基于HPLC-Q-TOF-MS的非那雄胺原料雜質結構及來源分析*

鄧 鳴，曾慶花，朱健萍，盧日剛

(廣西壯族自治區食品藥品檢驗所，廣西南寧 530021)

非那雄胺(Finasteride)化學名稱為N-叔丁基-3-氧代-4-氮雜-5α-雄甾-1-烯-17β-甲酰胺，分子式為C23H36N2O2。非那雄胺最早由美國默沙東公司開發研制，1991年獲準上市。非那雄胺是一種合成的甾體激素化合物，它是雄激素睪酮代謝為雙氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT)過程中的細胞內酶Ⅱ型5α還原酶的特異性抑制劑，具有抑制睪酮代謝的作用。良性前列腺增生(Benign Prostate Hyperplasia，BPH，也稱為前列腺肥大)有賴于體內有效的雙氫睪酮的含量，即取決于前列腺中睪酮向DHT的轉化。非那雄胺能有效降低血液和前列腺內的DHT濃度。目前非那雄胺制劑有5 mg和1 mg兩種規格，前者適應證為治療和控制良性前列腺增生及相關癥狀，后者用于治療男性脫發[1,2]。

經查閱各國藥典，非那雄胺被《中華人民共和國藥典：2020年版·二部》[3]、EuropeanPharmacopoeia(《歐洲藥典》)10.0版[4]、UnitedStatesPharmacopeia(《美國藥典》)2022年版[5]收載，均采用高效液相色譜(High Performance Liquid Chomatography,HPLC)法檢查有關物質。其中《歐洲藥典》10.0版該品種項下給出了雜質A、雜質B、雜質C的結構?！吨腥A人民共和國藥典:2020年版·二部》中雜質I即為《歐洲藥典》10.0版中的雜質A，在以下的敘述中該雜質均以雜質A表示。

文獻[6-9]采用高效液相色譜法分離非那雄胺雜質。近年來,液質聯用技術已日臻成熟,并被廣泛應用于藥物中雜質的結構鑒定及來源分析[10-14]。本研究擬采用高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法(High Performance Liquid Chromatography- Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS)研究非那雄胺的雜質，并通過分析非那雄胺的裂解特征，與已知雜質對照品比對，通過強制降解試驗等途徑對其中的主要雜質進行結構推斷，推測雜質可能的來源，以期為藥品雜質控制和工藝優化提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Waters Xevo G2 Q-TOF液質聯用儀(美國Waters公司),MILLI-Q去離子水發生器(美國Millipore公司),XS205DU 電子天平[梅特勒托利多科技(中國)有限公司]。

非那雄胺對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100611-201503，含量99.7%)，雜質I (雜質A)(中國食品藥品檢定研究院，批號420023-201501)，雜質B(Toronto Research Chemicals Inc.，批號Y11M10W86170)，雜質C (Toronto Research Chemicals Inc.，批號Y11M10W86171)。

非那雄胺原料來源于國內兩個廠家，A廠家及B廠家各1批。乙腈為色譜純試劑，水為超純水，其他試劑為分析純。

1.2 溶液的制備

混合對照品溶液：稱取非那雄胺對照品、雜質A、雜質B、雜質C對照品各約1 mg，置50 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液：稱取非那雄胺原料(A廠家或B廠家)約10 mg，置10 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

1.3 強制降解試驗

取非那雄胺原料(A廠家)約50 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。

精密量取貯備液1 mL，置于5 mL量瓶中，加1 mol/L鹽酸溶液1 mL，放置5 h，加入1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL中和，加50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得酸破壞溶液。

精密量取貯備液1 mL，置5 mL量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，放置2 h，加入1 mol/L 鹽酸溶液1 mL中和，加50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得堿破壞溶液。

精密量取貯備液1 mL，置5 mL量瓶中，加30%過氧化氫溶液1 mL，放置1 h，加入50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得氧化破壞溶液。

取非那雄胺原料(A廠家)適量，置120℃烘箱中加熱5 h，放冷，稱取約10 mg置10 mL量瓶中，加入50%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得高溫破壞溶液。

取非那雄胺原料(A廠家)適量，置4 500 lx光照條件下放置48 h，稱取約10 mg置10 mL量瓶中，加入50%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得強光破壞溶液。

1.4 色譜與質譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：資生堂Capell-MGⅡ C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)；流動相為乙腈∶水(45∶55)，流速：1.0 mL·min-1；柱后分流，檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進樣量：2 μL。

