主要糧食作物基于SPAD的氮素營養診斷方法研究進展

王 磊，盧艷麗，白由路

（農業農村部植物營養與肥料重點實驗室/中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081）

在發現植物葉片葉綠素濃度與氮濃度高度相關之后，從20世紀70年代開始就研發非破壞性的能夠估算植物葉片葉綠素濃度的儀器[1]。日本漁業和農業部與美能達公司聯合啟動土壤植物分析(soil and plant analysis development，簡稱 SPAD)項目，研發了一種商業化的手持式儀器(SPD-501和SPAD-502)。它測量端能夠夾住葉片進行讀數，能夠存儲30個讀數并得到平均值。它是利用葉綠素在可見光波段(660 nm)強吸收和近紅外波段(940 nm)強反射特性得到兩個波段的透射光比值，從而得到葉片葉綠素相對含量，也常被稱為葉綠素計。目前國內外常用的是SPAD-502葉綠素計。眾所周知，SPAD是利用植物體內葉綠素含量與氮素營養的密切相關關系來進行氮素營養診斷的，因此從上世紀80年代以來，研究人員利用SPAD-502開展了大量的有關植物氮營養狀況的研究。本文就基于SPAD的作物氮素營養診斷研究進展作一綜述。

1 SPAD值與葉片葉綠素濃度的關系

盡管植物葉片葉綠素濃度與SPAD值的關系受到植物種類[2]、葉齡[3]、取樣位置[4]、生長環境[5]等因素的影響，但是二者之間存在的顯著關系已被科學家研究證實，只是這種關系有線性關系和非線性關系之分。在22種植物葉片SPAD值與葉綠素濃度關系的研究中發現二者存在顯著的線性相關關系(R2=0.48)[6]；同樣在6個玉米雜交種上按時間序列采集了大量的SPAD數據，分析發現葉綠素濃度與SPAD值存在單因素線性回歸關系(R2= 0.83)[7]。有報道稱在美國阿拉巴馬州3個研究基地的牛毛草葉綠素濃度和SPAD值存在線性關系，且決定系數達到0.96[8]。但在研究玉米、小麥、水稻、煙草和大豆葉子的SPAD值與葉綠素濃度的關系中發現，二者呈現一元二次方程關系(R2=0.89)[9]，這個關系覆蓋了整個葉綠素水平；也有人認為當葉綠素濃度較高(>60)時二者存在著非線性關系 [葉綠素濃度=a+b (SPAD)2，R2=0.97]；當葉綠素濃度處于20～60時，二者間存在很好的線性關系[10]。另外在茶樹[11]、馬鈴薯[12]和其他一些樹種[13]上還發現二者呈指數關系。雖然眾多研究都表明了單因素回歸方程能準確地描述葉綠素濃度與SPAD值之間的定量關系，但是也有研究發現二者相關關系在同一物種或者品種范圍內更好。例如，在8個熱帶和亞熱帶樹種上發現，葉綠素濃度和SPAD值間分別存在8個獨立的線性回歸關系(R2=0.91～0.96)與不同樹種分別對應[14]。同樣在不同葡萄品種間也有類似發現[15]。由此可見，模擬SPAD值與葉片葉綠素濃度時應充分考慮植物種類、葉齡、葉片厚度、含水量等因素，對所建立的關系應有精確的前提條件。

2 SPAD值與植株氮濃度的關系

開發SPAD葉綠素計最初的目的是估算水稻的氮素營養狀況，用于更準確地為水稻氮肥管理決策服務。但如何更好地利用SPAD葉綠素計在其他作物上進行氮肥高效管理，已有大量的嘗試。研究表明SPAD值與植物葉片氮濃度密切相關[16–21]。但就針對具體作物來講，其定量關系表現不一。

