miR169/NFYA模塊響應植物非生物脅迫的研究進展

季潔韻 李強 曾幼玲

（1.新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830017；2.新疆農業科學院經濟作物研究所，烏魯木齊 830091）

遺傳信息與外部環境共同影響生物體的生長，而植物作為一種固著生物受到外界環境的影響較大，已進化出系列機制應對非生物脅迫［1］，包括脅迫傳感、信號傳導、基因表達、轉錄加工及翻譯后的蛋白修飾。這些反應會通過減少植物活性氧（ROS）水平、提高細胞膜系統穩定性等過程增強植物對非生物脅迫的耐受性［2］。

microRNA 是一種20-24 nt 的非編碼RNA。一般情況下，植物miRNA 通過剪切信使RNA（messenger RNA，mRNA）或者抑制翻譯負調控靶基因的表達。隨著測序技術與分子手段的發展，在多種植物中已鑒定了大量miRNA 并明確了其靶基因的作用。植物中很多miRNA 靶基因編碼的蛋白是與啟動子結合調控下游基因轉錄活性的轉錄因子［3］。miRNA/轉錄因子模塊在植物多種生理過程中發揮作用。miR156/SPL 模塊是調控植物從營養生長到生殖生長轉變的關鍵因子。SPL，SQUAMOSA 啟動子結合類蛋白，與花發育基因的啟動子特異結合，影響植物的頂芽、花序發育以及開花時間。幼苗期miR156 轉錄水平較高，導致SPL表達較低，隨著植物的生長，miR156轉錄水平逐漸降低，使得SPL 轉錄因子積累，這樣SPL 又會促進其下游miR172 的轉錄，從而抑制miR172 靶向的APETALA2（AP2）類轉錄因子的表達，使植物從幼苗轉為成苗［4-6］。蘋果miR156/SPL模塊通過激活WRKY100的表達調控植物的耐鹽性［7］；miR171 及其靶向的轉錄因子SCARECROWLIKE（SCL）通過整合抗壞血酸途徑增強蘋果的耐旱性［8］。

1 植物miR169 對NFYA 的調控作用

在單子葉和雙子葉植物中共鑒定到400 多個miR169 家族成員［9］，其成熟體序列較為保守。鷹嘴豆（Cicer arietinum）中鑒定了13 個miR169 成員，其序列一致性達到84.25%，個別成員序列完全一致［10］。葡萄（Vitis vinifera）中鑒定出25 個成員，其成熟體約一半的堿基完全一致，僅3′和5′端1-2 個堿基保守性較差［11］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）miR169 家族分為4 個亞族，為miR169a、miR169b/c、miR169d/e/f/g 及miR169h/i/j/k/l/m/n［12］。

核因子Y（nuclear factor Y，NF-Y）又稱CCAAT 結合因子（CCAAT-binding factor，CBF），是由3 個進化相對保守的亞基NFYA、NFYB、NFYC 組成。NFYA 家族有2 個核心結構域，分別為在N 端與NFYB 和NFYC 互作的結構域，以及在C 端識別并結合DNA 位點的結構域［13］。NFYB 與NFYC 形成二聚體尋找CCAAT-box，繼而招募NFYA 形成三聚體插入DNA 雙螺旋的小溝，使DNA 雙螺旋保持松弛狀態，從而更有利地募集RNA 聚合酶或其他轉錄因子［14］，對其下游基因進行調控。目前，在多種真核生物中均有NF-Y 家族成員。擬南芥NFYA、NFYB 和NFYC 家族的成員分別有10（可分為3 組，第1 組：NFYA3/4/5/6/7/8，第2 組：NFYA1/9，第3 組：NFYA2/10）、13 和13 個，推測可形成1 690 種三聚體組合［15］。CCAAT-box 存在于25%以上的真核生物基因組中［16］，暗示NF-Y 家族通過結合CCAATbox 廣泛調節下游基因的表達，參與植物多種生理過程。

