生物轉化玉米漿生產生物菌肥的共生發酵特性

任曉潔，班 恒，賀壯壯，王曉龍，趙玉斌，宋元達，趙新河,,5

·農業生物環境與能源工程·

生物轉化玉米漿生產生物菌肥的共生發酵特性

任曉潔1,2，班 恒1，賀壯壯1，王曉龍3，趙玉斌4，宋元達1，趙新河1,4,5※

（1. 山東理工大學農業工程與食品科學學院考林臘特列杰微生物脂質國際研究中心，淄博 255000；2. 山東福洋生物科技股份有限公司，德州 253000；3. 中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；4. 魯洲生物科技有限公司，臨沂 276400；5. 山東大學微生物技術國家重點實驗室，青島 266237）

玉米深加工是全球第二大宗農產品加工行業，玉米淀粉制備過程中產生大量的副產物，如玉米漿（Maize Steep Liquor, MSL）。玉米漿色深味重、毒素含量高、處理困難，已經成為眾多玉米深加工企業發展的桎梏。該研究主要利用玉米漿中豐富的速效氮源和微生物的促生長因子進行微生物菌肥的開發。通過對前期篩選到的3株植物根際促生菌（PGPMs）的共生發酵研究，評估了3種菌在玉米漿中高密度發酵的可行性，并對發酵特性進行了研究。試驗結果表明，3種菌通過共生發酵，并在模擬流加工業廢料結晶糖母液作為補料時，發酵體系中的總生物量從6.6×109提升到了2.17×1010CFU/mL，并在52 h氨基酸態氮含量達到最大。同時，采用葡萄糖模擬結晶葡萄糖母液流加補料顯著提高了共生體系的總糖以及溶磷的利用率，可溶性磷利用率提高了近50%；此外，添加葡萄糖還能保持發酵體系的pH值穩定，奠定了生產穩定性。該研究為玉米漿的再利用提供了一種解決方法，對低成本生物肥料的開發與生產提供了一種新的思路。

菌；發酵；玉米漿；生物菌肥；根際促生菌；微生態

0 引 言

玉米淀粉是目前生產葡萄糖漿和各種糖類衍生物的主要資源[1]。玉米深加工通過浸泡、粉碎、篩分、干燥、濃縮、洗滌、萃取等工藝，得到大量的玉米淀粉，此外還產生了粗纖維飼料、玉米蛋白粉、玉米漿等大宗副產品[2]。而玉米漿（Maize Steep Liquor，MSL）是玉米淀粉濕磨加工過程中經過亞硫酸浸泡后產生的廢水濃縮而成的一類高濃度有機廢水[3]。它含有豐富的蛋白質、氨基酸和促生長因子等營養物質[4]，常作為飼料等營養補充劑以及發酵工業廉價氮源[3-6]。但因其高氨氮、高化學需氧量、高酸度的特性，限制了其廣泛應用。生物菌肥是利用微生態學原理，用特定功能微生物在適合的載體上經過發酵而成，含有大量的有益微生物以及其他活性物質，能夠促進植物生長的一類活菌制劑[7]。玉米漿中豐富的速效氮源和促生長因子可以提高微生物細胞量生長[8]。

然而玉米漿是一種復雜的多相體系，由多種可溶性物質和低溶解度的固相（如不溶性磷酸鈣鎂鹽等）組成，并且玉米漿中毒素含量頗高，其中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素是玉米漿中主要毒素成分，是玉米漿質量的關鍵控制點[9]。多數研究把少量玉米漿作為促生長因子和廉價氮源添加到發酵介質中，過量的玉米漿添加會導致發酵培養基氮的過量，對產物的合成造成不良影響[10]。到目前為止，在玉米漿中這一多相體系的發酵特征在實際生物利用過程中被忽視。微生物肥料作為一種有益的土壤修復和營養補充物，在生態農業中扮演重要的角色。例如，Xu等[11-14]分別將甘薯淀粉廢水、木薯廢料和味精副產物轉化為生物肥料。因此，利用玉米漿開發生物菌肥，不僅能夠利用土壤以及微生物對毒素的緩釋和降解作用，解決玉米漿的難利用問題，還可以降低菌肥生產成本，提高附加值。

