不同濃度氮處理毛竹水通道蛋白基因表達模式及其調控網絡

朱成磊 林澤銘 李天闊 高志民

(國際竹藤中心竹藤資源基因科學與基因產業化研究所，國家林業和草原局/北京竹藤科學與技術重點開放實驗室 北京 100102)

氮是影響植物生長的重要營養元素，水分平衡是植物生長不可或缺的基礎條件。植物體內水和氮運輸之間的關系錯綜復雜，從蒸騰驅動的土壤中的物質流動，到通過膜轉運器和通道被根系吸收并運輸到地上器官，涉及水分調節和氮運輸的信號級聯、根系構型和栓化的疏水根屏障、質外體水和氮向維管系統遷移控制等許多方面。植物對氮等大量營養元素的可利用性在很大程度上受土壤中可供水量的調節，在干旱時植物生長同時受水和氮的限制[1]。土壤氮添加能夠增加葉片和葉肉細胞厚度、單位葉面積細胞間隙暴露的葉肉表面積和氣孔開放狀態，提高葉片氮含量、水通道蛋白(AQP)和碳酸酐酶活性，顯著促進葉肉和氣孔導度的增加[2]。研究顯示，當大麥(Hordeumvulgare)葉片中氮含量減少時，AQP基因(HvTIPs)表達上調，表明它們參與了氨和尿素的液泡卸載[3]；氮的吸收和同化同時發生在單穗果子蔓鳳梨(Guzmaniamonostachia)的單個葉片中，在葉基部通過脲酶和硝酸還原酶吸收氮和生產銨，硝酸鹽和銨的高親和轉運蛋白(NRT2.5和AMT1.2)、尿素轉運蛋白(DUR3)和水通道蛋白(TIP2.1)基因上調，而在葉尖中硝酸鹽和銨的低親和轉運蛋白(NRT1.2和AMT3.1)、水通道蛋白(PIP1.2)基因呈高表達[4]。由此表明，在植物生長中氮轉運蛋白基因和水通道蛋白基因的表達存在密切的關聯性。

水和氮對作物生產力的影響超過了其他大多數環境因子[1]。在全球氣候變化日趨明顯的背景下，植物獲取充分的氮素營養并維持細胞水分平衡，是維持植物正常生長的關鍵。研究表明，植物AQP能夠促進尿素通過膜的擴散，如高大鸚哥鳳梨(Vrieseagigantea)的VgTIP2；1除了運輸水外還能運輸尿素，而VgPIP1；2可能促進銨/氨的擴散[5]。竹子具有生長速度快、材質優良和適應范圍廣的突出特點，通過施肥可以實現竹子的高產。目前，對竹子中氮吸收、運轉的基因[6-8]和水通道蛋白基因[9-10]雖然已有一些報道，但對于在氮添加處理下AQP基因的表達模式以及氮運轉蛋白和AQP基因表達的轉錄調控尚未見報道。本研究利用前期項目組獲得的轉錄組數據，對不同氮濃度處理下毛竹(Phyllostachysedulis)AQP基因的表達模式進行分析，針對差異表達AQP基因分析其啟動子中的轉錄因子調控元件，進一步鑒定差異表達的轉錄因子(TF)，構建差異表達AQP基因和TF的共表達網絡，篩選關鍵的基因，并用轉錄組數據驗證，以期為后續開展基因功能提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取在人工氣候室[光周期為16 h光/8 h暗、光照強度為300 μmol/(m2·s)、溫度為28 ℃、濕度為60%]培養2個月左右、且生長狀態一致的毛竹幼苗用于實驗，將其根部清洗干凈，然后放入含有不同濃度KNO3(N0=0 mmol/L，N6=6 mmol/L，N18=18 mmol/L)的改性木村B溶液中培養2周[8,11]。隨后采收幼苗根系，經液氮處理后置于-80 ℃下保存。每個氮處理組包含3個生物重復。利用試劑盒從9個樣本中提取總RNA，進行轉錄組和小RNA測序。所有小RNA和轉錄組數據序列已存入NCBI數據庫(SRA)，項目編號為PRJNA797724 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA797724)(SRR17650178—SRR17650186)和PRJNA797734 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA797734)(SRR17635191—SRR17635199)[8]。