1.4.2 質譜條件

離子化方式：ESI(+/-)；數據采集質荷比(m/z) 80-800；干燥氣溫度：350℃；脫溶劑氣(N2)流速：6.0 L·min-1；碰撞電壓：10-30 eV；毛細管電壓:4.5 kV。

2 結果與分析

2.1 非那雄胺高效液相色譜圖及雜質來源分析

將非那雄胺供試品溶液、強制降解溶液進樣后，主峰與各雜質峰分離良好。供試品溶液中主要有15個峰，按保留時間順序命名為雜質1-15 (圖1)。強制降解試驗結果表明，非那雄胺在氧化、光照、高溫條件下較穩定，未產生明顯的降解產物；強酸破壞時雜質4含量明顯增大，雜質6和雜質8含量有小幅度增大；強堿破壞時雜質2增大；高溫破壞時雜質C含量有小幅度增大。因此雜質1，3，5，7，9，10，11，12，14，15為工藝雜質，雜質2，4，6，8和C可能是降解雜質，也可能是工藝雜質。通過分析雜質的來源，提示企業應優化生產工藝，并在貯藏及運輸過程中控制溫度，減少非那雄胺降解反應的發生。

a:Mixed solution of reference substances;b:Finasteride (A manufacturer);c:Finasteride (B manufacturer);d:Acidic hydrolysis;e:Alkaline hydrolysis;f:Oxidative degradation;g:Photolytic degradation;h:Thermo degradation；number 1-15：Impurity 1-15圖1 對照品混合溶液、原料供試液及強制降解溶液高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference solution,raw test solution and forced degradation solution

2.2 非那雄胺主要雜質的結構鑒定

雜質結構與主藥往往具有相關性，通過分析非那雄胺二級質譜裂解規律并結合破壞試驗推測雜質1，2，5，6，8，10，13，14等8種雜質的結構，其中雜質10，13分別對應《歐洲藥典》10.0版的特定雜質A、C，其他7種雜質因含量過低或受其他因素干擾，未推斷出結構。為了確證所推斷的機理，對推斷的雜質均進行了高分辨數據分析(表1) 。

表1 雜質準分子離子理論值與實驗值的偏差計算Table 1 Deviation calculation of theoretical values and experimental values of the impurities in MS2

2.2.1 非那雄胺

非那雄胺準分子離子m/z為373.286 4，其二級質譜碎片中主要的碎片峰為側鏈斷裂后,脫掉分子量為56的叔丁基形成m/z為317.223 4的碎片離子，其側鏈還可繼續斷裂生成m/z分別為299.214 9，282.186 6，272.204 3的碎片離子，母核結構中的氮雜環開環后脫去質量數為68的C4H4O后可形成m/z為305.259 9的碎片離子，該碎片離子進一步脫去側鏈的基團后可生成m/z分別為187.148 6，215.142 0的碎片離子，但豐度均較少，其二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖2。

圖2 非那雄胺[M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.2 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and fragmentation pathway of finasteride

2.2.2 雜質13

在HPLC-UV-Q-TOF-MS中，雜質13的液相保留時間、紫外光譜圖、準分子離子(m/z為371.269 1)及二級質譜均與雜質C對照品一致，因此確證雜質13為雜質C。

雜質C為非那雄胺合成過程的中間產物。雜質C的裂解方式與非那雄胺類似，側鏈斷裂后可形成m/z分別為315.206 3，298.184 5，270.185 3，280.169 6的碎片離子，母核結構中的氮雜環開環后脫去C4H4O后可形成m/z為303.247 3的碎片離子。母核結構中的C5與C6為雙鍵，易脫去C上的甲基，形成具有共軛雙鍵的碎片結構，該碎片離子的m/z為355.236 9。雜質C二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖3。

圖3 雜質13 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.3 Impurity 13 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.3 雜質10

雜質10的液相保留時間、紫外光譜圖均與《歐洲藥典》10.0版收載的雜質A對照品一致。在HPLC-UV-Q-TOF-MS中該雜質的準分子離子(m/z為375.301 7)及其二級質譜中各子離子的質荷比、豐度也與雜質A對照品基本一致，因此確認雜質10為雜質A。

雜質A的裂解方式與非那雄胺類似，側鏈斷裂后形成的碎片離子以及母核結構中的氮雜環開環后形成碎片離子。雜質A二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖4。

圖4 雜質10 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.4 Impurity 10 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.4 雜質1