除了培養基原料外，菌種也是是決定生物發酵及產品好壞的關鍵因素，不同菌種其發酵特性差異極大。在已有的生物肥料的報道中大部分菌肥都是針對于一種植物或者農作物的生長影響，整體來說缺乏適用性，研究意義比較局限。本研究最終篩選了枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和黑曲霉為目標菌株。Kayasth等[15-16]鑒定地衣芽孢桿菌是開發多功能生物肥料的理想菌株，它能產生吲哚乙酸（Indole Acetic Acid, IAA）、鐵螯合劑、溶解磷酸鹽，并具有促進植物生長的特性。大量研究證實枯草芽孢桿菌在IAA生產、生物防治、土壤恢復等方面促進植物生長[17-19]。此外，由于目前國內外施用無機肥料還是種植農作物的主要施肥方式，不僅增加了成本，還導致土壤酸化、壓實、地下水污染等對環境的負面影響[20]，另一方面，當前生物肥料的研究并不成熟，所以研發一種適用性廣且使用有益微生物和有機垃圾組成的的低成本生物肥料對現代社會來說仍然是一個迫切的挑戰。

所以本研究以玉米漿為主要原料，通過共生發酵技術探究枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉在玉米漿中共生發酵過程，同時以葡萄糖模擬淀粉廠廢液——結晶糖母液[21]，模擬評估3菌種在流加結晶糖母液的玉米漿中高密度發酵時細胞生長及發酵特性，為進一步高蛋白質類廢棄物——玉米漿的利用拓寬市場，為玉米淀粉加工企業廢棄物的高附加值再利用提供了參考；為以多種細菌為基礎開發實用型菌肥奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

前期工作從生物菌肥工業生產菌種中篩選到了9株功能性菌株，分別在解磷和產酸、降解大分子含氮物等方面效果顯著，且經過共生發酵菌群組合研究篩得到3株沒有拮抗作用且能相互促進的菌種，分別為枯草芽孢桿菌（3301）、地衣芽孢桿菌（F18）和黑曲霉（3324），由山東理工大學食品科學與工程綜合實驗室保藏。

1.2 試驗材料

玉米漿（MSL）由魯洲生物科技有限公司提供。在經過一系列測定可得MSL的pH值以及各類營養物質的質量比；pH值為（4.3±0.1），蛋白質含量可達17.2%（干基蛋白質51.1%），總糖含量為4.52%±0.1%（質量比），灰分含量達到7.46%，含水量為67.14%，波美度濃度為21°Bé。

由于玉米漿中含有豐富的蛋白質、氨基酸等氮元素，其蛋白質質量分數可達17.2%，因此，常作為發酵工業的優質氮源。然而玉米漿中的碳源含量相對較低，總糖質量分數只有4.52%±0.1%，因此為了保證微生物生長所需的碳氮平衡，對比了玉米漿中補充適量碳源是否有利于供試菌株生長。本試驗選取了葡萄糖（40 g/L）作為補料，用其來模擬玉米淀粉廠的廢液（結晶葡萄糖母液）[21]。

種子培養基：牛肉膏蛋白胨（Nutrient Broth）培養基[22]，pH值為7；改良馬丁培養基[23]，pH值為6.2～6.6。

細菌計數培養基：牛肉膏蛋白胨（Nutrient Broth）培養基（用于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌計數），pH值為7；真菌計數培養基：孟加拉紅培養基[24]（Rose Bengal Medium）（用于黑曲霉計數），pH值為7。均使用稀釋平板法進行計數。

搖瓶培養發酵培養基：200 g/L玉米漿；發酵罐分批培養發酵培養基：前期試驗200 g/L玉米漿在發酵罐中產生大量泡沫影響發酵過程，因此選用100 g/L玉米漿；采用氫氧化鉀作為pH中和劑調節初始pH值為6.5，121 ℃滅菌20 min。