1.2 差異表達基因篩選和啟動子元件分析

為了鑒定N0、N6和N18處理之間的差異基因，利用DESeq2_EBSeq軟件對轉錄組數據中的差異基因(DEGs)進行篩選，篩選標準為Fold Change (|FC|)≥1.5和錯誤發現率(FDR)<0.05的DEGs?；谵D錄因子結合位點預測網站(http://plantregmap.gao-lab.org/binding_site_prediction.php)[12]，以水稻(Oryzasativa)為參考物種，篩選標準閾值p≤e-4、q≤0.05，對PeAQPs的1 000 bp啟動子區域的轉錄因子(TF)結合元件進行篩查。

1.3 相關性分析和共表達網絡構建

根據PeAQPs和TFs在氮處理條件下的表達模式，利用基迪奧在線分析平臺(https://www.omicshare.com/tools/home/report/reporticabg.html)，基于皮爾森相關系數(PCC)對PeAQPs和TFs間的相關性進行分析，篩選條件為：|cor|≥0.9和P≤0.05。利用Cytoscape (v.3.7.1)軟件構建TFs和PeAQPs的調控網絡并進行可視化展示。

2 結果與分析

2.1 不同濃度氮處理下PeAQPs的表達

利用不同濃度氮處理的毛竹根轉錄組數據，共鑒定到30個差異表達的PeAQPs，包括14個PePIPs、8個PeTIPs、7個PeNIPs和1個PeSIP2-1，分別占各亞家族成員的66.7%、42.1%、50.0%和33.3%(圖1A)。這些PeAQPs在不同濃度氮條件下表現出不同的表達模式，主要分為2類。第1類，隨著氮濃度的提高，基因上調表達；第2類，隨著氮濃度的提高，基因下調表達(圖1B)。在PePIPs亞家族的14個基因中，PePIP2-3、PePIP1-6、PePIP2-2、PePIP2-4、PePIP2-13、PePIP2-14和PePIP2-15為第1類，且PePIP2-3的表達量隨著氮濃度提高而上升，其余6個基因表達量為先上升后下降，但N18組仍然高于N0組；而PePIP1-2、PePIP1-3、PePIP1-4、PePIP2-6、PePIP2-8、PePIP2-11和PePIP2-12為第2類。在PeTIPs亞家族的8個差異表達基因中，PeTIP1-2、PeTIP4-2和PeTIP4-3為第1類，且PeTIP4-2的表達量隨著氮濃度提高而上升，PeTIP1-2和PeTIP4-3表達量為先上升后下降；PeTIP1-1、PeTIP2-1、PeTIP2-2、PeTIP2-3和PeTIP2-4為第2類。在PeNIPs亞家族的7個差異表達基因中，PeNIP1-1和PeNIP1-2為第1類；PeNIP1-3、PeNIP1-5、PeNIP2-2、PeNIP2-4和PeNIP3-3為第2類。PeSIP2-1基因的表達模式為第2類，隨著氮濃度的提高，基因持續下調表達。

注：A：基因表達數量；B：基因表達譜。圖1 PeAQPs在氮處理下的表達分析Fig.1 Expression analysis of PeAQPs under nitrogen treatments