研究發現，與葉綠素濃度與SPAD值的關系一樣，不同栽培品種間的葉片氮濃度與SPAD值的關系需用單一或者獨立的回歸方程來描述，這一結果在 21 個熱帶玉米品種[4]、8 個玉米雜交種[8, 16, 22]、蘋果[19]以及4個基因型牛尾草[20]上都得到了證實。玉米試驗表明，缺氮情況下其葉片氮濃度與SPAD值通常呈線性關系[23–24]。玉米生長期間8月份穗位葉葉片SPAD值分別與單位質量氮濃度和單位面積氮濃度均表現出較強的線性關系，決定系數分別為0.84和0.92[23]；兩年試驗表明，7月和8月兩次取樣的葉片氮濃度和SPAD值二者的線性回歸系數是不同的，并且發現，利用多元回歸分析的方法，采用播種后天數得到多元回歸關系能夠解釋二者回歸系數84%的變異性[24]。但也有研究表明葉片氮濃度與SPAD值呈非線性關系，例如Dwyer等[7]發現二次方程+線性平臺回歸方程能反映玉米3個生育期期間葉片氮濃度與SPAD值的響應關系，不同時期的響應方程系數有所不一，但是它們的決定系數都達到了0.88。除二次方程+線性平臺關系外，二者還呈現曲線關系[25]，但這種關系因取樣時期和年份不同而改變。當玉米葉片氮濃度過高時，它與SPAD值的關系呈漸近線性關系[7,16]，這一結果表明葉綠素計不能用于估算過量氮條件下的玉米和其他作物葉片氮濃度。

綜上，SPAD可以用于準確(R2>0.85)預測多種作物葉片的葉綠素和氮濃度。單一回歸方程能夠預測葉片氮濃度在多種作物上得到了證實；而也有其他研究表明，每個品種或物種需要單獨建立回歸方程。通常情況下SPAD值與葉綠素或氮濃度的關系是線性的，但也有曲線關系現象的發生。當氮素的供應超過了最高產量需要量時，葉片氮濃度可能無法預測，因為葉片氮濃度持續增加，但SPAD值趨于平穩。

3 不同作物葉片SPAD值及其氮素管理

3.1 玉米葉片SPAD值及其氮素管理

由于玉米葉片大而寬，易被SPAD-葉綠素計測定。因此，SPAD-葉綠素計在玉米氮素營養診斷和施肥方面的應用研究較多。如Piekielek等研究表明，在玉米6葉階段(V6)，第5片展開葉SPAD值能夠判斷是否需要追肥，其判斷結果與根據土壤測試的判斷結果一致[26]；該階段玉米葉片的SPAD值預測氮肥反應的正確率達到80%[27]。但也有研究表明玉米V6到V8階段葉片的SPAD值并不能作為追施氮肥的準確指標[28]。大量研究表明，玉米氮肥與SPAD值的關系均受玉米品種、生育期、生長環境條件的影響[23, 27, 29–33]。雖然 Sunderman 等[31]利用多年玉米氮肥試驗對雜交玉米葉片氮與SPAD值關系的研究最為深入(2年45個玉米雜交品種試驗發現，葉片SPAD值在V6和V10生育期階段品種間有顯著差異，在R1和R6階段品種間沒有顯著差異)，認為不同區域、不同試驗、不同品種玉米葉片氮與SPAD值之間的關系有很多相似之處，但這些關系的適用范圍過于寬泛，無法精確估計。

隨著研究的進一步深入，科學家提出“相對SPAD值”或者“氮飽和指數”(通過在田間設一高施氮量小區，將不同氮營養水平的作物葉片SPAD 值與高氮區SPAD值相比得到)。利用該值作為氮素營養診斷指標，該指標可不受品種、區域、取樣時期的影響[27]，且與植株氮素含量、氮營養指數、產量和最優施氮量的相關性高于絕對SPAD值[34–36]，可有效地指導玉米施肥[27–30, 33, 37–38]。將氮飽和指數等于 0.95 (或95%)作為評估作物氮素水平的一個臨界值，當氮飽和指數小于0.95時，作物缺氮，需要追施氮肥[39]，否則導致玉米減產[37,40]。美國賓夕法尼亞州的一項研究表明[38]，使用相對SPAD值可以對玉米V6到V8階段追施氮肥做出最準確的估算，該階段如果獲得平均相對的SPAD值超過0.95，建議不追施氮肥；如果該讀數小于或等于0.95，那么需要考慮多方面因素，包括產量潛力、葉片數量、對照區SPAD值以及過去使用的有機肥等，對氮肥施用量做出推薦。趙士誠等[41]也發現在保證相對SPAD值在0.95～0.98范圍內的玉米氮肥用量比農民常規氮肥用量減少42%，在產量不降低的情況下，氮肥利用率得到顯著提高。

