基于網絡藥理學方法研究“黃芪-人參”藥對治療胃癌的作用機制*

郭凱凱，趙藝蔓，陳曉宇，凌慧，李洲強，郭東霖，張穎，侯恩存

廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011

胃癌作為一種常見的惡性腫瘤，其致死率在全球所有惡性腫瘤中居第二位［1］。有研究表明胃癌的演變過程主要分為5個階段，分別是慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生、胃腺癌［2］。胃癌的治療方式包括手術、放療、化療等，雖然一定程度上能夠延長患者生命，但研究發現治療后患者會出現消化道出血、惡心嘔吐、厭食等一系列并發癥，嚴重影響患者生活質量［3］。

胃癌屬中醫學“胃脘痛”“積聚”“癥瘕”等范疇［4］?！端貑枴みz篇·刺法論篇》載：“正氣存內，邪不可干?！闭龤馓撊跏俏赴┌l生的主要因素，臟腑陰陽失衡為胃癌的形成提供了條件［5］。有研究表明化療的同時，配合中醫益氣扶正能有效緩解胃癌患者臨床癥狀，改善患者生活質量，減輕化療毒副作用［6］。有研究表明人參、黃芪中的有效成分能抑制腫瘤增殖，加速胃癌細胞凋亡［7］。

本研究根據網絡藥理學方法構建“藥物-成分-靶點”網絡，探討“黃芪-人參”藥物活性成分、潛在靶點以及作用機制，進一步闡釋“黃芪-人參”藥對治療胃癌的作用機制及其新方法、新思路。

1 材料與方法

1.1 數據庫及軟件中藥系統藥理學分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、人類基因數據庫（the human gene database，GeneCards，https：//www.genecards.org）、比較毒物基因組學數據庫（http：//ctd.mdibl.org/）、蛋白-蛋白相互作用網絡平臺STRING v11.0（https：//string-db.org/）、生物信息注釋數據庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）、Cytoscape 3.2.1軟件（http：//www.cytoscape.org/）。

1.2 “黃芪-人參”有效化合物及作用靶點獲取以TCMSP數據庫為依托，以黃芪、人參為檢索關鍵詞，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和藥物相似性（drug-likeness，DL）的篩選條件（OB≥30%，DL≥0.18）進行篩選，獲取“黃芪-人參”藥對有效化合物及作用靶點。

1.3 胃癌相關靶點搜集利用GeneCards、CTD數據庫，以“Stomach Neoplasms”為檢索詞，檢索胃癌相關靶點。

1.4 “黃芪-人參”治療胃癌潛在靶點預測將藥物預測的靶點與疾病靶點進行映射，生成藥物-化合物-靶點的藥理網絡圖，獲得“黃芪-人參”藥對治療胃癌的潛在靶點，并利用Cytoscape 3.2.1軟件構建“藥物-化合物-靶點”圖。

1.5 蛋白-蛋白相互作用網絡(protein-protein interactions，PPI)構建通過Cytoscape 3.2.1軟件Bisogenet插件構建PPI蛋白互作網絡。利用Cyto NCA插件構建PPI網絡。

1.6 基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）及KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）將獲得的“黃芪-人參”治療胃癌的22個潛在靶點輸入DAVID6.8中，以P＜0.01，FDR＜0.01為篩選條件進行富集分析，對富集分析結果按照P值由小到大排序，并使用Omic Share云平臺繪制成高級氣泡圖。

2 結果

2.1 “黃芪-人參”有效化合物和作用靶點在TCMSP平臺數據庫中，刪除重復后，“黃芪-人參”共有41個化合物，共篩出對應的作用靶點384個。見表1。

表1 “黃芪-人參”藥對化合物信息

2.2 藥物成份-靶點網絡構建將上述41個化合物與384個靶點以Excel文件格式分別定義數據和屬性文件，用Cytoscape 3.2.1軟件得到“黃芪-人參”成分-靶點網絡圖，通過網絡拓撲分析，篩選自由度（degree）靠前的靶點，藍色為顯著富集，黑色為非顯著富集。其中三角形代表藥物分子，圓形代表藥物作用靶點，共得到266個節點，645條邊。見圖1。

圖1 “黃芪-人參”成份-靶點網絡

2.3 疾病靶點篩選通過GeneCards、CTD數據庫以疾病名稱進行檢索，刪除重復項后，在GeneCards、CTD數據庫中共收集到473個疾病靶點，根據推理得分（Inference Score）篩選出前200個疾病靶點，以減少冗雜。

2.4 藥物及胃癌靶點標準化及共有靶點PPI網絡將上述藥物依次上傳至靶點標準化數據庫STRING進行蛋白基因化，得到基因名。并通過Venny 2.1.0與胃癌靶點繪制蛋白韋恩圖，見圖2。成分與疾病共有靶點22個蛋白主要涉及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激 酶1（serine/threonine protein kinase 1，Akt1）、絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen activated protein kinase，MAPK8)、胱天蛋白酶3(Caspase-3，CASP3)、前列腺素內過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTJS2）、胱天蛋白酶9（Caspase-9，CASP9）等。將交集靶點通過Cytoscape 3.2.1軟件繪制得到聯系緊密的PPI網絡圖，見圖3。

圖2 韋恩圖

圖3 蛋白相互作用網絡（PPI）

2.5 GO功能富集及KEGG通路富集分析通過GO富集分析功能得出67個生物過程（biological process，BP），涉及血管平滑肌增殖、凋亡過程、對細胞因子的反應等；8個分子功能(molecular function，MF)，涉及DNA結合、蛋白質同聚活性、染色質結合等；6個細胞組成(cellular component，CC)，涉及原子核、細胞質、內質網膜等。見圖4—6。柱狀圖長度越長則富集基因數目越多、富集越顯著。

