖具有一定的抗氧化活性，為杏鮑菇可食副產物的后續處理及綜合利用奠定理論基礎。