各生理因素對山蒼子莖段插穗生根成活的影響

熊 偉 ，翁小婷 ，陳尚钘 c，王宗德 c，范國榮 c，張 檜 ，何 晨 ，朱洪坤 ，毛卓佳 ，汪加魏

（1. 江西農業大學 a. 林學院；b. 江西省森林培育重點實驗室；c. 國家林業草原木本香料（華東）工程技術研究中心，江西 南昌 330045；2. 江西省林業科技推廣和宣傳教育中心，江西 南昌 330038）

山蒼子Litsea cubeba是樟科Lauraceae木姜子屬Litsea的落葉喬木或灌木[1]，具有食用、藥用、工業及觀賞等價值[2]。中國是世界上最大的山蒼子油生產國和出口國，但是其原料依舊以野生資源為主[3]，加之野生資源分散，其精油產量難以滿足國際市場的需求[4]，亟待加快山蒼子苗木選育，擴大人工林的栽種面積。目前，山蒼子的傳統播種繁育存在成苗率低、性別難以確定以及單株產量不穩定等問題[5]。扦插繁育具有簡便快速、繁殖效率高及保持母本優良性狀等特點，對于山蒼子育苗工作具有重要的參考價值。

目前，有關山蒼子扦插繁育的研究已有較多報道，并且以莖段扦插技術研究為主[5-12]。陳衛軍等[6]、張鼎華等[7]使用植物生長調節劑處理山蒼子插穗，其最高成活率分別為71.70%、68.00%；徐佑明等[8]、潘旅俊等[9]分別認為黃心土、河沙為山蒼子最適扦插基質，其成活率分別為73.30%、75.32%；趙海鵠等[10]在不同月份開展了山蒼子扦插試驗，以3月的平均生根率最高，為58.90%。相關研究結果表明，插穗內部營養物質含量對扦插生根成活存在影響[13-16]。在扦插生根期間，米槁Cinnamomum migao[14]和納塔櫟Quercus nuttallii[15]插穗的可溶性糖含量均呈“V”形變化，在生根誘導期其含量下降可促進插穗根原基的誘導和愈傷組織的形成，在生根后期其含量升高可促進插穗不定根的增加與延長。楸樹Catalpa bungei[16]插穗以1 000 mg/kg的GGR-6處理后扦插，插穗內部可溶性蛋白含量在扦插初期開始顯著下降，有助于基部生根活動，其可溶性糖和可溶性蛋白含量與生根率之間存在顯著正相關，總氮含量與生根率之間存在負相關。山蒼子枝條的上部、中部及下部之間的可溶性糖、可溶性淀粉、黃酮及多酚含量存在顯著差異，且其可溶性淀粉含量與生根率、成活率之間呈顯著正相關，黃酮含量與兩者之間呈顯著負相關[13]。此外，山蒼子莖段組織分泌物質較多，經剪切處理后，在離體條件下培養時，容易褐變[17]，抑制莖段細胞的增殖與分化，從而影響莖段愈傷組織及不定根的形成[18]。但有關影響山蒼子莖段扦插的生理因素的研究報道較為鮮見。為給扦插育苗工作提供參考，提高山蒼子扦插成活率，本研究中在已有扦插技術研究的基礎上[5]，測定了不同生根發育階段山蒼子插穗中營養物質和組織分泌物的成分和含量，分析影響其生根成活的因素。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于江西農業大學中藥園科研基地內（115°49′E，28°45′N）[5]，屬亞熱帶濕潤季風氣候，2020年平均氣溫19.1 ℃，最高氣溫38 ℃，最低氣溫-3 ℃，年降水量2 167.1 mm，日照時長1 410.6 h，無霜期312 d。

1.2 插穗采集、處理及扦插

2020年6月8日清晨，在江西農業大學科技園2年生山蒼子林[5]內，隨機采集生長健壯且無病蟲害的當年生半木質化山蒼子枝條。將枝條留2芽和2片1/3葉，基部斜切30°，制作成7 cm長的穗條。將穗條在800倍50%多菌靈溶液中浸泡消毒10 min，再用蒸餾水清洗后，置于植物生長調節劑溶液中（IBA 50 mg/L+ABT 25 mg/L）[5]浸泡1 h，最后扦插至以0.2%～0.3%高錳酸鉀預先消毒的苗床內。苗床長5.0 m，寬1.2 m，高0.3 m。扦插基質為江西南昌地區的紅黃壤土，其pH值為5.51，全N、全P和全K的質量分數分別為0.92、1.18、23.42 g/kg。扦插完成后，再用800倍的50%多菌靈溶液消毒，覆膜，搭建80%遮陰網。扦插期間每隔2～3 d清理枯死枝條、落葉和雜草，并用800倍的50%多菌靈溶液消毒，適時澆水、通風，控制濕度在80%～90%，溫度在25～35 ℃。大部分插穗發芽后，適當降低澆水頻率，并每10～15 d噴施少量0.3%尿素+0.1%KH2PO4+0.05%葡萄糖的混合溶液，促進其生長。

