基于網絡藥理學探討丹參治療血管性癡呆的作用機制*

陳靜，陳煒，唐秀松，伍媛，勞祎林，吳林△

1廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001；2廣西中醫藥大學第一附屬醫院腦病一區

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指由于各種腦血管疾病引起腦損傷，導致不同程度認知功能障礙的疾?。?］。表現為學習和記憶能力減退、運動功能障礙、情緒行為異常等［2-3］。我國人口老齡化呈上升趨勢，老年性癡呆的人數也越來越多，其中VD患者約占老年性癡呆患者的20%［4］。相關文獻報道［5-8］，VD的發病主要與膽堿能系統障礙、氨基酸神經遞質、氧自由基增多、神經細胞凋亡等有關。VD是現階段唯一可逆的癡呆類型疾?。?］。由于VD復雜的發病機制，單純靠西藥治療可能不是很好的解決辦法［10］，中藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點，在防治VD方面發揮獨特優勢［11-12］。何歡等［13］通過中醫傳承輔助平臺軟件分析了155首治療VD的方劑，發現丹參在中藥方中的使用頻率排第3位。董菲等［14］運用關聯規則研究了治療VD的101首方劑，在支持度為20的條件下，丹參-石菖蒲、丹參-黃芪、丹參-川芎、丹參-何首烏藥對的使用頻率較高。李強等［15］在數據挖掘治療VD的方中發現丹參用藥頻率排第3位?？梢?，丹參在VD的治療中出現頻率較高。丹參，別名血參根、大紅袍、紅根，為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhizaBge.）的干燥根和根莖［16］，丹參味苦，微寒，歸心、肝經，具有活血祛瘀、涼血消癰、清心除煩、通經止痛等作用。常用于治療胸痹心痛、脘腹脅痛、熱痹、心煩失眠、痛經等病癥［17-18］。藥理研究報道，丹參具有改善血液循環、抗炎、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化及調節血糖、血脂和血壓等的作用［19-26］。

網絡藥理學是一種基于對“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網絡進行整體分析的新技術，能展示中藥有效成分作用于人體起治療作用的機制［27］。本研究采用該技術探討丹參治療VD的作用機制，以期為丹參的臨床應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 丹參有效成分的檢索和篩選通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），選擇“Herb name”，以“丹參”為關鍵詞搜索其全部有效成分。

1.2 丹參靶點基因獲取在TCMSP中以“丹參”為關鍵詞，選擇“Related Targets”欄，導出結果。并通過Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）查詢其蛋白所對應的基因，用Perl 5.26.3軟件（https：//www.perl.org/get.html）注釋篩選出的靶點基因。

1.3 VD疾病相關基因檢索分別在GeneCards數據庫（https：//genealacart.genecards.org/）、OMIM數 據 庫（https：//www.omim.org/）中 輸 入“Vascular dementia”，檢索VD相關靶點基因，以表格形式下載，export導出結果，去除重復項，最后得到VD疾病基因數據集。

1.4 韋恩圖繪制將得到的丹參有效成分和靶點進行整理，所得數據導入R×64 3.6.2軟件（https：//www.r-project.org/），進行相應腳本運算，得出丹參靶點和VD疾病靶點交集。

1.5 丹參-有效成分-VD-靶點調控網絡構建將丹參靶點和丹參-VD靶點利用Perl軟件進行映射，然后運用Cytoscape 3.7.2軟件（https：//cytoscape.org/）對該網絡進行拓撲計算，得到丹參-成分-VD-靶點調控網絡。

1.6 丹參-VD靶點蛋白相互作用網絡構建與核心基因篩選利用SRRING在線軟件（https：//string-db.org/）將丹參-VD靶點輸入軟件Multiple Proteins列表下的List of Names中，在Organism中選擇homo sapiens，保存結果文件，將所得文件輸入R×64 3.6.2軟件，計算得到蛋白互作網絡核心靶點條圖。