雜質1在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為389.282 1，較非那雄胺的準分子離子質荷比約多16，推測為多一個氧原子，其二級譜圖中出現了較母離子少72的碎片離子，推測非那雄胺結構中的叔丁基氧化為叔丁醇。雜質1的裂解方式與非那雄胺類似，二級圖譜中有側鏈斷裂后形成的碎片離子以及母核結構中的氮雜環開環后形成碎片離子，此處不再贅述。雜質1二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖5。

圖5 雜質1 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.5 Impurity 1 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.5 雜質2

雜質2在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為391.297 2，與非那雄胺的m/z相差約18，且其二級質譜出現M+H-56的碎片峰，推測該雜質為非那雄胺的氮雜環水解開環后生成的雜質。其二級質譜出現m/z為373.288 2的碎片為羧酸與氨基重新環合生成的。雜質2二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖6。

圖6 雜質2 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.6 Impurity 2 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.6 雜質3

雜質3在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為387.264 4，與非那雄胺的m/z相差約14，推測可能的分子式為C23H34N2O3，其二級質譜出現M+H-54、M+H-68的碎片峰，未出現M+H-56的碎片峰，因此推測雜質3具有與非那雄胺相同的氮雜環，而側鏈部分結構發生改變。另外，雜質3二級質譜中的碎片離子與非那雄胺均不一致，推測其母環結構與非那雄胺不同，根據現有的信息無法推測碎片離子的組成，因此未能推斷其結構。

2.2.7 雜質4

雜質4在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為389.278 8，與非那雄胺的m/z相差約16，推測可能的分子式為C23H36N2O3，其二級質譜出現M+H-56的碎片峰，未出現M+H-68的碎片峰，因此推測雜質4母核結構與非那雄胺不一致。根據現有的信息無法推測碎片離子的組成，因此未能推斷其結構。

2.2.8 雜質5

雜質5在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為387.264 4，與非那雄胺的m/z相差約14，其二級質譜出現M+H-56、M+H-68碎片峰，未出現M+H-73的碎片峰，而出現了M+H-87，因此雜質5側鏈上的叔丁基結構未變，而N上多一個甲基。雜質5二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖7。

圖7 雜質5 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.7 Impurity 5 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.9 雜質6

雜質6在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為391.297 9，與非那雄胺的m/z相差約18。雜質6二級質譜出現M+H-56、M+H-73碎片峰，未出現M+H-68的碎片峰，因此推測雜質6為非那雄胺母核氮雜環發生了變化。雜質6二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖8。

圖8 雜質6 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.8 Impurity 6 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.10 雜質8

雜質8在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為389.280 5，與非那雄胺的m/z相差約16。雜質8二級質譜出現M+H-56、M+H-68碎片峰，而其他碎片離子均與非那雄胺不一致，由于N原子可能會被氧化，因此推測雜質8為非那雄胺母核氮雜環形成了氮氧化物。雜質8二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖9。

圖9 雜質8 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.9 Impurity 8 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.11 雜質9

雜質9在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為389.279 2，與非那雄胺的m/z相差約16。雜質6二級質譜出現M+H-56的碎片峰，未出現M+H-68的碎片峰，因此推測雜質9為非那雄胺母核氮雜環發生了變化，可能為雙鍵氧化成酮基。雜質9二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖10。

圖10 雜質9 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.10 Impurity 9 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.12 雜質11

雜質11在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為371.270 0，與非那雄胺雜質C的分子量一致。雜質11的二級質譜與雜質C部分一致，都出現m/z分別為298，280，270的碎片峰，因此推測雜質11為非那雄胺母核碳碳雙鍵位置不同，已有信息無法判斷雙鍵的位置，因此未能推斷其結構。

2.2.13 雜質14

雜質14在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為387.301 5，與非那雄胺的m/z相差約14。雜質6二級質譜出現M+H-68、M+H-70的碎片峰，未出現M+H-56的碎片峰，因此推測雜質14為非那雄胺側鏈N原子被2-甲基丁基取代。雜質14二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖11。

圖11 雜質14 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.11 Impurity 14 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.14 其他雜質

雜質7，12和15由于峰響應較低，未能推斷其結構。

3 結論

本文采用HPLC-TOF-MS對兩家非那雄胺原料生產企業的產品進行比較分析，發現兩家生產的非那雄胺其雜質的種類及含量存在一定差異；鑒定出8種雜質的結構，并推測了部分雜質的來源，可為非那雄胺雜質控制和工藝優化提供參考依據。