1.3 插穗取樣及指標測定

1.3.1 取樣

在扦插試驗期間（2020年的6月8日—10月8日），分別隨機選取4種生根發育期半木質化插穗（新鮮插穗、半枯插穗、愈傷組織插穗和生根插穗）用于營養物質和組織分泌物的測定，每種插穗15～20根。新鮮插穗為經前期處理未扦插的插穗；半枯插穗為上部綠色而下部在基質中已無生命力的插穗；愈傷組織插穗為長有排列均勻的愈傷組織的插穗（無生根）；生根插穗為有愈傷組織且已有較長根系的插穗。

1.3.2 插穗營養物質的測定

4種插穗分別選取整個插穗（新鮮插穗）、插穗上半帶枯萎和綠色部位（半枯插穗）、基部愈傷組織部位（愈傷組織插穗，未生根）、基部生根部位（生根插穗），各種插穗的取樣部位如圖1所示。取剪碎混勻的新鮮莖段樣品，采用蒽酮比色法[15]測定可溶性糖和可溶性淀粉含量，采用考馬斯亮藍法[15]測定可溶性蛋白含量，使用NaNO2-AlCl3-NaOH顯色系統[13]測定黃酮含量，采用福林酚法[13]測定多酚含量。取剪碎烘干的莖段樣品粉末，使用全自動分析儀測定樣品全N和全P含量，使用火焰光度計[19]測定樣品全K含量。

圖1 4種山蒼子莖段插穗的取樣部位Fig. 1 Sampling positions for the four types of L. cubeba stem cuttings

1.3.3 插穗基部分泌物的測定

將4種插穗洗凈處理后，用0.5 mmol/L的氯化鈣溶液浸泡24～48 h。將浸提液過濾后，用乙酸乙酯等體積萃取3次，每次添加乙酸乙酯時用磁力攪拌器攪拌0.5 h。將3次萃取液收集合并，在35 ℃條件下旋轉蒸發濃縮至1.5～3.0 mL，經0.45 μm的微孔濾膜過濾到1.5 mL棕色瓶中，超聲5 min后放入氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）進行進樣分析。

分析條件參考劉欣宇等[20]和崔翠等[21]的方法。色譜柱條件為HP-5MS毛細管柱（30.00 m×25.00 μm×0.25 μm）；電離選用 EI離子源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃；MS四級桿溫度調節至150 ℃；質量掃描范圍為20～600 amu；最高柱箱溫度為310 ℃；載氣為He（純度99.99%）。升溫程序為初始溫度100 ℃，持續3 min后，再以25 ℃/min升至280 ℃，保持15 min；流速為1.0 μL/min，不分流；溶劑延遲3 min。

1.4 數據分析

分別使用Excel 2019、SPSS 25.0軟件對數據進行統計和方差分析。

2 結果與分析

2.1 4種生根發育期山蒼子莖段插穗營養物質的含量

4種生根發育期山蒼子莖段插穗營養物質的含量見表1。由表1可知，新鮮插穗的全N、全P、可溶性蛋白、可溶性糖和可溶性淀粉的質量分數均最高，分別為14.14、1.71、1.08、74.38、100.85 mg/g，且其全N、可溶性糖、可溶性淀粉的質量分數均顯著高于半枯插穗、愈傷組織插穗和生根插穗（P＜0.05），這表明扦插后山蒼子莖段開始消耗營養物質，來供應基部生理活動所需能量，促進基部不定根的誘導。

表1 4種生根發育期山蒼子插穗中營養物質的質量分數?Table 1 Nutrient content of the L. cubeba stem cuttings at four rooting development stages mg/g

