‘鳳丹’種子層積過程中內源抑制物含量變化規律

李 強，孫海燕，朱銘瑋，翟金庭，李淑嫻

（1. 南京林業大學 南方現代林業協同創新中心，江蘇 南京 210037；2. 鹽城林場，江蘇 鹽城 224136）

油用牡丹是芍藥科Paeoniaceae芍藥屬PaeoniaL.多年生落葉灌木，是牡丹組植物中結實量大且出油率高（≥22%）的種的統稱[1]。與其他木本油料植物相比，油用牡丹抗性強，在貧瘠的土地上也能較好地生長；油用牡丹的耐蔭性也較強，其與高大經濟林植物間作，具有一次種植連續收獲30年以上的特點[2]。有關研究者在檢測中發現，油用牡丹的主要栽培品種群‘鳳丹’P.ostii‘Feng Dan’的種子含油率較高，且其油品質也較好，種子中油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸的含量高達90%[3]，特別是其中的具有“植物腦黃金”之譽的α-亞麻酸的含量高達42%以上[4]。牡丹籽中的α-亞麻酸含量明顯高于常規食用油中的α-亞麻酸含量（是橄欖油的140倍），且中國作為食用植物油消費大國，自給率僅為35.3%，長期被動進口大量的植物油，而木本油料植物的開發與利用才是解決世界各國食用植物油缺口問題的重要渠道[5]，因此油用牡丹成為近年來快速發展的新興產業，獲得國家的大力扶持與推廣，并于2011年獲批原衛生部國家新資源食品。

生產上，油用牡丹以種子繁殖為主，而其種子具有休眠習性，需要經過近6個月的層積處理才能正常萌發，這給播種育苗工作帶來諸多不便。有研究者發現，內源抑制物的存在是導致許多植物種子休眠的重要因素之一[6-7]，且這些抑制物通常存在于種皮、胚乳等部位中，其中已分離鑒定出的抑制物質主要為有機酸類、酚類、醛類和生物堿類等，如楊立學等[8]采用GC-MS技術在紫椴Tilia amurensisRupr.種子中檢測出有機酸、苯酚類等物質；也有學者認為，酯類物質的存在也會導致種子休眠[9]。丁言[10]研究發現，內源抑制物的影響可能是造成‘鳳丹’種子休眠的重要原因；朱銘瑋等[11]采用氣質聯用的方法分析了導致‘鳳丹’種子休眠的因素，結果發現，油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、鄰苯二酚等5種物質可能是導致其種子休眠的重要抑制物，而他們并未研究種子在休眠解除過程中這幾種物質含量的變化特點。為了探究‘鳳丹’種子休眠解除過程中上述5種抑制物質的含量變化規律及其與‘鳳丹’種子休眠的關系，本研究以層積處理不同階段的‘鳳丹’種子為材料，提取不同層積階段種子的浸提液，進行生物活性測定，分析內源抑制物對‘鳳丹’種子休眠的影響情況，依據抑制中濃度進一步探究抑制物質對種子休眠的影響程度，并對‘鳳丹’種子整個層積過程中抑制物含量進行測定，為更好地解除種子休眠、促進種子萌發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將新采收的‘鳳丹’種子（深休眠）與濕沙按1∶3的體積比混勻后放在10 ℃的溫度條件下進行層積處理，待胚根突破種皮后再將其放在4 ℃低溫下進行層積處理，以解除上胚軸的休眠。層積處理過程中，要定期翻動種子，以保持良好的通氣條件，并注意及時補充水分。分別于層積處理0 d（Ⅰ階段）、層積處理30 d（Ⅱ階段）、胚根突破種皮（Ⅲ階段）、上胚軸出現（Ⅳ階段）、5%的種子真葉出現（Ⅴ階段）時數取一定數量的種子以用于下面的相關試驗中。