1.3 種子培養

分別從斜面菌種刮取2環菌落接種至種子培養基中，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌接種至牛肉膏蛋白胨（NB）培養基，37 ℃，160 r/min，搖瓶培養18～20 h；黑曲霉接種至改良馬丁培養基，30 ℃，160 r/min，搖瓶培養24 h。

1.4 發酵培養

搖瓶培養：搖瓶培養發酵培養基，分裝于250 mL三角瓶，每瓶裝液量50 mL，將3種菌株種子液按照10%接種量接入發酵培養基中，另外在對照組中添加葡萄糖（40 g/L），分別于30 ℃，160 r/min，搖床培養72 h。

5 L發酵罐（5 L全自動發酵罐，迪必爾生物工程有限公司）分批培養：配制分批培養發酵培養基，按5%接種量將黑曲霉種子液接入5 L發酵罐中；初始通氣量2 L/L·min；攪拌轉速300 r/min；通過自動流加2 M氫氧化鉀和硫酸控制pH值為6.5；培養溫度30 ℃；培養24 h后，分別以質量分數5%的接種量接入枯草芽孢桿菌和地衣芽胞桿菌種子液，調整通氣量為4 L/(L·min)，流加氫氧化鉀調節pH值為7，培養溫度為37 ℃。

葡萄糖流加方式：發酵24 h后，將濃度為40%的葡萄糖按照10 mL/h的流加速度補入；流加周期24 h。

1.5 分析方法

有效活菌數采用稀釋平板法測定；氨基酸態氮按照國標GB/T 5009.235-2016甲醛滴定法測定；溶磷采用鉬藍分光光度法測定；溶氧、酸堿流加量測定采用發酵罐系統在線測定；葡萄糖濃度和谷氨酸濃度采用生物傳感儀測定（SBA－40C，山東省科學院生物研究所）。

流變特性分析使用配備有一對同軸圓柱體的Kinexus Lab +旋轉流變儀（英國Malvern儀器）測定，內徑和外徑分別為25和27.5mm，在25℃下以0.1～50 s-1的剪切速率在線性黏彈性區中評估黏度。黏彈性數據由Ostwald de Waale模型擬合

=Kγ-1（1）

式中為表觀黏度，Pa·s；為剪切速率，s-1；是一致性指數，是提供有關受剪切速率影響的流動行為信息的指數。

在25 ℃下從0.1～10 Hz進行頻率掃描。測量了儲能模量（）和損耗模量（）之間的關系。

發酵特性計算式如下：

?AAN=C?C0（2）

?P=C?C0（3）

?T.S=C?C0（4）

?R.S =C?C0（5）

式中C為發酵液中總糖含量，C為發酵液中可溶性磷含量，C為發酵液中氨基酸氮（AAN）含量，C為發酵液中還原糖含量，C0、C0、C0、C0分別代表未接種微生物時MSL培養基的初始磷、氮、總糖、還原糖含量，?T.S，?R.S為總糖和還原糖消耗量，單位均為mg/L。

2 結果與分析

2.1 3種功能菌種在玉米漿中純培養的發酵特性

首先分別對這3株菌在玉米漿中純培養的特性進行了研究和優化。之后試驗分別將供試菌株（枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉）接種在有無添加葡萄糖的玉米漿培養基中，各菌株的發酵特性如表1所示。

在純玉米漿培養基中發酵72 h后，3株菌分別達到了最高活菌數，其中枯草芽孢桿菌的活菌數最高，達3.05×109CFU/mL，地衣芽孢桿菌活菌數達到1.8×109CFU/mL，黑曲霉活菌數為3.5×106CFU/mL。在以40 g/L葡萄糖流加補料后，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌活菌數均升高，尤其是地衣芽孢桿菌活菌數提升明顯，最高達到1.79×1010CFU/mL。添加葡萄糖作為補料明顯促進了枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的細胞量。相反地，黑曲霉的活菌數變化量不大，說明添加葡萄糖可以有效提高整個體系內的細胞數量。