在愈傷組織誘導階段，山蒼子插穗會受到內外因素影響，其基部易腐爛，形成上部綠色而下部無生命力的半枯插穗，影響插穗成苗。半枯插穗的黃酮和多酚含量均最高，其質量分數分別為7.36、10.24 mg/g，其黃酮和多酚含量均顯著高于生根插穗中的含量（P＜0.05），其黃酮含量顯著高于愈傷組織插穗中的含量（P＜0.05），但黃酮和多酚含量與新鮮插穗中含量的差異均不顯著（P＞0.05），因此推測在根系誘導期間山蒼子插穗內源黃酮、多酚含量的提升會致使其枯死，不利于插穗愈傷組織形成和生根成活。

在愈傷組織形成階段，山蒼子插穗消耗營養物質而形成愈傷組織，因此愈傷組織插穗的全K和可溶性蛋白含量顯著降低（P＜0.05），其質量分數分別為2.42、0.51 mg/g，但是愈傷組織插穗的全N含量顯著高于生根插穗（P＜0.05），這表明插穗基部的愈傷組織可吸收部分營養物質來滿足其生理活動所需。

在山蒼子插穗生根后，其基部新生根系可從土壤中吸收養分和水分，并且插穗新葉可進行光合作用合成光合營養，因此生根插穗的全K、可溶性蛋白、可溶性糖和可溶性淀粉含量均顯著高于愈傷組織插穗（P＜0.05），可溶性淀粉含量顯著高于半枯插穗（P＜0.05）。但生根插穗的黃酮和多酚含量（其質量分數分別為3.66、6.93 mg/g）均顯著低于新鮮插穗、愈傷組織插穗和半枯插穗（P＜0.05）。結果表明山蒼子莖段插穗生根后，插穗中營養物質開始增加，而生根抑制物質（黃酮、多酚）的含量降低，這有助于插穗根系的延長和成活。

2.2 4種生根發育期山蒼子插穗組織分泌物的成分及其含量

2.2.1 4種插穗中組織分泌物的構成

經GC-MS測定，4種生根發育階段山蒼子插穗組織分泌物的具體成分及其含量見表2。由表2可知，在4種插穗中共鑒定出67種化合物，包括烷烴類（35種）、醇類（4種）、醛類（1種）、酚類（3種）、酸類（2種）、脂類（4種）、酮類（3種）、苯類（3種）、胺類（6種）、其他（6種）。

在新鮮插穗浸提液中共檢測出24種物質，按其質量分數由高到低排序依次為烷烴類（22.95%，13種）、脂類（18.21%，3種）、酚類（10.56%，2種）、胺類（8.97%，1種）、醇類（4.40%，1種）、其他（4.01%，2種）、苯類（1.17%，1種）、酸類（0.61%，1種）。在烷烴類物質中以二十烷為主，占比為16.07%；在脂類物質中以鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯為主，占比為94.07%；在酚類物質中以2,2′-亞甲基雙(4-甲基-6-叔丁基苯酚)為主，占比為89.11%；在其他物質中以十四烷基碘化物為主，占比為70.82%；酚類、胺類、醇類、苯類、酸類均為單一物質。

在半枯插穗浸提液中共檢測出31種物質，按其質量分數由高到低排序依次為烷烴類（20.06%，19種）、其他（9.49%，3種）、胺類（9.30%，1種）、酚類（8.02%，2種）、脂類（3.23%，1種）、醇類（0.78%，2種）、醛類（0.48%，1種）、苯類（0.34%，1種）、酸類（0.28%，1種）。在其烷烴類物質中以二十烷為主，占比為32.25%；在醇類物質中以2-辛基-1-癸醇為主，占比為66.67%；在酚類物質中以2,2′-亞甲基雙(4-甲基-6-叔丁基苯酚)為主，占比為92.14%；在其他物質中以6,7-二甲氧基-1-甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉為主，占比為91.88%；胺類、脂類、醛類、苯類、酸類均為單一物質。

表2 4種生根發育期山蒼子插穗組織浸提液的成分及其含量?Table 2 Stem cutting tissue extracts composition of four rooting development stages of L. cubeba

續表2Continuation of Table 2

在愈傷組織插穗浸提液中共檢測出14種物質，按其質量分數由高到低排序依次為醇類（54.72%，2種）、胺類（3.50%，5種）、其他（2.29%，2種）、酮類（1.39%，3種）、苯類（0.81%，1種）、酚類（0.74%，1種）。在醇類物質中以3-二異丙氨基-1,2-丙二醇為主，占比為94.85%；在酮類物質中以異隱丹參酮為主，占比為71.94%；在胺類物質中以2,2-二甲基-3-嗎啉-4-基丙烷-1-胺為主，占比為46.28%；在其他物質中以L-亮氨酰-D-亮氨酸二水合物為主，占比為81.22%；苯類、酚類均為單一物質。