早期研究表明，SPAD值可以預測灌溉施肥(氮肥)時期，但對于準確的施肥量并不確定[22]。研究人員發現隨著作物生育期的推進，SPAD對氮素狀態判斷的準確度也越高[23,30,33,37]，即能依據施肥時期得出確切的施肥量[24,28,29,32,42]。尤其在玉米生長后期，比如在玉米灌漿前期果穗葉的SPAD值能夠區分缺氮區和富氮區，這種判別準確度能達到93%[30]。而從乳熟期到蠟熟期相對SPAD值可以將氮響應區從氮非響應區分離，準確率達92%[33]，并且灌漿前期相對SPAD值與氮素響應區的產量密切相關。

就玉米葉片測定位置而言，有學者提出在接近玉米葉片中部的位置，SPAD 值測定結果偏差最小，且在40%～70% 區域內測定值變異系數較低[21]。但SPAD用來指示氮營養狀態時也存在其弊端，即當施氮量超出經濟最佳產量需求量時，SPAD值并不隨著施氮量的增加而增加；因此，當施氮量超出經濟最佳產量需氮量時，SPAD值并不是一個很好的指標[30, 43]。

3.2 小麥葉片SPAD值及其氮素管理

研究發現，不同小麥品種同一生育期同位葉片絕對SPAD值最大差異可達10個單位[44]；即使是同一品種不同葉位SPAD值與全氮含量的關系表現也不一致[45]。有研究得出冬小麥葉片SPAD 值與氮素水平隨葉位的空間分布特征，頂3 葉與頂2 葉SPAD值分別與葉片的平均含氮量和氮素累積量相關性最好[46]。但早期也有研究表明，孕穗期SPAD值建立的氮素估算模型最可靠[47]。綜上可見，基于絕對SPAD值對作物營養診斷和氮肥管理，因品種、葉位、生育期、年份和區域產生諸多差異和不一致[44–49]?；诖?，科學家們也同樣引入了“歸一化SPAD值”(即“相對SPAD值”和“氮飽和指數”)。研究發現，冬小麥在起身后拔節前葉片歸一化SPAD值、氮素吸收量及干物質積累量建立的多元回歸方程(R2=0.81)可以作為判定達到最高產量是否需要追施氮肥的依據[17, 50–51]。并且已建立了基于葉片 SPAD 值的滴灌春小麥氮肥分期施用推薦模型[52]。

近年來氮營養指數 (nitrogen nutrition index，縮寫NNI)這一指標被廣泛應用于作物氮營養診斷[53]。有研究表明，氮營養指數在作物當季估算產量、氮肥需要量以及氮肥利用效率等方面具有明顯潛力[54–59]。因此，氮營養指數與葉片SPAD值以及冠層光譜關系的研究愈來愈多，該方法提供給科學家一種無損、實時和有價值的信息，利用氮營養指數在較大尺度上估算作物氮狀況、產量和品質[60–62]。

Debaeke等[63]用小麥頂1葉歸一化SPAD 值與NNI 建立關系，以消除環境的影響，結果比較穩定。利用旗葉和倒2葉歸一化SPAD值與冬小麥氮營養指數在開花期呈現顯著指數關系(R2=0.89)，說明在該生育期可以利用歸一化SPAD值代替氮營養指數表征冬小麥氮素營養狀況[60]。也有人系統分析了小麥上部4張單葉不同葉位的SPAD值和歸一化SPAD指數(NDSPADij)與氮營養指數(NNI)的定量關系，結果表明，小麥單葉SPAD 值與NNI 的關系呈顯著正相關，但這種關系在品種或年份之間不穩定，對小麥氮素診斷存在風險；除NDSPAD12外，NDSPADij與NNI 之間呈顯著負相關，且NDSPAD14與NNI 之間在年份和品種之間表現最穩定，能夠較好地定量估算氮營養指數[64]。也有研究表明，倒2葉與旗葉的SPAD差值能與NNI建立顯著對數關系，并且在6個小麥品種上得到驗證[65]。Ravier等研究表明，利用歸一化SPAD 值能夠消除冬小麥生物量、品種和年份間帶來的影響，且對NNI預測保持較高的準確度。缺點是不能消除生育期的影響；另外對于施氮條件下的植株缺氮情況，其預測準確度相對較低[66]。

綜上所述，利用歸一化SPAD開展冬小麥氮素營養診斷是目前較為認可的方法，并且與氮營養指數建立了較為穩定的關系模型；但在具體利用葉片的位置上存在研究差異，還需要進一步深入探討。