1.2 研究方法

1.2.1 層積不同階段種子浸提液的提取及甲酯化處理

按照李婉茹等[12]的方法（略有改動）進行種子浸提液的提取與甲酯化處理。隨機數取各個層積階段的‘鳳丹’種子粒數，每個層積階段各數取種子50粒，各設3個重復，將數取的種子凍干、粉碎后，稱取2 g粉末，加入100%的甲醇溶液100 mL，密閉浸提24 h后，以5 000 r/min的轉速離心3 min。過濾上清液，在60 ℃下減壓濃縮蒸餾，最后將濃縮液定容至5 mL。取濃縮液1 mL，加入蒸餾水稀釋至20 mL以用于其生物活性的測定。

分別取上述5個層積階段的種子浸提液，每個階段的種子浸提液各取0.2 mL，依次加入0.5 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液2 mL、14%的三氟化硼-甲醇溶液2 mL、正己烷2 mL、飽和氯化鈉水溶液2 mL，然后靜置，取甲酯化后的上清液，以用于種子中抑制物含量的測定。

1.2.2 各個層積階段‘鳳丹’種子分離物生物活性的測定

以白菜種子為材料，對上述浸提液的生物活性進行測定：每個層積階段的‘鳳丹’種子浸提液各取1 mL，分別加入鋪有一層濾紙的培養皿中，待甲醇揮發后，加入蒸餾水4 mL，每個重復各隨機數取白菜種子100粒，設3個重復，將白菜種子置于裝有1 mL‘鳳丹’種子浸提液的培養皿中浸泡3 h，以加入1 mL蒸餾水處理相同時間的為對照。再將浸泡后的白菜種子放在鋪有2層濾紙的培養皿中，在25 ℃的恒溫光照培養箱內進行發芽試驗。當白菜種子的胚根伸長至少1 cm且子葉展開時即認為該種子已經發芽，每隔8 h統計1次白菜種子的發芽率，將種子發芽粒數連續3天均不超過1%的視為發芽結束。發芽結束后計算各個層積階段的白菜種子發芽率。

1.2.3 5種內源抑制物質有效抑制中濃度（IC50值）的測定

根據朱銘瑋等[11]采用氣質聯用儀鑒定的結果及其他人[13-14]的研究結果，篩選出對‘鳳丹’種子發芽可能有影響的油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、鄰苯二酚這5種物質，購買其標準品（德國sigma公司）。將油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸分別稀釋成1、10、100、1 000、10 000 mg/L的溶液，將鄰苯二酚分別稀釋成0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0、10 000.0 mg/L的溶液。隨機數取白菜種子100粒，設3個重復，取不同濃度的溶液4 mL浸泡白菜種子3 h，用蒸餾水處理相同時間的白菜種子為對照。浸種后將白菜種子放在鋪有2層濾紙的培養皿中，在25 ℃的光照培養箱中進行發芽試驗。發芽結束后，測量各處理白菜胚根的長度，按下式計算各種物質的抑制率（預試驗結果表明，采用不同濃度的標準品處理白菜種子后，其對白菜種子胚根的伸長均有抑制作用，因此測定各處理白菜種子胚根的長度以確定抑制率）。

I=(C-T)/C×100%。

式中：I為抑制率（%）；C為對照組白菜種子胚根的長度均值（mm）；T為處理組白菜種子胚根的長度均值（mm）。以各種抑制物濃度的對數值為X，以‘鳳丹’種子浸提液對白菜種子胚根生長的抑制率（I）為Y，擬合回歸方程，并根據回歸方程求出Log IC50，經反對數求出抑制率達到50%時該抑制物質的濃度（IC50值）。