在生根插穗浸提液中共檢測出13種物質，按其質量分數由高到低排序依次為烷烴類（37.41%，8種）、酚類（25.54%，2種）、苯類（7.90%，2種）、脂類（3.29%，1種）。在其烷烴類物質中以十二甲基環六硅氧烷為主，占比為19.83%；在苯類物質中以1,2雙(三甲基硅烷基)苯為主，占比為57.08%；在酚類物質中以2,2′-亞甲基雙(4-甲基-6-叔丁基苯酚)為主，占比為79.17%；脂類為單一物質。

2.2.2 4種插穗中組織分泌物構成的異同

4種插穗的組織分泌物中均存在的物質僅1種，為2,2′-亞甲基雙(4-甲基-6-叔丁基苯酚)，暫不明確其對插穗生根成活的作用。僅在新鮮插穗、半枯插穗和生根插穗的組織分泌物中均檢出的物質僅1種，為1,4-雙(三甲基甲硅烷基)苯，同樣暫不明確其對插穗生根成活的作用。僅在新鮮插穗和半枯插穗的組織分泌物中均檢出的物質為8種，其中質量分數均較高的物質有芥酸酰胺（分別為8.97%、9.30%）、二十烷（分別為3.69%、6.47%）等，且這8種物質未在愈傷組織插穗和生根插穗的分泌物中出現，因此可能抑制山蒼子的扦插生根成活。僅在新鮮插穗和生根插穗的組織分泌物中均檢出的物質有2種，為鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、3,5-二叔丁基鄰苯二酚，且這2種化合物在半枯插穗分泌物中均未檢出，因此其可能促進山蒼子的扦插生根成活。

僅在新鮮插穗的組織分泌物中檢出的物質有12種，集中于烷烴類，其中以二十四烷（4.70%）、十九烷（2.52%）和1-碘壬烷（1.89%）的質量分數較高，但因插穗處在未扦插狀態，暫不明確其對插穗生根成活的作用。僅在半枯插穗的組織分泌物中檢出的物質有20種，集中于烷烴類，其中以十三烷（1.56%）、5-甲基-十一烷（1.53%）、2,3,4-三甲基戊烷（1.48%）的質量分數較高，這些物質可能抑制插穗的生根成活。僅在愈傷組織插穗的組織分泌物中檢出的物質有13種，其中以3-二異丙氨基-1,2-丙二醇（51.90%）、二苯哌甲醇（2.82%）、L-亮氨酰-D-亮氨酸二水合物（1.86%）的質量分數較高，由于山蒼子既能愈傷生根也能皮部生根，所以暫不明確上述物質對插穗生根成活的作用。僅在生根插穗的組織分泌物中檢出的物質有8種，其中以十二甲基環六硅氧烷（7.42%）、二十五烷（5.87%）、十二甲基五硅氧烷（5.84%）的質量分數較高，這些物質可能促進插穗的生根成活。

3 結論與討論

本研究結果表明：新鮮山蒼子莖段插穗扦插后，插穗內源全N、可溶性糖、可溶性淀粉含量顯著下降（P＜0.05），有利于基部的生根誘導活動；扦插生根誘導期山蒼子插穗全K和可溶性蛋白含量顯著下降（P＜0.05），有利于愈傷組織的形成，但插穗內源黃酮和多酚含量上升，不利于插穗生根成活；插穗生根后，其可溶性淀粉含量顯著升高（P＜0.05），且插穗內源黃酮和多酚含量顯著下降（P＜0.05），有利于插穗成活。在4種生根發育期插穗的組織分泌物中共鑒定出67種化合物，且新鮮插穗、半枯插穗和生根插穗的組織分泌物均以烷烴類為主，質量分數分別為22.95%、20.06%、37.41%；此外插穗組織分泌物中對山蒼子扦插生根成活可能具有促進作用的物質有11種，可能具有抑制作用的物質有29種。

在木本植物扦插生根過程中，插穗內部營養物質參與基部細胞的生理活動，促進根原基誘導、不定根產生及延長[14-16]。目前，關于山蒼子插穗營養物質的研究報道僅限于不同枝條部位的差異[13]等方面，未能解釋扦插過程中其營養物質含量的變化規律，也未能提供促進插穗生根成活的有效措施[22]。本試驗結果表明：新鮮插穗扦插后，其全N、可溶性糖、可溶性淀粉含量均顯著下降（P＜0.05），因為扦插初期插穗的呼吸作用加強，碳源物質和N素營養消耗增加，有助于供給生根誘導所需能量[15,23-25]。因此建議在浸泡插穗的植物生長調節劑溶液內添加尿素和蔗糖，來增加插穗內源氮素和碳源物質。