2.2 PeAQPs啟動子的轉錄因子調控元件

為探究上述30個差異表達PeAQPs的調控機制，對基因啟動子中的TF調控元件進行分析。結果表明，在這些PeAQPs上游啟動子的1 000 bp序列中，除了4個基因(PeNIP1-5、PeTIP2-3、PeTIP2-4和PeTIP4-2)啟動子中未鑒定到TF調控元件外，其余26個PeAQPs啟動子中共鑒定出14種TF調控元件(圖2)。其中Dof轉錄因子結合位點在PeAQPs的啟動子中分布最廣，在20個基因啟動子中均鑒定到，包括11個PePIPs、5個PeNIPs和4個PeTIPs。其中PeNIP1-1和PeTIP4-1擁有最多的Dof結合元件，分別為12個和10個，其他基因啟動子中均擁有1～9個Dof的結合位點。BBR-BPC轉錄因子結合位點在PeAQPs的啟動子中分布最多，在12個基因(6個PePIPs、4個PeNIPs和2個PeTIPs)啟動子中共鑒定出117個結合位點，其中PePIP2-6、PePIP1-6和PeNIP1-3擁有最多的BBR-BPC結合元件，分別為35個、20個和23個，其他基因啟動子中均擁有1～9個BBR-BPC的結合位點(圖2A)。在5個PeAQPs的啟動子中鑒定出C2H2轉錄因子調控元件，其中PeTIP2-2啟動子中含有9個該元件。另外，在這些基因啟動子中還鑒定出bZIP、ERF、GATA、B3、MICK-MADS、MYB-Related、NAC、SBP、HSF、HD-ZIP和AP2等轉錄因子調控元件(圖2B)。

注：A：高峰度TF結合元件；B：低峰度TF結合元件。圖2 PeAQPs啟動子中的TF結合元件數量統計Fig.2 Statistics of the number of TF binding elements in the promoters of PeAQPs

在PePIPs亞家族中，PePIP1-6的啟動子鑒定出的轉錄因子結合元件最多，包括20個BBR-BPC元件、4個bZIP元件、4個MICK-MADS元件和2個Dof元件，以及2個HSF元件。另外，在PePIP2-6啟動子中，除了發現35個BBR-BPC元件外，還有3個C2H2元件以及1個Dof元件。在PePIP1-2、PePIP2-3、PePIP2-11和PePIP2-13啟動子中均只鑒定到1種TF元件，分別為4個BBR-BPC元件、3個Dof元件、1個ERF元件和4個B3元件。在其余8個PePIPs的啟動子中，均存在2～4種轉錄因子調控元件。在PeTIPs亞家族中，PeTIP1-2的啟動子中鑒定出4種TF元件，包括6個ERF元件、3個Dof元件、1個GATA元件和1個C2H2元件。在PeTIP2-1、PeTIP2-2和PeTIP4-1啟動子中也鑒定到Dof元件。而BBR-BPC元件在PeTIPs啟動子中分布并不廣泛，只在PeTIP1-1和PeTIP2-2中鑒定到6個和8個，在PeTIP1-1中還鑒定到NAC元件和B3元件。在PeTIP4-1的啟動子中只鑒定到10個Dof元件。在PeNIPs亞家族中，Dof元件和BBR-BPC元件的分布較多，在5個PeNIPs啟動子存在Dof元件，4個PeNIPs啟動子中存在BBR-BPC元件。其中PeNIP1-3啟動子中鑒定到23個BBR-BPC元件、4個ERF元件、1個MICK-MADS元件和1個C2H2元件，而PeNIP1-1的啟動子中只鑒定到12個Dof元件。PeNIP2-4中不僅含有5個Dof元件和1個BBR-BPC元件外，還有1個HD-ZIP元件。這些結果表明，PeAQPs不同亞家族成員含有的元件種類和數量都不盡相同，表明它們的表達可能受到不同轉錄因子的調控，表達的差異進而導致功能方面的不同。

2.3 差異表達TF的篩選和PeAQPs的共表達網絡

通過對轉錄組數據中差異表達基因的篩選和基于各個不同數據庫的注釋結果，在不同濃度氮處理下的差異表達基因中共篩選出979個差異表達轉錄因子(DETF)，在這些DETF中，包括AP2/ERF、Homebox、MYB、NAC以及bHLH等重要的TF家族。結合PeAQPs啟動子的轉錄因子元件分析結果進行進一步篩選分析，從中篩選出403個可能與PeAQPs有關的DETFs，它們大致可屬于10個基因家族，其中83個AP2/ERF包含14個AP2、64個ERF和5個RAV亞家族成員。30個C2C2包含20個Dof和10個GATA亞家族成員，在30個B3中還有20個ARF亞家族成員。此外，這403個DETF還包含74個NAC、48個C2H2、42個bZIP、30個HD-ZIP、23個HSF、22個MYB-related、13個SBP、7個MADs-MICK和1個BBR-BPC成員。推測這些DETFs在PeAQPs轉錄表達過程中發揮著重要的調控作用。相關性分析結果顯示，310個DETFs和30個PeAQPs之間形成3 249個共表達基因對，結合PeAQPs的啟動子TF元件結果，最終篩選出由21個PeAQPs和158個DETF形成的315對共表達關系的網絡。