miR169 家族最主要的靶基因是NFYA 家族成員。葡萄miR169 基因家族共預測22 個靶基因，其中，有21 個屬于NFYA 家族［11］；油菜（Brassica napus）miR169 家族的16 個靶基因中，12 個屬于NFYA 家族［17］。與多數植物miRNA 作用相似，miR169 家族的調控方式多為轉錄后水平切割mRNA，使其降解。大部分NFYA 家族的3′UTR 區域有一段可以與miR169 互補的保守序列（不同物種中的序列有差異），擬南芥NFYA 家族成員中大多數具有這段保守序列［15］；玉米（Zea mays）14 個NFYA 成員中，有8 個可以被miR169 靶向切割［18］。在大豆（Glycine max）［19］、日本杏（Prunus mume）［20］、水稻（Oryza sativa）［21］等物種中也均有報道通過RLM-RACE 技術確定miR169 家族對靶基因3′UTR 區域的切割位點。miR169 也會在翻譯水平上影響靶基因的表達。擬南芥miR169i/l 的二級結構在11 nt 和16 nt 處堿基錯配造成的凸起，改變了AGO 蛋白的分選，導致沒有降低靶基因AtNFYA5的轉錄豐度，反而增加了其蛋白水平［22］。miR169 對其靶基因調控方式呈現多樣性。miR169/NFYA 模塊就像一個開關，啟動或關閉下游基因的表達，以滿足植物應對逆境和生長發育階段變化的生理需求。因此，研究miR169/NFYA模塊的作用具有重要的理論與實際意義。

2 miR169/NFYA 模塊在非生物脅迫中發揮作用

miR169/NFYA 模塊響應鹽、旱、高溫、低溫等非生物脅迫。油菜miR169 家族啟動子中含有干旱誘導元件MYB、逆境脅迫響應元件TC-rich、脫落酸（abscisic acid，ABA）響應元件ABRE 等［17］。擬南芥［23］和玉米幼苗［18，24］暴露于干旱脅迫、鹽脅迫及外源激素ABA 時，miR169 家族成員的表達受到強烈抑制，NFYA 家族基因的表達被強烈誘導，這種現象在玉米根中的表現尤為明顯。在柑橘（Citrus sinensis）［25］、棉花（Gossypium hirsutum）［26］、小麥（Triticum aestivum）［27］等物種中，NFYA 家族也會受到鹽分和干旱脅迫及外源激素ABA 的誘導。低氮條件下，擬南芥miR169 家族的表達也被強烈抑制，導致NFYA 基因的表達顯著上調［28］。高溫及低溫脅迫會誘導擬南芥miR169 家族基因的表達［29］。

2.1 miR169/NFYA模塊在干旱脅迫中發揮作用

由于全球氣候變化，干旱已成為限制農作物產量的主要脅迫之一。植物受到干旱脅迫后，會通過激素信號傳導產生生理生化反應，從而抵御干旱。施加外源ABA 可以提高植物包括干旱在內多種非生物抗性［30］。植物遭受逆境脅迫時，編碼ABA 合成關鍵酶的NCEDs、ABAs基因表達量上升，植物體內ABA 含量增加［31］。當ABA 存在時，ABA 受體蛋白PYR/PYLs 與蛋白磷酸酶PP2Cs 結合并抑制其活性，從而解除PP2Cs 對蛋白激酶SnRK2s 的抑制作用，磷酸化轉錄因子ABFs 激活下游啟動子中含ABRE元件的ABA 響應基因，通過促進葉片氣孔關閉防止水分散失［32］和促進植物主根生長吸取更多水分［33］增強植物抗逆性。ABA 不敏感基因（ABA-insensitive，ABI）也在ABA 信號通路中發揮重要作用，其中，ABI1/2編碼的PP2C 蛋白負調控ABA 信號傳導。然而，被SnRKs 激活的B3 類轉錄因子ABI3、AP2類轉錄因子ABI4 和bZIP 類轉錄因子ABI5 則會正調控ABA 信號傳導［31］，例如ABI3［34］和ABI5［35］可激活編碼親水性蛋白LEA基因的表達，提高植物對滲透脅迫的耐受性。