1.2.4 各種抑制物標準曲線的繪制

采用GC-MS氣相色譜-質譜聯用技術測定層積過程中各種內源抑制物質含量變化趨勢時，需先繪制標準曲線，即參照王浩宇等[13]的研究結果并結合上述抑制中濃度的測定結果，選取亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、鄰苯二酚這4個標準品，每個標準品各稱取10 mg，分別用甲醇溶液超聲溶解，定容至10 mL，作為母液，參照尚旭嵐[15]所用的方法，將各個標準品分別稀釋成不同濃度的溶液，亞油酸和硬脂酸的稀釋濃度分別為5、10、50、100 mg/L，棕櫚酸的稀釋濃度分別為1、2、5、10、50、100 mg/L，鄰苯二酚的稀釋濃度分別為10、50、100 mg/L。然后以不同稀釋濃度為橫坐標，以其對應的峰面積為縱坐標，計算各種內源抑制物質的線性回歸方程和相關系數。

1.2.5 各個層積階段‘鳳丹’種子中抑制物含量的測定

將1.2.1中所述低溫層積過程中不同階段的‘鳳丹’種子的提取物甲酯化處理后，送至清華大學化學分析測試中心進行GC-MS分析測定，所用儀器為美國產的Agelient 6890N/5973N GC-MS（氣譜-質譜）聯用儀。氣相色譜條件：石英毛細管柱為TR-WAXMS（Thermo Scientific，30 m×250 μm×0.25 μm）；參照錢存夢等[16]所用的方法測定各個層積階段種子中抑制物的含量；122-5532UI DB-5MS氣相色譜柱（Agilent，J & W Scientific，30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度為250 ℃，載體為高純氦氣，其流量為1 mL/min，分流比為10。升溫程序：50 ℃保持5 min；以5 ℃/min升至300 ℃，保持20 min。離子源溫度為220 ℃，接口溫度為280 ℃，以SIM檢測方法進行定量分析。

以不同稀釋濃度為橫坐標，以其對應的峰面積為縱坐標，查詢相應的標準曲線，計算各個層積階段硬脂酸、棕櫚酸、亞油酸、鄰苯二酚的含量。

1.3 數據處理

采用Excel和Origin 2017軟件繪制圖表，運用SPSS.22軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 休眠解除過程中抑制物活性的測定結果

不同層積階段‘鳳丹’種子的浸提液對白菜種子發芽率的影響情況見表1。由表1可知，各個層積階段‘鳳丹’種子的浸提液對白菜種子發芽率的影響程度并不相同。Ⅰ階段（新采收）‘鳳丹’種子的浸提液使白菜種子發芽率顯著下降至20.7%，與對照相比，下降了77.4%；隨著層積時間的延長，浸提液對白菜種子發芽的影響作用減弱，當層積至Ⅲ階段即胚根突破種皮時，白菜種子的發芽率顯著增加至46.3%，但與對照相比，仍下降了49.5%，說明此時‘鳳丹’種子中仍然存在對白菜種子發芽具有較強抑制作用的物質；當‘鳳丹’種子層積至Ⅴ階段即其上胚軸休眠基本解除時，白菜種子的發芽率為88.0%，與對照相比，其差異不顯著，說明此時‘鳳丹’種子中抑制物的活性已變得較弱了。

表1 休眠解除不同階段的‘鳳丹’種子甲醇提取物對白菜種子發芽的影響?Table 1 Effects of methanol extracts from P. ostii ‘Feng Dan’ seeds at different dormancy stages on germination percentage of cabbage seeds %

2.2 幾種標準品抑制中濃度（IC50值）的測定結果

‘鳳丹’種子甲醇提取物中棕櫚酸的質譜圖（圖1）與計算機檢索譜圖的吻合度為96%。將棕櫚酸標準品稀釋成不同濃度的溶液，然后對不同濃度溶液的生物活性進行測定，結果如圖2所示。

圖1 ‘鳳丹’種子甲醇提取物與棕櫚酸的質譜圖Fig. 1 MS comparison between inhibitor and palmitic acid

由圖2可知，當棕櫚酸的稀釋濃度為1 mg/L時，棕櫚酸溶液對白菜種子的發芽略有促進作用。隨著棕櫚酸稀釋濃度的逐漸加大，其抑制作用不斷增強。當棕櫚酸的稀釋濃度為10 000 mg/L時，對白菜種子發芽的抑制率為100%。計算得出的擬合方程為：y=3.637x2+12.57x-7.912。式中：y表示峰面積，單位為mV·s；x表示標準品的濃度，單位為mg/L。利用上述不同濃度棕櫚酸標準品擬合方程經反對數求出的IC50值為460.26 mg/L，也就是說，當棕櫚酸標準品的濃度為460.26 mg/L時，其對白菜種子胚根生長的抑制率達到50%。