山蒼子扦插生根類型為混合生根型[5]，在生根誘導期間基部會產生愈傷組織，進一步加快不定根的誘導。本試驗結果表明：愈傷組織插穗的全K和可溶性蛋白含量顯著降低（P＜0.05），因為插穗愈傷組織的形成既需要消耗營養物質來提供能量[26]，也需要消耗蛋白質來提供組成結構物質[14,27]。在誘導愈傷組織階段山蒼子插穗基部易產生腐爛、褐變而導致枯死[5,11]，嚴重阻礙了山蒼子莖段插穗的成苗及技術推廣。本試驗中發現扦插后半枯插穗的黃酮、多酚含量最高，并且魏麗秀等[13]的研究結果表明插穗內源黃酮、多酚物質含量與生根率等生根性狀之間存在負相關，可能是因為多酚易氧化褐化而阻礙插穗生根[18]，黃酮為強生根抑制劑[28]，兩者均抑制插穗生根，最終導致插穗生理性枯死[29]。因此推斷黃酮和多酚為抑制山蒼子插穗生根成活的物質，建議插穗剪切后用有機溶劑浸泡，減少內源黃酮和多酚。

在插穗的不定根產生后，基部根系可從環境吸收營養物質供給能量，加快后續根系延長[14]。但本研究中發現山蒼子插穗生根后，其全N、全P含量均顯著低于其他生根誘導階段的插穗（P＜0.05），因為插穗基部根系的延長活動與地上芽葉的生理活動具有競爭關系[30]，插穗根系吸收的營養物質會通過韌皮部轉運并用于地上部分（嫩芽、幼葉）的營養生長[23]，因此建議在插穗生根后追加使用含N、P等的營養有機液，加快基部根系活動及地上部分的營養生長。本研究中僅測定和對比了扦插過程典型時期山蒼子莖段插穗的營養物質，并且為破壞性取樣，缺少整個生根階段插穗營養物質含量的連續分析，后續應定期取樣測定并研究插穗的營養物質含量與生根成活的關系，探討營養調控機制。

山蒼子莖段經剪切處理后，新產生的酚類底物易被氧化成醌類物質[31]，發生褐變[11,18]，抑制莖段內源酶活性，從而阻礙根系誘導。本試驗結果表明，山蒼子插穗的組織分泌物中共存在3種酚類物質，其中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚僅在半枯插穗中檢出，并且半枯插穗組織褐化最嚴重，其可能為抑制生根成活的酚類物質。但是酚類物質也可能為插穗生根輔助因子而促進其生根[32-33]，在本試驗中3,5-二叔丁基鄰苯二酚僅存在扦插前、扦插生根后的插穗中，其有助于插穗合成生根輔助因子而促進成活。因此建議以抗褐劑處理插穗，以減輕分泌物中部分酚類的不利作用。

植物在生長發育活動中通過分泌多種物質來不斷適應周圍的環境[20-21,34]。本試驗結果表明，半枯插穗較其他類型插穗產生了相對含量較高的芥酸酰胺、二十烷等物質。半枯插穗處于凋亡狀態且基部無生命活動，內部抑制插穗生根成活的物質含量增加，因此推測芥酸酰胺和二十烷可能會抑制插穗生根成活。孫林鶴等[35]認為芥酸酰胺為促進植物生長的根系代謝物質，與本研究結果不同。韓麗梅等[36]認為二十烷可能對生根具有抑制效果，與本研究結果類似。與扦插前和誘導生根階段的插穗相比，生根插穗組織分泌物中物質種類較少，其中含量較高的十二甲基環六硅氧烷可能促進插穗成活，這可能是因為十二甲基環六硅氧烷為抗脅迫類物質[37]，可使生根插穗更好適應后續生長環境的變化；生根插穗組織分泌物中的二十五烷屬于化感物質[36]，有助于根系與基質進行物質與信號交流，因此可能為促進插穗成活物質。本研究結果表明，山蒼子插穗組織分泌物可能對其扦插生根成活存在正面或負面的作用，但是由于分泌物中物質的種類多，后續應優化試驗設計及條件，探明各類物質的具體作用及關鍵促進或抑制因子。