表1中數據可得3種菌株對玉米漿中碳源的消耗情況?？梢钥闯鲭m然3菌株單獨培養時，對玉米漿中總糖的利用率都不足60%，但是黑曲霉對玉米漿中糖源的利用率明顯高于其他菌株。

圖1a為活菌數分析，3種細菌在MSL培養基均有增長，表明生長態勢較好。

表1 葡萄糖對菌體在玉米漿中發酵特性

注：ΔAAN為氨基酸態氮變化量；ΔP為可溶性磷消耗量，%；ΔT.S為總糖消耗量，%；pH；ΔR.S為還原糖消耗量，%；±代表標準差，下同。

Note: ΔAAN is change of amino acid nitrogen; ΔP is phosphorus change, %; ΔT.S is total sugar consumption, %; pH is pH value; ΔR. S is consumption of reducing sugar, %; ±, The standard deviation, the same below.

圖1 三種細菌在MSL培養基中培養的活菌數，氨基酸態氮變化量（ΔAAN），磷變化量（ΔP）和pH 值情況的變化

圖1b顯示3菌株均可提高玉米漿中游離氨基酸態氮的含量，可將玉米漿中蛋白質分解為游離氨基酸。尤其是地衣芽孢桿菌的氨基酸態氮含量增加量最高，達到600 mg/L。但是根據表1中的數據可得，添加葡萄糖后3菌株的氨基酸態氮含量明顯降低，該情況可能是葡萄糖的添加使微生物生長速度加快，細胞量的增加加速了玉米漿中氨基酸態氮的消耗，從而降低了氨基酸態氮的含量；并且隨著發酵的進行，氨基酸也會參與到一些生理生化反應中，所以氨基酸總量會不斷減少。

玉米漿中不僅含有豐富的蛋白質資源，同時含有豐富的磷元素。玉米漿中磷以植酸的形式存在，植酸可與玉米漿中的 Ca2+、Mg2+、蛋白質等鰲合形成不溶性鹽，影響微生物對營養物質的利用[25]。圖1c表示了3菌株對玉米漿中溶磷的利用情況，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌能夠有效利用玉米漿中的有機磷用于自身細胞生長，尤其是地衣芽胞桿菌發酵玉米漿后溶磷含量降低最多。另外，只有黑曲霉的可溶性磷含量在添加葡萄糖后呈現正效應，說明葡萄糖的添加可以提高黑曲霉對玉米漿中部分不溶性有機磷轉化為溶磷的轉化率。

圖1d看出黑曲霉發酵液的pH值明顯低于其他菌株。同時，添加葡萄糖后各菌株發酵液pH值明顯降低，尤其是黑曲霉降低最明顯，最低pH值可達到5.5。發酵液pH值與可溶性磷含量基本呈現負相關。說明添加葡萄糖后，黑曲霉產生較多的有機酸，降低發酵液pH值，有機酸可以促進不溶性磷酸鹽的溶解?？傊?，枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌和黑曲霉能夠較好的利用玉米漿中營養物質，玉米漿可作為3種菌株的營養基質。同時，添加葡萄糖后明顯提高了各菌株的糖利用率，增加了各菌株的生物量，說明在玉米漿中添加葡萄糖可以進一步促進微生物的生長。該試驗結果為玉米淀粉廠廢液（結晶葡萄糖母液）的利用提供了思路，將玉米淀粉企業的玉米漿與結晶葡萄糖母液聯合利用，可以作為微生物菌肥開發的廉價原料。

2.2 共生發酵過程中流加葡萄糖顯著提高玉米漿菌肥活菌數

不同菌株在生長對數期存在差異，所以采用普通的接種方式會導致枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和黑曲霉共生發酵過程中活菌數較低，難以獲得最大細胞數。因此，根據3種菌株在玉米漿培養基中的生長曲線，采用延遲接種的方法以獲得最大活菌數。在5 L發酵罐中分批培養，評價3種菌株在玉米漿多相體系中共生發酵過程中生長變化，即先在玉米漿中接種黑曲霉培養24 h，再接種枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，每隔6 h取樣測定各菌株活菌數，共生發酵過程中細胞變化曲線如圖2所示。