圖4 “黃芪-人參”有效作用靶點BP柱狀圖

圖5 “黃芪-人參”有效作用靶點MF柱狀圖

圖6 “黃芪-人參”有效作用靶點CC柱狀圖

通過KEGG通路富集分析得到65條通路，其共同靶點主要富集于病毒致癌、小細胞肺癌等疾病及神經營養蛋白信號通路、TOll受體（TLR）信號通路、TNF等。泡泡節點越大則富集基因數量越多，顏色越紅則富集越顯著。見圖7—8。

圖7 黃芪-人參與胃癌有效作用靶點KEGG富集分析氣泡圖

圖8 KEGG信號通路

3 討論

本研究利用網絡藥理學方法，通過TCMSP數據庫平臺，最終確定了“黃芪-人參”藥對中41個活性成分，384個作用靶點，篩選出“黃芪-人參”藥對中的5個主要有效成分，β-谷甾醇（betasitosterol）、槲 皮 素（quercetin）、山 奈 酚（kaempferol）等。孫玉成等［8］人體內外實驗結果表明，β-谷甾醇具有抗胃癌腫瘤細胞的作用，主要作用機制可能與下調P13K/AKT/m TOR信號通路蛋白表達、誘導SGC-7901細胞發生自噬有關。有研究表明，β-谷甾醇能加速共刺激細胞增殖，進一步增強對胃癌腫瘤細胞的殺傷作用，其機制可能與上調共刺激細胞中孔蛋白(pore-forming protein，PFP)等表達及活化細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號通路相關［9］。耿威等［10］的研究表明，槲皮素能限制胃癌細胞繁殖和攻擊，可能與小窩蛋白1(caveolin-1，Cav-1)表達有關。槲皮素能抑制胃癌MKN-45細胞，細胞的繁殖和增加，并且有可能進一步加速其凋亡，其作用機制可能與調節Caspase-3和Caspase-9活性相關［11］。山奈酚是多種植物的有效組成成分，具有顯著抗癌作用［12］。胃癌細胞內CDK1/Cyclin B激酶復合物、下游G2/M周期相關蛋白的表達在山奈酚的調控下，能加速胃癌細胞凋亡［13］。

通過篩選發現AKT1、MAPK8、CASP3、CASP9、PTJS2、JUN等是“黃芪-人參”在對胃癌患者扶正過程中的主要靶點。在腫瘤細胞生長、繁殖、凋亡的生物過程中，AKT信號通路起一定調控作用，而AKT1信號通路能調控腫瘤細胞繁殖和凋亡，限制AKT1表達，緩解胃癌細胞的多種藥物耐藥性［14］。AKT信號通路主要作用之一是調控衰老細胞，AKT1的表達主要通過miR-30b限制，進而干預干細胞的多能性、畸胎瘤的演變和增殖［15］。MAPK8信號通路和癌癥細胞的形成變化有一定關系，磷酸化腫瘤細胞核內的絲氨酸/蘇氨酸位點能使轉錄活性增強，腫瘤細胞進一步惡化［16］。Mapk8基因是MAPK家族成員中重要的信號通路，其功能涉及細胞增殖、分化、凋亡的各個階段［17］。CASP3、CASP9可直接調控腫瘤細胞凋亡，限制腫瘤細胞繁殖和生長［18］。研究發現胃癌細胞中CASP3表達和腫瘤的臨床癥狀以及預后有關［19］。PTJS2是前列腺素合成的關鍵酶，主要作用是促進產生PGE2等炎癥介質，進而在“黃芪-人參”防治胃癌的過程中起擴張血管作用［20］。C-jun是一種轉錄因子，同時也是促分裂原活化蛋白激酶信號通路的主要成員之一。

從GO分析結果可知，BP主要涉及血管平滑肌增殖、凋亡過程、對細胞因子反應等。從KEGG富集分析可知，涉及的通路有TOll受體信號通路、TNF信號通路、NGF信號通路等信號通路。通路上含有的靶點越多，則通路發揮作用的可能就越大。TOll受體信號通路可通過TLR受體激動劑來調控TLR信號通路，從而提高機體對病原體的免疫力進而達到抑制腫瘤的目的，同時還可通過TLR受體抑制劑調控TLR過表達以及TLR信號轉導，最終達到抑制腫瘤增殖和演變的目的［21］。TNF信號通路在機體內外都能殺傷、抑制腫瘤細胞增殖和形成，TNF-α對機體免疫調控主要是通過加強T細胞的表達而殺傷、抑制腫瘤細胞［22］。此外，富集與此信號通路上的JUN基因，作為重要的原癌基因，能調控細胞生長、分化，并且與多種腫瘤的形成有關。楊雪梅等［23］的研究表明，c-Jun mRNA、c-Jun的表達與炎癥因子TNF-α表達有顯著關聯性，主要通過限制巨噬細胞蛋白激酶信號通路上c-Jun表達而減少TNF-α釋放，進而有效調控炎癥反應和減輕內毒素程度，進一步促進細胞凋亡。神經生長因子（nerve growth factor，NGF）可與靶細胞表面的NGF受體特異性結合而導致生物學效應的產生，并調控神經、血管及腫瘤等多種病理、生理過程，同時NGF還能作為絲裂原促進腫瘤細胞分裂、凋亡，在腫瘤形成與進展過程中起重要作用［24］。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學對“黃芪-人參”藥對治療胃癌的作用機制進行了初步探討，其可能通過抑制血管平滑肌增殖、凋亡過程、細胞因子應答等過程治療胃癌并起扶正作用，但由于網絡藥理學本身所具有的局限性以及忽略中藥成分含量等諸多因素，導致本研究獲得的結果可能存在一定偏差，有待臨床中的進一步驗證和證實。