3.3 水稻葉片SPAD值及其氮素管理

科學家們業已證實水稻產量與關鍵生育期的葉片SPAD值或者氮濃度存在顯著相關關系[67–72]。較為引人注意的研究是，葉片SPAD值與不同方法表示的氮含量之間的關系。結果表明，單位葉面積表示的氮含量(N g/m2)優于單位葉重量表示的氮含量(N g/kg)與SPAD值的相關性[73–75]。同時發現如果水稻葉片含氮量以葉面積為基礎來表示，利用SPAD/SLW(特定葉片重量)對SPAD值進行校正，則可消除葉片厚度或質量對SPAD讀數的影響[68,73]。但是也有研究發現這兩種表示方法得到的葉片氮濃度與SPAD值的線性相關系數差異不顯著[76]。

SPAD雖然可以便捷、無損地診斷水稻氮素營養狀況，但其估測精確度受水稻品種、生長時期、測定葉位和生長環境等因素的影響[77–79]。葉位是作物研究中最容易精準定位的目標之一，因此科學家們測定不同葉位SPAD，主要集中在頂部四片葉，將其差值或比值作為診斷指標[80]。研究發現，水稻上葉片SPAD 值對氮素的敏感性順序為頂4 葉、頂3 葉和頂2 葉，而頂1 葉的敏感性排序因品種不同而不同；穗分化期、齊穗期和成熟期均以頂3 葉與總葉片及植株含氮量相關系數最高；且適宜氮素水平下，穗分化期頂3 葉SPAD 值的變異系數最小。以某一特定葉片的SPAD 值或以葉色差的大小來診斷水稻氮素營養狀況和推薦水稻穗肥施用時，頂3 葉是較為理想的指示葉或參照葉[81]。有研究認為頂4葉與頂3葉間的SPAD差值診斷氮素營養狀況時，該指標不受施肥條件和生長時期的影響[79,82–83]。但也有人發現不同生育期應選擇不同葉片作為氮素診斷的理想指示葉[75]。

同樣，研究人員為消除品種、生育期及管理措施的影響，發展了歸一化SPAD指數、均值SPAD指數和差值SPAD指數等。利用標準化的SPAD值對最高產量推薦施氮量比預設施氮量減少N 30～40 kg/hm2[84]。篩選出水稻第4片完全展開葉的NSI4(歸一化SPAD指數)為參數，建立了水稻拔節期至孕穗期的植株氮累積量和氮營養指數診斷模型[85]。也有人指出分蘗成穗期頂葉SPAD值[86]、頂三葉SPAD均值[87]是反映水稻氮素水平的最佳測量指標；同時分蘗成穗期頂葉SPAD值與產量關系密切[86]。

雖然科研人員在關于不同形式SPAD指標與氮營養的關系方面做了大量研究，但利用這種關系建立的模型來指導施肥尤其在氮素追肥方面還不成熟。有研究發現，水稻幼穗分化前后10天，葉片SPAD值可以用來判定是否需要追施氮肥。當讀數超過40，追施氮肥對產量沒有貢獻[67,88]。這就啟示研究人員需要對SPAD閾值有一個定義，用作追施氮肥的依據和前提[89]。利用水稻葉片SPAD閾值變化實時變量施肥得到了較好效果，例如當葉片SPAD值為35時，水稻需要補充氮肥[73, 90]。又有當葉片SPAD值為36時，需要追肥N 35～25 kg/hm2，與常規追肥相比，能節省肥料20%～35%，且維持產量不減，從而提高氮肥利用率[91]。

3.4 SPAD在其他作物氮素管理上的研究

利用SPAD-502估算氮素營養狀態在棉花、黃瓜、油菜等作物上也開展了嘗試研究。早在1992年就有發現，棉花葉片氮濃度與SPAD值呈曲線關系，但這種關系因生育期和年份不同而改變[92]。通過研究棉花主莖頂部4片葉SPAD值對氮素營養水平的敏感程度發現，倒4葉相對穩定，用于氮素營養診斷較為理想[93–95]。進一步研究發現倒1葉和倒4葉構建的葉位差指數(PDI)診斷棉花氮素營養狀況最為可靠，不受生育期和土壤養分狀況影響[96]。另外研究發現，葉片的觀測位點對SPAD值的穩定性及其與氮含量的相關性至關重要，認為靠近棉花功能葉葉緣的位點適宜作為測試區域[97]。