圖2 3種菌共生發酵過程活菌數變化情況

圖2a為不添加碳源的玉米漿3菌株細胞變化曲線，3種菌株的細胞生長均呈現先增長后降低的趨勢，枯草芽孢桿菌在24 h接種后開始迅速生長，在30 h細胞量最高為3.05×109CFU/mL。緊接著黑曲霉在接種后40 h左右到達最高值，達1.25×109CFU/mL。最后地衣芽孢桿菌細胞量在50 h達到最高值3.25×109CFU/mL。

圖2b為流加了40%濃度葡萄糖的3菌株細胞變化曲線，3種菌株到達最高生物量的順序與未添加葡萄糖的一致，均呈現枯草芽孢桿菌先到達生物量峰值，其次是黑曲霉，最后是地衣芽孢桿菌。但是流加葡萄糖后黑曲霉在34 h時細胞量達到了最高值，比未流加葡萄糖時到達細胞量峰值的時間明顯提前了（提前了6 h）。而地衣芽孢桿菌的細胞量明顯提高了，最高達到了1.79×1010CFU/mL，比未流加葡萄糖的情況下提高了600%。同時黑曲霉的活菌數也增加為1.2×107CFU/mL。說明葡萄糖的流加不僅可以提高發酵體系中的的活菌數量，還能加速黑曲霉的生長。由以上數據計算得出發酵罐分批培養過程中流加葡萄糖可以顯著提高發酵體系的活菌數量，在發酵過程中發酵體系中的總生物量從6.6×109提升到了2.17×1010CFU/mL。

枯草芽孢桿菌和黑曲霉為好氧微生物，枯草芽孢桿菌在接種后會迅速奪取發酵基質中的溶解氧和營養物質，細胞量迅速繁殖[26]。進一步地，黑曲霉到達生長峰值，地衣芽孢桿菌為兼性厭氧微生物，枯草芽孢桿菌和黑曲霉此時到達衰亡期，沒有和地衣芽孢桿菌的競爭位點，此時地衣芽孢桿菌開始迅速生長繁殖，在50 h達到最高值，此時玉米漿中營養物質不足導致地衣芽孢桿菌進入生長衰亡期。

2.3 共生發酵過程游離氨基酸態氮含量提高

玉米漿中含有豐富的蛋白質和氨基酸等氮源，接種產蛋白酶等酶系的微生物可以有效降低玉米漿中的蛋白質等大分子物質。通過測定氨基酸態氮的含量可以評價3種菌株對玉米漿中氮源的利用情況。圖3表示了共生發酵過程中玉米漿氨基酸態氮和其中代表性氨基酸—谷氨酸的變化情況?？梢钥闯?，發酵前期玉米漿中氨基酸態氮含量降低，說明此時黑曲霉的生長直接利用玉米漿中氨基酸用于自身生長。沒有流加葡萄糖發酵時，在24 h以后氨基酸態氮含量迅速增加，在52 h到達最高值，增加了約900 mg/L。52 h后氨基酸態氮含量開始降低。流加葡萄糖發酵時，氨基酸態氮含量明顯低于未流加葡萄糖時的含量。這一現象與3菌株純培養時一致。谷氨酸變化趨勢呈現先增加后減少的趨勢。0～35 h谷氨酸含量不斷增加，在28 h達到最高值為450 mg/L。流加葡萄糖后，谷氨酸含量明顯增加，在35 h時谷氨酸含量最高為550 mg/L。前期菌株產生的蛋白酶將玉米漿中部分蛋白質分解為谷氨酸，谷氨酸含量增加，后期菌體利用了谷氨酸用于生長，導致含量降低。因此，在玉米漿接種微生物可將其中蛋白質發酵降解成植物可直接利用的氨基酸，在發酵35 h其谷氨酸含量最高，在52 h發酵物中氨基酸態氮含量最高。