圖2 不同稀釋濃度的棕櫚酸對白菜種子胚根長度的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effects of palmitic acid at different concentrations on the length of cabbage radicles

采用與棕櫚酸標準品抑制中濃度的測定方法相同的方法，可以測得其他4種標準品的抑制中濃度，測定結果見表2。

這5個標準品中只有亞油酸的質譜圖與計算機檢索譜圖的吻合度略低，但也達到了83%，棕櫚酸、硬脂酸、鄰苯二酚的質譜圖與計算機檢索譜圖的吻合度均高達96%，說明其GC-MS的鑒定結果與標準品的相似度均較高。由各個標準品的IC50值可知，不同濃度的油酸對白菜種子的發芽均無抑制作用，故接下來沒有繪制油酸的標準曲線，也沒有檢測層積過程中其含量變化情況。其他4種物質中，硬脂酸的IC50值最高，為972.75 mg/L，說明只有較高濃度的硬脂酸才會使白菜種子發芽受到影響；亞油酸的IC50值為137.40 mg/L，遠低于硬脂酸的IC50值，也就是說，對白菜種子發芽的抑制作用，相同濃度的亞油酸要強于相同濃度的硬脂酸；這4種物質中，鄰苯二酚的IC50值最低，為12.13 mg/L，當其濃度為1 mg/L時，鄰苯二酚對白菜種子發芽的抑制率為27.24%。

2.3 幾種抑制白菜種子發芽物質的標準曲線

亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸和鄰苯二酚這4個標準品在所選色譜條件下的標準曲線如圖3所示。將各標準品分別稀釋成不同濃度，以其稀釋濃度為橫坐標，以其對應的峰面積為縱坐標，計算得到這4種物質的線性回歸方程和相關系數見表3。由表3可知，4種標準品溶液的濃度與峰面積的相關性均良好，其相關系數均在0.999以上。

表2 5種標準品對白菜種子發芽的影響?Table 2 Effects of various standard substances on the germination of cabbage seeds

2.4 層積過程中‘鳳丹’種子各種內源抑制物含量的動態變化

根據GC-MS分析測得的各種抑制物質在各個層積階段的峰面積，按照表3中相應的標準曲線，可以計算出層積過程中4種抑制物質的含量，計算結果如圖4所示?？偟膩碚f，隨著層積時間的延長，‘鳳丹’種子中4種抑制物質的含量均呈逐漸下降的變化趨勢，但是，每一種抑制物質的含量變化幅度與變化規律均不相同。當胚根突破種皮（Ⅲ階段）時，除鄰苯二酚外，其他3種抑制物質的含量均顯著下降，其中亞油酸的下降幅度最大，由I階段的2 208.02 mg/L顯著下降至1 370.77 mg/L，下降了37.92%。層積至Ⅲ階段時，硬脂酸、棕櫚酸的含量較其Ⅰ階段的分別顯著下降了24.36%、15.54%。之后隨著層積時間的延長，這3種抑制物質的含量雖然仍均繼續下降，但下降速度均明顯變慢。當種子層積到Ⅴ階段（上胚軸伸長且5%的種子真葉已展開）時，亞油酸的含量為1 430.98 mg/L，與其在Ⅲ、Ⅳ階段的含量相比略有上升，而其含量差異均未達到顯著水平，但與Ⅰ階段（新采收）的種子相比，其含量仍下降了35.19%。層積至Ⅴ階段時，棕櫚酸的含量顯著低于其在Ⅲ階段的，較其在Ⅲ階段的含量下降了25.14%，較其在Ⅰ階段的含量下降了36.78%。同樣，層積至Ⅴ階段時，硬脂酸的含量較其在Ⅰ、Ⅲ階段的含量分別顯著下降了48.58%、32.02%。這4種抑制物質中，鄰苯二酚的含量變化規律最明顯，在前幾個層積階段，其含量基本沒有變化，而在休眠解除的最后一個階段，其含量突然降為0，與層積處理前的含量（8.21 mg/L）相比，其含量顯著下降。