1.7 基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）將丹參-VD靶點利用R×64 3.6.2軟件計算得到GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1 丹參有效成分和靶點共搜索得到202個化合物。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，藥物類藥性（drug likeness，DL）＞0.18為篩選條件［28］得到65個有效成分，根據OB由大到小展示前20位，見表1。

表1 丹參中有效成分和靶點篩選結果（排名前20）

續表1

2.2 韋恩圖丹參-VD交集靶點有86個。其中VD疾病靶點3901個，丹參靶點108個。見圖1。

圖1 丹參有效成份-VD靶點

2.3 丹參-有效成分-VD-靶點調控網絡圖中紅色五邊形代表疾病VD，黃色菱形形代表中藥丹參，紫色V形代表丹參抗VD的有效成分，藍色圓形代表丹參與VD疾病共同靶點，表明丹參主要通過54種有效成分作用于86個靶點，這86個靶點可能影響VD疾病的發生。見圖2。

圖2 丹參-成分-VD-靶點調控網絡

2.4 丹參-VD靶點蛋白相互作用網絡與篩選核心基因丹參-VD核心基因按鄰接節點數目由多到少依次為Akt1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1、EFGR、MYC、JUN、STAT3、CASP3、PTGS2、CCND1、MAPK14、MMP9、RELA、APP、ESR1、PPARG、BCL2L1、IL10等。鄰接節點數目越多，成為核心基因的概率越大，故Akt1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1可能為核心基因。見圖3—4。

圖3 丹參-VD靶點蛋白相互作用網絡

2.5 GO功能富集分析丹參-VD靶點涉及的GO功能共富集到130條生物過程，主要包括G蛋白偶聯胺受體活性、腎上腺素能受體活性、核受體活性、轉錄因子活性，直接配體調節的序列特異性DNA、兒茶酚胺結合等。見圖5—6。

圖4 丹參-VD蛋白互作網絡核心靶點條圖

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

圖6 GO功能富集分析氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析丹參治療VD的核心靶標的KEGG通路富集分析共富集出134條通路與治療VD的功效相關，主要包括卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路、非小細胞肺癌、乙型肝炎病毒通路、IL-17信號通路等。見圖7—10及表2。

表2 KEGG富集分析通路

圖7 KEGG通路富集分析柱狀圖

圖8 IL-17信號通路

圖9 AGE-RAGE信號通路

圖10 HIF-1信號通路

3 討論

中醫無“血管性癡呆”的病名，“癡呆”一詞最先記載于《華佗神醫秘傳·華佗治癡呆神方》，血管性癡呆屬“呆病”“健忘”“文癡”“武癡”“癲狂”等范疇［29-30］。一般將VD的證候分為腎精虧虛、痰濁阻竅、瘀血阻絡、肝陽上亢4種證型［31］。丹參有活血化瘀功效，符合瘀血阻絡病機。前期研究證實［21］，以丹參為君藥的中藥方劑和有效成分能改善微循環缺血再灌注后引起的心、腦功能障礙和器官損傷［32］。

從表1可知，丹參主要有效成分有65個，包括紫丹參萜醚、醛基丹參酮、丹參醌新酮、表丹參螺縮酮內脂、丹參醇B、丹參醇A、紫丹參素C、異隱丹參酮、新隱丹參酮、隱丹參酮等。從圖2可知，丹參治療VD的有效成分是54個，主要有丹參醇B（Danshenol B）、丹參醇A（Danshenol A）、1，2，5，6-四氫丹參酮（1，2，5，6-tetrahydrotanshinone）、多孔甾醇（Poriferasterol）、丹參新醌（danshexinkum d）、丹參酮（tanshinoneⅥ）、異歐前胡素（isoimperatorin）、丹參酮ⅡA（DehydrotanshinoneⅡA）、二乙醇酸鹽（digallate）、木犀草素（luteolin）、醛基丹參酮（formyltanshinone）、紫丹參萜酸A（przewalskin a）、紫丹參萜酸B（przewalskin b）等。