圖3 玉米漿共生發酵過程氨基酸態氮和谷氨酸變化

2.4 共生發酵顯著提高碳源和磷源利用率

玉米漿中含有豐富的溶磷，溶磷可為微生物生長繁殖提供充足的磷源，促進微生物生長。圖4a是玉米漿發酵過程中溶磷動態變化?？梢钥闯?2 h前可溶性磷含量降低，隨后溶磷含量基本無明顯變化。說明共生發酵過程中溶磷為微生物的生長繁殖提供了充足的磷源。尤其是流加葡萄糖后，上清液中可溶性磷含量明顯降低。因為流加葡萄糖后共生發酵活菌數量明顯增加，導致磷的消耗量顯著增加，在52 h各菌株均進入衰亡期，消耗曲線趨于平緩。

圖4b為玉米漿中碳源消耗曲線?？梢钥闯銎咸烟堑南乃俾矢哂谶€原糖消耗率。0～24 h玉米漿中可發酵糖迅速被消耗用于細胞生長，24 h后糖源消耗變緩，趨于穩定。0～24 h階段處于黑曲霉單菌種生長階段，前面研究中發現黑曲霉對玉米漿中糖源的利用率可達到70%（圖4b），因此接種黑曲霉后玉米漿中碳源被迅速利用。24 h流加葡萄糖后碳源消耗曲線僅略高于未流加時，尤其是24～32 h碳源消耗情況基本保持一致，此階段為黑曲霉迅速生長，流加的葡萄糖均被黑曲霉利用。因此玉米漿中溶磷在發酵過程中被迅速消耗，可有利于細胞生長，同時玉米漿中可發酵糖不足以支撐黑曲霉生長，流加葡萄糖的同時碳源也基本被消耗，后期可適當提高碳源流加量。

圖4 玉米漿共生發酵過程中磷及還原糖/葡萄糖變化

2.5 流加葡萄糖增加了共生發酵體系的穩定性

溶氧是發酵過程中重要的控制參數之一。溶氧大小對菌體生長和產物生產有不同的影響。圖5表示了玉米漿共生發酵過程中溶氧變化。0～12 h發酵體系中溶氧含量迅速降低，黑曲霉是好氧菌，會迅速奪取發酵基質中的溶解氧用于生長代謝。24 h接種枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌后，將通氣量從2 L/(L·min）調整為4 L/(L·min），溶氧略有增加但很快被枯草芽胞桿菌和黑曲霉利用。溶氧量不足限制了好氧微生物在玉米漿中生長，這可能是限制玉米漿中微生物高密度生長的重要因素之一。

未流加葡萄糖時24～48 h階段溶氧量高于流加葡萄糖時溶氧。因為補糖后，攝氧率就會增加，引起溶氧濃度的下降，經過一段時間以后又逐步回升。在發酵過程中，一旦葡萄糖耗盡，生產菌的比攝糖速率降低，比耗氧速率也隨之降低，DO值逐漸回升；當比攝糖速率低于臨界值時，流加補入葡萄糖后使生產菌的比攝糖速率增加，比耗糖速率升高，DO值降低。另外發酵系統跟蹤測定了發酵過程中補料調節pH值過程中酸堿流加量?？梢钥闯?，未流加葡萄糖時，發酵前期0～28 h，堿添加量增加，說明黑曲霉生長過程中產生了一部分有機酸。30 h至發酵結束，酸添加量迅速升高，說明此時伴隨著一部分細胞衰亡，碳源不足，一部分蛋白質氨基酸被分解利用，導致pH值升高。

流加葡萄糖時，24～48 h葡萄糖流加過程中堿液流加量一直增高，說明流加葡萄糖過程中產生了較多的有機酸，導致pH值降低。50 h以后，酸流加量增加，說明此時細胞在不斷衰亡導致pH值升高?？傊?，玉米漿發酵體系中，在罐壓一定的情況下，調節通氣量也難以明顯提高發酵基質中溶氧量，可以限制好氧微生物高密度生長，是保持發酵體系保持穩定的重要因素之一。流加葡萄糖可改變玉米漿共生發酵過程中酸堿變化趨勢，流加葡萄糖會使發酵過程中產生大量的有機酸，可降低玉米漿中碳氮比過低引起的pH值過高的情況。