miR169 家族參與植物抵御干旱脅迫，但其發揮的作用并不保守，miR169 對靶基因不同的調控方式使其發揮的作用不同。擬南芥miR169a 靶向切割抗旱正調控因子AtNFYA5，過表達miR169a株系與nfya5突變體表現出對干旱敏感相似的表型［23］。擬南芥miR169i/l 能夠增強AtNFYA5 蛋白豐度，過表達miR169i/l 提高擬南芥的耐旱性［22］。大豆GmmiR169c 的靶基因GmNFYA3賦予大豆的耐旱性［14］，且GmmiR169c 通過靶向切割AtNFYA1及AtNFYA5，降低擬南芥的抗旱性［19］。在油菜中沉默BnmiR169n 后，由于其靶基因BnNFYA8的增加，植物的耐旱性有所上升［36］。過表達SlmiR169c番茄（Solanum lycopersicum）降低了SlNFYA1、SlNFYA2、SlNFYA3和一個多藥耐藥相關蛋白基因（multidrug resistance-associated protein，SlMRP1）的表達，使得植物的抗旱性增強［37］。同樣，過表達PtmiR169o楊樹（Populus trichocarpa）通過靶向切割抗旱負調控因子PtNFYA6，增強了植物的抗旱性［38］。

在大豆、玉米、楊樹、柑橘和棉花等物種中，一些在干旱脅迫中發揮作用的NFYA 家族成員未被報道受miR169 的調控。非生物脅迫下，它們的啟動子活性增強。楊樹NFYA9的啟動子受鹽、旱脅迫的誘導［39］。與野生型擬南芥相比，施加外源ABA 后，異源表達GmNFYA5［40］、GmNFYA13［41］以及PtNFYA9［39］的擬南芥萌發率更低，葉片氣孔更加閉合；另一方面，轉基因擬南芥受到干旱脅迫后存活率更高，體內ABA 積累更多。GmNFYA5、GmNFYA13 和PtNFYA9 會增加ABA 的合成，放大ABA 信號的傳導，增強植物的抗旱性。NFYA 作為NFY 家族的一個亞族，需要與NFYB、NFYC 形成三聚體發揮作用，這兩個亞族成員也會通過ABA依賴的方式增強植物的抗旱性［42］。大豆中NFY 家族成員會整合脫落酸信號調節植物的抗逆能力。NFYA16、NFYB2 和NFYC14 形成的三聚體可以提高PYR1的表達量，其編碼的蛋白與ABA 結合后抑制PP2C 的積累，激活SnRK2，使之磷酸化ABFs 途徑介導的ABA 信號傳導，最終提高植物的耐鹽和抗旱性［43］。楊樹NFYB21可以提高FUSCA3（FUS3）的積累，激活NCED3的表達，使楊樹根中積累更多ABA，從而增強主根的生長來抵御旱脅迫［44］。擬南芥NFYC9 及苔蘚（Physcomitrella patens）NFYC1 也會與ABI3/5的啟動子結合并增強其轉錄活性，提高LEA1 蛋白的積累增強植物的抗逆性［45-46］。這些文獻報道證明NF-Y 轉錄因子家族成員與ABA 信號通路具有密切的關系，調控植物的抗逆性。也有NFYA 家族成員，如水稻NFYA7不受ABA 誘導，OsNFYA7通過ABA 非依賴途徑參與植物賦予植物極強的抗旱性［47］。

2.2 miR169/NFYA模塊在鹽脅迫中發揮作用

miR169/NFYA 模塊在鹽脅迫中同樣發揮作用。植物受到鹽脅迫時，體內ROS 水平升高，解除ROS毒性對植物抵御鹽脅迫有重要意義。鹽脅迫下，玉米miR169q 的表達受到抑制，其靶基因ZmNFYA8表達上調。ZmNFYA8 與編碼抗氧化物酶的基因ZmPER1啟動子結合并激活其表達，減輕ROS 對植物的毒害作用，增強玉米的耐鹽性［48］。經轉錄組和ChIP 分析，大豆NFYA 會與GmLOS2（滲透性反應低表達基因）、GmOMT（編碼O-甲基轉移酶基因）、GmXTH23-2（編碼木葡聚糖內轉葡萄糖基酶/水解酶基因）等鹽響應基因啟動子結合并激活其轉錄，賦予大豆耐鹽性［49］。

