桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的網絡藥理學研究

敖菲，李海英

陜西中醫藥大學第一附屬醫院中醫婦科，陜西 咸陽 712000

盆腔炎性疾?。╬elvic inflammatory disease，PID）是婦科常見病、多發病，多見于月經期婦女，是由于感染引起的女性上生殖道炎癥，臨床以腹痛為主要表現，短期可誘發輸卵管、卵巢和盆腔膿腫，長期可誘發異位妊娠、不孕和慢性盆腔疼痛［1-2］。目前抗生素是治療盆腔炎的主要藥物［3］。研究發現，早期盆腔炎使用抗生素可基本痊愈，但慢性盆腔炎應用抗生素治療具有明顯局限性［4］。隨著臨床研究的不斷深入，人們發現抗生素聯合桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎療效顯著［5-11］。

桂枝茯苓膠囊是目前臨床應用較為廣泛的中藥制劑，始載于《金匱要略》，由桂枝、桃仁、牡丹皮、白芍、茯苓組成，方中以桂枝為君，桃仁為臣，牡丹皮、白芍、茯苓為佐，具有活血化瘀、緩消癥結的功效［12］，臨床被廣泛用于治療盆腔炎性疾病。研究發現桂枝茯苓膠囊可緩解盆腔炎性疾病引起的下腹疼痛，縮小盆腔炎性包塊等癥狀、體征［13-16］。然而桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的主要活性成分和作用機制研究仍面臨諸多挑戰。

網絡藥理學方法是基于系統生物學理論構建藥物-靶點-疾病相互作用網絡，分析藥物在各網絡模塊中與特定節點間的相互作用，從系統性、整體性角度探究藥物與潛在靶點間的作用關系的方法［17-18］。本研究以網絡藥理學方法為切入點，探討桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的有效活性成分及作用靶點，揭示其分子作用機制，對桂枝茯苓膠囊科學內涵的闡釋及臨床推廣具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 桂枝茯苓膠囊化學成分篩選運用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）探索桂枝茯苓膠囊中各單味藥化學成分，根據研究結果，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Druglikeness，DL）≥0.18為限制條件進行篩選，得到桂枝茯苓膠囊的生物活性成分。

1.2 化學成分對應靶點庫和盆腔炎相關靶點庫構建通過TCMSP數據庫檢索桂枝茯苓膠囊中各單味藥化學成分靶點，將其靶點與Uniprot數據庫中各靶點人類基因簡稱進行查詢，獲得桂枝茯苓膠囊可能存在的靶點；使用人類基因綜合數據庫GeneCards（https：//www.genecards.org）以“Pelvin Inflammatory”為檢索詞，獲得盆腔炎相關靶基因。

1.3 藥物-疾病交集靶基因及藥物-化學成分-靶點-疾病網絡構建在R中安裝VennDiagram包，獲得桂枝、桃仁、白芍、茯苓、牡丹皮活性成分與盆腔炎相關靶點的韋恩圖和交集基因。使用Cytoscape 3.7.2構建藥物-化學成分-靶點-疾病網絡。

1.4 靶蛋白相互作用網絡構建及關鍵靶點篩選將藥物-疾病交集靶點基因導入String（https：//string-db.org）進行相互作用蛋白查詢并構建蛋白質互作網絡（protein-protein interaction networks，PPI），物種設置為“人（Homo sapiens）”，最低相互作用評分設置為中等置信度“medium confidence（0.400）”，設置隱藏不連接的節點，其余參數保持默認設置，得到桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的靶蛋白網絡。運用Perl腳本篩選出PPI網絡中的關鍵靶蛋白。

1.5 基因本體論富集分析（gene ontology,GO）和京都基因與基因組百科全書GO與KEGG（kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG）通路富集分析主要用于注釋基因功能，包括細胞功能、分子功能和生物功能，已被廣泛應用于生物基因功能分類。運用基因本體數據庫Bioconductor對桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的靶基因進行GO和KEGG通路富集分析，研究桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的主要生物過程和代謝通路。

2 結果

2.1 桂枝茯苓膠囊活性成分及靶點通過TCMSP數據庫，共篩選出桂枝茯苓膠囊有效成分69個，其中桂枝7個，白芍13個，茯苓15個，桃仁23個，牡丹皮11個。69個有效成分對應4364個相關靶基因。通過Uniprot對靶點和基因信息標準化并去重最終獲得靶基因177個。見附表1。

2.2 盆腔炎相關靶點在Genecards數據庫獲得4253個盆腔炎相關基因。

2.3 藥物-疾病靶點將桂枝茯苓膠囊177個作用靶點與4253個盆腔炎靶點基因進行韋恩分析，獲得藥物-疾病交集基因136個，見圖1。

圖1 桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎靶點韋恩圖

2.4 藥物-化學成分-靶點-疾病”網絡借助Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-化學成分-靶點-疾病”網絡，共有171個節點（化合物35個，靶點136個），見圖2。