圖3 4種抑制物質在所選色譜條件下的標準曲線Fig. 3 Standard curves of germination inhibitors under selected GC-MS conditions

表3 4種抑制物質在所選色譜條件下的回歸方程Table 3 Regression equation of germination inhibitors under selected GC-MS conditions

3 討 論

3.1 內源抑制物質對種子萌發的影響

種子休眠是植物尤其是多年生植物在進化過程中形成的一個重要的適應性性狀[17-18]。植物種類不同，造成種子休眠的原因也不相同[12,18]，其中內源抑制物的作用是造成許多植物種子休眠的主要原因[19]。Khan[20]早在1975年就曾提出了“三因子學說”，隨后越來越多的內源抑制物被發現；Kentzer[21]從白蠟樹Fraxinus chinensisRoxb.的種子中分離出了抑制種子萌發的物質，其研究發現，這些抑制物質廣泛存在于果皮、種皮、胚乳等部位中[22]。關于牡丹種子休眠問題的研究報道也較多：如周理平等[23]研究了紫斑牡丹P. rockii種子的浸提液對油菜和白菜種子發芽的影響情況，結果發現，浸提液會顯著抑制種子的萌發，說明內源抑制物的作用是導致紫斑牡丹種子休眠的重要原因；孫曉剛等[24]發現，‘鳳丹’種子中的內源抑制物質通過阻礙種子吸水、抑制呼吸、抑制酶活性、阻礙種胚生長等而對種子萌發起到抑制作用。

圖4 休眠解除不同階段‘鳳丹’種子中抑制物質含量的變化情況Fig. 4 Changes of inhibitory substances in P. ostii ‘Feng Dan’ seeds at different stages of dormancy release

層積處理是解除‘鳳丹’種子休眠的重要方法，隨著層積時間的延長，種子休眠變淺。研究中發現，不同層積階段的‘鳳丹’種子其甲醇分離物對白菜種子發芽有不同程度的抑制作用。層積前種子中抑制物質的活性最強，而休眠解除過程中內源抑制物的活性逐漸下降。這一結果與孫玉琴等[25]對屏邊三七Panax stipuleanatus種子休眠的研究結果相同?！P丹’種子層積至第Ⅴ階段時，其種子中仍然存在少量的抑制物質（白菜種子的發芽率為88.0%，較對照的發芽率略有下降），這可能因為每粒種子解除休眠的時間不盡相同，本研究將5%的種子真葉出現作為取樣的最后一個階段，此時沒有萌發的種子仍然保持一定程度的淺休眠狀態，因此最后階段提取物對白菜種子的發芽仍會略有影響。層積過程中‘鳳丹’種子中抑制物活性的變化情況再次表明了內源抑制物的抑制作用是致使種子休眠的重要原因。

3.2 ‘鳳丹’種子內源抑制物質種類的篩選

氣質聯用的方法常被用來分析內源抑制物的種類。楊曉玲等[26]研究發現，酚類物質的抑制作用是造成山楂Crataegus pinnatifida種子休眠的重要原因；王艷華等[27]研究發現，苯甲酸、棕櫚酸、硬脂酸等物質是致使大山櫻Prunus sargentii種子休眠的重要內源抑制物質；張艷杰等[28]在對南方紅豆杉Taxus wallichiana var.mairei種子休眠機理的研究中發現，棕櫚酸、油酸、鄰苯二甲酸二乙酯等物質對其種子萌發均有抑制作用。