黃瓜的試驗證明幼苗期和開花期的第3葉、結果期的第7 葉對氮素響應最敏感，可作為黃瓜氮素缺乏診斷的最佳部位[98]。胡靜等[99]利用葉綠素計探討了黃瓜葉片上SPAD 值的空間分布及氮素診斷的位點選擇，結果表明葉片各位點的SPAD 值與葉片含氮量均存在顯著的相關關系。選擇離葉尖部相對距離20% 與葉邊緣之間的葉尖頂三角區域作為黃瓜氮素診斷的最佳位點。還有研究得出黃瓜氮營養指數和產量與SPAD的關系隨著生育期的推移逐漸加強，能夠預測其最大生長量和產量的SPAD值為45.2±0.7[100]。

李嵐濤等[101]研究了應用SPAD值診斷油菜氮素營養狀況的最佳測試葉位及位點，發現主莖頂4片完全展開葉中部SPAD值與葉綠素含量、葉片氮含量和植株全氮含量之間相關性顯著，滿足氮素快速診斷的要求。

4 問題和建議

通過上述大量資料表明，葉綠素計與作物氮素營養及產量方面的關系研究較多，但是利用其在田間開展氮素施肥的實踐還相對較少，或者結果不令人滿意。究其原因，作者認為主要有以下幾點：其一，沒有建立基于SPAD的作物營養診斷和推薦施肥技術規范，包括，1)不同作物間的測試技術規范；2)不同作物間的氮素豐缺指標、施肥體系等。正如前文所述，不同作物(或物種)間差異較大；不同葉位的SPAD值因生育期不同而變化很大；同一葉片測定位點的選擇，葉尖、葉中、葉柄的SPAD值與植株氮含量的相關性均存在差異。其二，SPAD值及其衍生量的篩選。比如，相對SPAD值或歸一化SPAD值都是為數據穩定性和可比性而衍生出來的。其三，模型的穩定性和普適性。其四，與葉綠素合成有關的其他營養元素(鉀、鎂、鐵、錳等)的缺乏或者元素間交互作用與SPAD的響應關系。

眾所周知，利用葉綠素計對作物氮含量的估算或者診斷是第一步，如何根據SPAD對氮含量的估算和診斷進行氮肥精準管理是研究者的最終目的。因此，針對以上存在問題，研究要對測量目標精準定位，明確不同作物不同生育期選取的葉片層位；同時篩選適宜的SPAD值或其衍生參數，建立穩定估算模型；并且需要大量的、多年的、多個品種間的數據來支撐，否則數據的精度和可靠性無法保證。筆者認為，利用葉綠素計開展氮素營養診斷還需解決的問題主要有以下幾方面：1)基于SPAD的不同作物氮素營養診斷的技術規范。包括不同作物不同生育期測定葉位的精準定位以及葉片的測定位點等。2)確定基于葉片SPAD值作物氮營養豐缺指標。3)建立基于葉片SPAD值的作物施肥模型。4)開發基于SPAD的施肥決策支持系統。5)開展鉀、鎂、鐵、錳等與葉綠素合成有關的其他營養元素與SPAD值的關系研究，擴充和豐富基于SPAD的作物營養診斷技術和方法。

需要指出的是，田間養分精準管理是極具技術性和經驗性相結合的復雜工程，不同營養元素的植物有效性受土壤類型、pH、溫度、降雨、微生物種類等多種因素的影響，即使實驗室土壤植株養分的準確測定也只能在 4R (right source, right rate, right time, right place)之一施肥量 (right rate)的確定給予建議，在施肥時間(right time)和施肥位置(right place)上不能指導田間施肥。SPAD是科技進步的產物，它在研究逐步成熟和正確應用條件下，能夠判斷作物營養元素尤其氮素的豐缺，為作物生長發育中期追肥提供實時決策，較實驗室的化驗分析效率提高數十倍，可以說為實現正確施肥時間(right time)提供一種較好的技術手段。所以田間養分精準管理需要多技術、多方法、多手段相結合才能實現理想的養分精準管理。但正如前文所說，SPAD的成熟應用和發展還需要多年、多點、多試驗的數據驗證和完善。