圖2 桂枝茯苓膠囊-化學成分-靶點-盆腔炎網絡

2.5 PPI網絡分析及核心基因篩選將136個藥物-疾病交集靶點通過String數據庫進行PPI網絡分析，運用Perl腳本統計蛋白相互作用節點，將連接節點前30位基因進行可視化，由圖可知，桂枝茯苓膠囊主要通過調控靶基因v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1，Akt1），白細胞介素6（interleukin 6，IL-6），血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA），胱天蛋白酶3（recombinant Caspase 3，CASP3），JUN原癌基因（jun proto-oncogene，JUN），髓細胞組織增生病毒癌基因（myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog，MYC），表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），前列腺素內過氧化物合成酶2（prosta-glandin-endoperoxide synthase2，PTGS2），雌激素受 體1基因（estrogen receptor1，ESR1），促分裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1），促分裂原活化蛋白激酶8（mitogenactivated protein kinase 8，MAPK8），白細胞介素1B（interleukin 1B，IL1B），基質金屬肽酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9），周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1），FOS基因（fos protooncogene，FOS），熱休克蛋白90Daα（heat shock protein 90kDa alpha，HSP90AA1），趨化因子（C-C基元）配 體2（chemokine（C-C motif）ligand 2 CCL2），基質金屬肽酶2（matrix metallopeptidase 2，MMP2），過氧化氫酶（catalase，CAT），白血病病毒癌基因同源物2（erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2，ERBB2），人V-Rel網狀內皮增生病毒癌基因同源物A（human V-Rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA），雄激素受體（androgen receptor，AR），細胞間黏附因子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1），胱 天 蛋 白 酶8（recombinant caspase 8，CASP8），一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3），過氧化物酶體增生激活受體γ（peroxisome proliferative activated receptor，gamma，PPARG），絲氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子，進化枝E（微管連接蛋白，纖溶酶原激活因子抑制因子型1），成員1（serpin peptidase inhibitor，clade E（nexin，plasminogen activator inhibitor type 1），member 1，SERPINE1），BCL2樣1（BCL2-like 1，BCL2L1），血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）抑制盆腔炎的發生發展。見圖3。

圖3 桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎核心基因

2.6 GO功能分析通過Bioconductor數據庫對桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的136個靶基因進行GO富集分析。結果顯示桂枝茯苓膠囊主要與脂多糖、細菌來源分子、金屬離子、抗生素、活性氧、類固醇激素等結合。細胞定位結果顯示桂枝茯苓膠囊主要集中在包膜、細胞質囊泡、核染色質等方面。見圖4—5。

圖4 桂枝茯苓膠囊-盆腔炎靶點的GO富集分析“生物學功能”（前20）

分子功能結果顯示桂枝茯苓膠囊主要通過調控DNA結合轉錄因子激活、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子特異性、泛素樣蛋白連接酶結合、激酶調節活性、核受體活性、RNA聚合酶轉錄因子結合、類固醇受體活性、氧化還原酶活性、組蛋白激酶活性影響疾病進程。見圖6。

圖6 桂枝茯苓膠囊-盆腔炎靶點的GO富集分析“分子生物學功能”（前20）

2.7 KEGG通路富集分析通過Bioconductor數據庫對桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的136個靶基因進行KEGG富集分析，篩選出158條信號通路，選取前20條信號通路，可以看出，桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的靶點主要參與AGE-RAGE糖尿病并發癥、前列腺癌、動脈粥樣硬化、皰疹病毒感染、乙型肝炎、丙型肝炎、TNF信號、IL-17等信號通路。見圖7。

圖7 桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎通路信息柱狀圖

2.8 基因-通路”網絡構建借助Cytoscape 3.7.2軟件將桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的136個靶基因及前20條通路進行可視化處理，構建“基因-通路”網絡，網絡中共有171個節點（靶點136個，通路20個），其中度值表示連接到1個節點的線條數，用來評估網絡中每個節點的重要性。節點越大表明度值越大。見表2，圖8。

圖8 桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎關鍵靶點參與的通路富集信息

表2 桂枝茯苓膠囊活性成份治療盆腔炎通路基本信息（前20條）

圖5 桂枝茯苓膠囊-盆腔炎靶點的GO富集分析“細胞學組分”（前20）

3 討論

本研究采用網絡藥理學方法構建桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的“藥物-化合物-作用靶點-疾病”網絡，得到35個活性成分，136個靶基因，158條信號通路。主要涉及靶基因Akt1、IL-6、VEGFA、CASP3、Jun、MYC、EGFR、EGF、PTGS2、ESR1、MAPK1、MAPK8、IL-1，IL-1B、MMP9、FOS等。GO富集和KEGG通路富集結果提示，AGE-RAGE糖尿病并發癥信號通路、前列腺癌通路、動脈粥樣硬化通路、皰疹病毒感染通路、乙型肝炎通路、丙型肝炎通路、TNF信號通路、IL-17信號通路可能與桂枝茯苓膠囊干預盆腔炎的作用機制一致。其中，AGE-RAGE主要通過誘發氧化應激作用于下游JNK、ERK1/2、Akt以調控炎性因子釋放。TNF信號通路主要通過作用于下游JNK、ERK干預炎性因子釋放。IL-17信號通路主要通過調控下游MAPK誘發炎性因子釋放。乙型肝炎、丙型肝炎主要通過PI3K/Akt和細胞凋亡途徑誘發細胞損傷?？梢?，PI3K/Akt、MAPK信號通路廣泛分布于各種細胞且在桂枝茯苓膠囊干預盆腔炎的過程中起關鍵作用。桂枝茯苓膠囊可通過激活PI3K/Akt、MAPK信號通路抑制盆腔組織炎性因子及凋亡因子釋放。LI等［19］發現Akt、MAPK、1L-1β及IL-6在盆腔炎中高表達，提示Akt、MAPK誘發的炎癥反應途徑是盆腔炎的重要發病機制。研究發現Caspase-3在盆腔炎患者中高表達［20-21］，提示細胞凋亡是盆腔炎的重要發病機制。

綜上所述，盆腔炎是以結構和功能改變為特征的多因素疾病，越來越多的研究證實中藥治療盆腔炎的有效性。探究中藥治療盆腔炎的作用靶點及作用機制對于盆腔炎的防治至關重要。本研究通過生物信息學和網絡藥理學方法對桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的主要生物活性成分及其藥理作用機制進行了分析，證實桂枝茯苓膠囊可能主要通過PI3K/Akt及MAPK信號通路抑制氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡，從而減輕盆腔炎。