根據朱銘瑋等[11]的研究結果，結合其他植物的相關研究結果，可以初步判斷，‘鳳丹’種子休眠的重要內源抑制物可能是油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸和鄰苯二酚。本研究僅就這5種物質對白菜種子發芽的有效抑制作用進行試驗，結果發現，油酸對白菜種子發芽沒有影響，而其他4種物質的抑制中濃度不同，其抑制效果由強至弱依次為鄰苯二酚＞亞油酸＞棕櫚酸＞硬脂酸，鄰苯二酚、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸溶液抑制白菜種子發芽的中濃度分別為12.13、137.41、460.26、972.75 mg/L。

3.3 休眠解除過程中‘鳳丹’種子中抑制物質含量的變化規律

研究結果表明：‘鳳丹’種子在解除休眠的過程中，其種子中被檢測的鄰苯二酚、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸這4種內源抑制物的含量均呈逐漸下降的變化趨勢。但是，每個層積階段各種抑制物質的含量變化規律不盡相同：胚根突破種皮的Ⅲ階段，鄰苯二酚含量基本沒有變化，其余3種抑制物質含量的下降幅度由大到小的順序為：亞油酸（37.92%）＞硬脂酸（24.36%）＞棕櫚酸（15.5%）。這3種抑制物質對‘鳳丹’種子胚根突破種皮可能有一定程度的影響，其中亞油酸的影響最大。在其隨后的層積過程中，僅有亞油酸在Ⅴ階段的含量比其在Ⅱ、Ⅲ與Ⅳ階段的含量略有回升，但其在Ⅱ、Ⅲ與Ⅳ階段的含量差異不顯著，其他抑制物質的含量均顯著下降。層積至Ⅴ階段時，棕櫚酸、硬脂酸的含量均顯著低于其在Ⅲ階段的含量，分別下降了25.1%、32.0%。在此層積過程中，鄰苯二酚在休眠解除的最后一個階段的含量突然降為0，與其在層積處理前的含量相比，下降顯著。因此，棕櫚酸、硬脂酸、鄰苯二酚這3種抑制物質可能是引起‘鳳丹’種子上胚軸休眠的主要抑制物質。

朱銘瑋等[11]對‘鳳丹’種子內源抑制物的GC-MS鑒定結果表明，‘鳳丹’種子中除了上述抑制物質之外，還有一些未知的抑制物未被鑒定出來，因此，仍需采用其他技術進一步研究那些未知抑制物質是否對其種子的萌發有較大的影響。另外，一些植物內源激素（如脫落酸ABA）對種子萌發也會有重要影響，但采用GC-MS技術并不能鑒定出相關激素。因此，關于植物內源激素對‘鳳丹’種子萌發的影響問題還有待于進一步研究。

4 結 論

‘鳳丹’種子休眠解除過程中其種子中的抑制物對白菜種子發芽的影響程度不斷降低，當‘鳳丹’種子層積至Ⅲ階段時，白菜種子發芽率較對照的下降了49.5%；層積至Ⅴ階段時，浸提液對白菜種子發芽仍有較小的影響，但與對照相比其差異不顯著。油酸對白菜種子發芽無抑制作用，從IC50值來看，各種抑制物質對‘鳳丹’種子萌發的抑制效果的優劣順序為：鄰苯二酚＞亞油酸＞棕櫚酸＞硬脂酸?！P丹’種子層積至胚根突破種皮的Ⅲ階段時，其內源抑制物質含量的下降幅度的大小順序為：亞油酸＞硬脂酸＞棕櫚酸。種子層積至上胚軸出現的Ⅴ階段時，鄰苯二酚的含量降為0；棕櫚酸、硬脂酸的含量均顯著降低，較其在Ⅲ階段時的含量分別下降了25.1%、32.0%。因此，棕櫚酸、硬脂酸、鄰苯二酚這3種抑制物質可能是引起‘鳳丹’種子上胚軸休眠的主要抑制物質。