2.3.1PePIPs共表達網絡分析

在PePIPs亞家族中，除了PePIP1-2、PePIP2-2和PePIP2-15未鑒定到共表達TF外，其余11個PePIPs與10個TF家族的83個DETF形成153個共表達關系對，包括91個正向共表達關系對和62個負向共表達關系對(圖3)。分析發現，除了PePIP2-11外，其余10個PePIPs均與14個Dof存在28對正向共表達和21對負向共表達關系。PePIP1-3和PePIP2-11分別與13個和10個ERF存在共表達關系，PePIP1-4與3個AP2正向共表達，與2個MYB-related負向共表達。在PePIP1-6、PePIP2-13和PePIP2-14啟動子中均鑒定到bZIP結合元件，基于轉錄組數據，也篩選到24個bZIP家族成員與這3個基因分別存在2個、24個和23個共表達關系。PePIP2-6與11個C2H2共表達，PePIP2-8與5個SBP和6個GATA共表達，這3個轉錄因子的調控元件在PePIPs的其他成員啟動子中均未鑒定到，推測這3個轉錄因子可能參與PePIP2-6和PePIP2-8的表達調控。

2.3.2PeTIPs共表達網絡分析

在PeTIPs亞家族中，PeTIP1-1、PeTIP1-2、PeTIP2-1和PeTIP4-1與49個DETF形成53個共表達關系對，包括34個正向共表達關系對和15個負向共表達關系對(圖4)。PeTIP1-1與1個B3和9個NAC正向共表達，與3個NAC負向共表達，而這2類TF與PeTIPs其他成員均無共表達關系。PeTIP1-2只與3個ERF正向共表達，且PeTIP1-2啟動子中有6個ERF結合位點，推測這3個ERF可能參與PeAQPs的氮響應過程。PeTIP2-1與6個Dof和12個bZIP正向共表達，與3個Dof和10個bZIP負向共表達。PeTIP4-1只與6個Dof存在共表達關系，且PeTIP4-1的啟動子中鑒定到10個Dof結合元件，推測Dof與PeTIP4-1的表達存在著密切關系。

圖3 PePIPs與TFs的共表達分析Fig.3 Co-expression analysis of PePIPs and TFs

圖4 PeTIPs與TFs的共表達分析Fig.4 Co-expression analysis of PeTIPs and TFs

2.3.3PeNIPs和PeSIPs共表達網絡分析

共表達結果顯示，5個PeNIPs與6個TF家族的86個成員形成107個共表達關系對，包括57個正向共表達關系對和50個負向共表達關系對(圖5)。PeNIP1-1和PeNIP1-2均只與Dof存在共表達關系，其中PeNIP1-1和PeNIP1-2均與7個Dof共表達，除此之外，PeNIP1-2還與1個Dof存在共表達關系。在這2個基因啟動子中，分別鑒定到12個和3個Dof結合元件。PeNIP1-3與48個TF共表達，包括22個ERF、4個MICK-MADS和22個C2H2，而在其啟動子中，也均存在這3種TF的結合元件。PeNIP2-2與8個Dof和8個MYB-related共表達，其中包括與3個Dof和2個MYB-related正向共表達。PeNIP2-4與7個Dof和21個HD-ZIP共表達。另外，PeSIP2-1的啟動子中只鑒定到GATA元件，且篩選獲得2個與其具有正向共表達關系的GATA基因，推測GATA基因對于PeSIP2-1的表達發揮著重要作用。