從圖1和圖3的PPI網絡中發現丹參治療VD的核心靶點主要是Akt1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1等。Akt（又稱PKB，protein kinase，PKB/Akt）是一種與蛋白激酶C相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［33］。Akt是磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信號傳導通路中一個關鍵的下游靶激酶，G蛋白偶聯受體、蛋白酪氨酸激酶受體和Ras蛋白可激活PI3K［34-35］。PI3K/Akt信號通路對神經細胞凋亡、增殖、分化及腦血管舒縮功能起重要作用，在VD防治中PI3K/Akt信號通路是一個熱點通路［36-39］。白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）是一種嗜神經細胞因子，主要調控免疫和炎癥反應［40］。血清IL-6表達水平與VD的嚴重性相關［41］。研究證實，炎癥因子IL-6和動脈粥樣硬化的致炎進程有關，它可損傷血管，加快動脈粥樣硬化發生發展，加重腦血管病變、神經細胞凋亡，患者最后出現認知功能減退等癡呆癥狀［42-43］。丹參酮ⅡA有抗凋亡作用，可降低IL-6水平［44-45］。FOS，別名AP-1，C-FOS，p55。C-FOS基因是一種原癌基因［46］，在細胞生產調節和胞內信號傳遞分泌中發揮關鍵作用，減少C-FOS入核可阻礙炎性因子轉錄與蛋白合成，最后減輕炎癥程度［47］。丹參提取物和丹參化學成分可下調C-FOS表達水平［48］。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）參與很多血管生成依賴性疾?。òX血管?。┑陌l生發展［49］。隱丹酮能夠調控VEGF，調控Src/FAK和ERK1/2信號途徑，抑制VEGF誘導的血管 生 成［50］。絲 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是一組能被不同細胞因子、神經遞質、激素、細胞應激及細胞黏附等激活的具有調節細胞生長、增殖、趨化作用的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶［51］。MAPK是促進炎癥反應的重要信號分子。MAPK1又稱p38 MAPK，是MAP激酶家族的一個成員［52］，p38 MAPK抑制劑能夠保護VD大鼠海馬區功能損傷［53］。

GO功能富集分析發現，丹參治療VD的基因功能主要調節G蛋白偶聯胺受體活性、腎上腺素能受體活性、核受體活性、轉錄因子活性，直接配體調節的序列特異性DNA、兒茶酚胺結合、類固醇激素受體、神經遞質受體活性、酰胺結合等。

KEGG通路富集分析發現，丹參治療VD通路主要有信號通路、癌癥通路、代謝通路、感染通路等。其中信號通路有白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）信號通路、AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等。IL-17歸于CD4+效應性T細胞，與人體細胞結合會使IL-17水平明顯升高，并且IL-17能誘導基質細胞，產生TNF和IL-6等，最終導致炎性細胞浸潤［54-55］。研究證實，VD患者IL-17水平高于健康人群，說明白細胞介素在VD起病早期可作為診斷依據之一，提前切斷其發生發展［56］。血清中晚期糖基化終末產物（advanced glycosylation end products，AGEs）和β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）可能是VD患者和急性腦梗死患者發病的危險因素，推斷它們參加腦血管損傷，引起腦梗死，最后發生VD。AGEs與PC12細胞神經毒性損害和RAGE誘導NF-κB表達密切相關。VD患者血清AGEs升高，并和簡易智力狀態檢查量表（Mini-mental state examination，MMSE）評分呈負相關［57］。低氧誘導因子1α（HIF-1α）是低氧反應的調控因子，可以調控下游靶基因發揮腦組織保護作用［58］。其中HIF-1α激動劑能保護VD患者的神經［59］。丹參中的隱丹參酮可以下調HIF-1α表達水平［60］。

綜上所述，丹參抗VD的主要有效成分有丹參醇、1，2，5，6-四氫丹參酮、多孔甾醇、丹參新醌、丹參酮Ⅵ、丹參酮ⅡA、木犀草素等54個有效成分。丹參通過Akt1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1等核心靶點調控130條生物學過程和134條KEGG通路，說明丹參是通過多成分、多靶點和多途徑調控VD。該研究可為VD的治療提供思路，為丹參的臨床及實驗研究提供一定的理論依據。