ABA 也是鹽脅迫中的一個重要信號傳導因子，外源施加ABA 會產生更多的脯氨酸［31］，提高抗氧化物酶活性［50］，增強植物對鹽的耐受性。前述GmNFYA13［41］和PtNFYA9［39］在擬南芥中過表達，同樣通過增加ABA 合成和信號傳導通路提高植物的鹽耐性。值得注意的是，ABA 導致植物萌發期胚胎發育停滯，這被認為是提高幼苗在脅迫下存活的適應機制之一。相較野生型，過表達AtNFYA1的擬南芥在鹽脅迫下會積累更多ABA，表現出嚴重的萌發后生長停滯，但這種鹽敏感表型隨著植物的生長逐漸消失［51］。與其他NFYA 家族成員不同，小麥NFYA10的表達受到鹽脅迫及外源ABA 的抑制，過表達TaNFYA10的擬南芥抑制ABA 信號傳導，使植物成苗期對鹽脅迫敏感［27］（表1，表2）。

表1 miR169/NFYA 模塊參與植物的鹽、旱脅迫Table 1 miR169/NFYA module involved in plant salt and drought stress

表2 NFYA 轉錄因子在鹽、旱脅迫中發揮作用Table 2 NFYA transcription factors playing a role in salt and drought stress

大部分miR169 家族成員在植物受到逆境脅迫下的表達都會下調，而其靶向的NFYA 家族成員表達呈現上調，同時，NFYA 家族成員響應非生物脅迫也會受到自身啟動子的調控。NFYA 與NFYB、NFYC 形成三聚體直接或間接正調控其下游ABA 合成基因（NCED3、ABA1、ABA2）、ABA 信號傳導基因（PYR1、ABFs、ABI3和ABI5）賦予植物耐逆性。另外，NFYA 家族成員還會激活逆境響應基因（DREB1、WRKY4、MYB84、NHX1、SOS1、SALT3等）的表達增強植物對逆境脅迫的耐受性（圖1）。

圖1 miR169/NFYA 模塊在植物鹽、旱脅迫中的調控機理Fig.1 Regulatory mechanism of miR169/NFYA module in plants under salt and drought stress

3 miR169/NFYA 模塊對植物生長發育的影響

植物應對逆境脅迫時，其生長發育也會受到影響。ChIP-seq 及RNA-seq 的結果表明，生長調節因子GRF1/3（growth-regulating factors1/3）通過調節防御和發育相關基因以及激素水平來平衡植物的生長與防御［53］。參與植物花發育的TOE3（target of early activation tagged）、ELF3（early flowering）可以提高植物的冷抗性及耐鹽性［54-55］。miR169/NFYA 模塊也參與植物的生長發育。

擬南芥應激條件下miR169m/o 表達量降低，導致其靶基因AtNFYA2/3/7/10的表達急劇上升。AtNFYA2/3/7/10 會抑制細胞伸長相關基因的轉錄，導致植物矮化、生長停滯、種子變?。?6］；擬南芥NFYA1/5/6/9 也有同樣的功能［57］。miR169/NFYA 模塊在植物花器官的發育中也起到了重要的作用。過表達miR169 的擬南芥中，其靶基因AtNFYA2的表達降低，導致提前開花。AtNFYA2 與開花抑制因子FLC（flowering locus C）啟動子中的AACCT 元件結合并激活其表達，推遲植物的開花時間［58］。擬南芥NFYA8 與miR156 的啟動子結合阻止植物幼苗向成苗轉換，延遲植物開花時間［59］。

4 展望

本文綜述了miR169/NFYA 模塊參與植物非生物脅迫的作用機制。為了更好地利用候選基因改良作物的耐鹽抗旱性，還有一些問題需要研究：（1）在一些極端耐鹽、耐旱的植物中探討miR169/NFYA 模塊的作用機理或許可以得到更多信息。（2）miRNA常常有多個功能不同的靶基因，miRNA 對植物生理過程的調控是精細且復雜的。目前，對于miR169 靶基因的研究主要集中于NFYA 家族，可利用降解組測序技術更廣泛地研究miR169 的靶基因網絡，宏觀了解其在植物體內的調控機制。（3）NFYA 在逆境脅迫中多發揮正向調控作用，但會使擬南芥具有晚花、種子變小等表型。將其作為候選基因進行抗逆分子育種，還需更深入研究。