圖5 PeNIPs和PeSIPs與TFs的共表達分析Fig.5 Co-expression analysis of PeNIPs and PeSIPs with TFs

2.4 關鍵PeDofs與PeAQPs的相關性

分析發現，Dof轉錄因子與PeAQPs的3個亞家族成員(8個PePIPs、2個PeTIPs和4個PeNIPs)存在共表達關系，7個PeDofs與14個PeAQPs存在65對共表達關系，推測氮處理下PeDofs可能在毛竹根系水分運輸過程中發揮重要的調控作用(圖3—圖5)。結合TF結合元件的分析結果，PePIP1-3、PePIP2-13、PePIP2-14、PeTIP4-1、PeNIP1-1和PeNIP2-4等6個基因的啟動子中均具有5個及以上的Dof結合位點，推測這7個PeDofs通過調控6個PeAQPs的表達從而影響其水分和氮的吸收與轉運。相關性分析和共表達結果顯示(圖6)，PeDof_17788、PeDof_21000、PeDof_41006和PeDof_12766與PePIP1-3和PeNIP2-4正向共表達(cor≥0.92)，與PePIP2-13、PePIP2-14、PeTIP4-1和PeNIP1-1等基因負向共表達(cor≤-0.87)；PeDof_38007、PeDof_43753和PeDof_16228則與前4個Dof轉錄因子相反。另外，PeDof_21128只與PePIP1-4存在負向共表達關系。因此，推測這些PeDofs通過不同類型的調控方式影響PeAQPs的表達，從而影響水分和氮的協調運輸。

圖6 關鍵PeDofs與PeAQPs的相關性熱圖(A)及共表達網絡(B)Fig.6 Correlation heat map and co-expression network of key PeDofs and PeAQPs

3 討論

氮是一種重要的大量營養元素，是構成植物核酸、蛋白質、輔酶因子和植物激素的重要組成部分。氮對植物的生長發育起著決定性作用，它在植物葉片伸展以及開花過程中的作用已經得到了廣泛證實，在植物根系生長和發育過程中的功能也得到了深入研究。AQP是重要的跨膜通道蛋白，通過細胞和細胞器膜進行水分子的跨細胞運動，同時還參與輸送甘油、尿素、金屬類、二氧化碳、氮氣、過氧化氫和氨等小中性分子。因此，AQP在維持細胞內碳氮水平、轉運關鍵調控分子等方面均發揮關鍵作用[13]。不同濃度KNO3處理的毛竹中AQP基因表達差異變化表明，不同的AQP基因可能以不同的方式參與氮的運輸，另外差異表達的TF及其與AQP基因的共表達結果表明，這些TF在受不同氮處理影響的同時，還參與AQP基因表達的調控，進而參與毛竹體內的水分和氮的運輸，以維持水分平衡和氮分配。

研究表明，AQP基因的表達除受TF調控外，還受到miRNA的調節以及蛋白修飾的影響。如在小麥中tae-miR1131與tae-miR408剪切抑制TaPIP1的表達，熱激蛋白TaHSP90可與TaPIP1相互作用[14]。水稻葉片中水和氮平衡的機制引起參與膜轉運的蛋白質的廣泛變化，包括水通道蛋白OsPIP2-6的磷酸化[15]。在高濃度氮處理下玉米根系導水率的快速變化與質膜中的PIP蛋白豐度相關，表明PIP翻譯后機制在根系水動力學參數的短期調節中發揮著重要作用[16]。另外，激素信號也能調節AQP基因的表達。在大麥所有HvTIPs基因啟動子區域中均含有茉莉酸甲酯(MeJA)誘導的順式作用基序，MeJA處理導致大麥葉片中氮含量下降[3]。外源脫落酸(ABA)處理，能夠增加大麥莖的導水率和HvPIP2的表達豐度[17]。在大豆GmTIP1;6基因啟動子中含有ABA和MeJA順式作用元件，其表達受ABA和MeJA的強烈誘導[18]。因此，要深入解析竹子快速生長中AQP的作用機制，還需要考慮miRNA的調節、AQP翻譯后修飾以及不同激素的影響。