由結果可得，作為好氧微生物的黑曲霉被體系中的溶氧含量所限制，避免了黑曲霉的高密度生長成為優勢菌株，從而保持了發酵體系中3種菌類共生發酵的穩定性。同時在整個發酵體系中，從酸堿液的添加來看，無葡萄糖流加的體系中從30 h便有細胞死亡或者蛋白質被分解利用，添加葡萄糖作為補料的體系中則是在60 h才開始出現這種情況。結果表明添加葡萄糖作為流加補料，大大延長了細胞開始死亡的時間，可以有效解決體系中因碳源不足導致的pH值升高問題，所以流加葡萄糖作為補料可以增加共生發酵體系的穩定性。

2.6 共生發酵過程中發酵液流變特性分析

流變特性可以影響傳熱傳質過程從而對發酵過程產生影響。絲狀菌的發酵液受到絲狀菌的形態及生物量的影響表現出高黏度高固形物，因此通過對不同發酵時間的發酵液進行取樣，用旋轉流變儀恒溫25 ℃測定，得到不同剪切應變率下的剪應力和表觀黏度。12個時間點的發酵液黏度和剪應力隨剪切應變率的變化如圖6所示。隨著剪切速率的增加，發酵液的表觀黏度逐漸降低，出現剪切稀化的現象，均表現出假塑性非牛頓流體的特性。發酵過程中的發酵液均符合冪律規則式。當剪切速率在0～10 s-1時，表觀黏度大幅下降，隨后黏度下降趨勢變緩，當剪切速率大于20 s-1時，穩態剪切曲線趨于水平，表觀黏度值在0 Pa·s左右，說明發酵液在剪切速率一定程度后趨近于一個穩定值，具有較好的剪切穩定性。0～12 h發酵懸浮液的黏度均隨發酵時間的增加而增加，這表明隨著發酵過程的進行，黑曲霉迅速生長，產生了大量的菌絲體和分泌物，使發酵液成分復雜化，增強了發酵體系內部的網絡結構而使發酵清液黏度稍有升高。同時，此時發酵液中溶氧含量相對值基本為0（圖5），發酵液中的溶氧均被微生物利用。

圖5 玉米漿共生發酵過程中溶氧，酸堿流加量以及DO值的過程變化

圖6 共生發酵發酵液表觀黏度特性分析

用式（1）對圖6的數據進行冪指數擬合，得到發酵不同時間的流變特性參數稠度系數和流動指數的值（圖7）。假塑性流體值越大，其發酵液黏稠度越大，值越小，其非牛頓流體性質愈加顯著。圖中可以看出，發酵初期0～12 h發酵液稠度系數值迅速升高，減??；12 h后值逐漸減小，值逐漸增大。流加葡萄糖后24～28 h，值增加，28 h后逐漸降低。流加葡萄糖后其發酵液值高于玉米漿發酵液，表明流加葡萄糖后其發酵液黏稠度增加。在整個發酵過程中12 h的值最大，最小，說明此時發酵液的非牛頓流體性最強。同時對發酵液的彈性模量（′）和黏性模量（″）測定（圖8）。同樣在12 h其′和″含量最高，且發酵液表現出濃稠性質。隨著剪切速率的增加′基本呈現穩定狀態，″逐漸增加，表明剪切后黏性增強。但是流加葡萄糖對發酵液的′和″無明顯變化。菌絲體的產生對發酵液的稠度系數增長有較大影響。

注：K是一致性指數，n是提供有關受剪切速率影響的流動行為信息的指數。

圖8 不同發酵時間的玉米漿發酵液彈性模量與黏性模量

3 討 論

近年來化肥農藥的大量使用造成了水、土壤空氣等環境的污染，生物菌肥的開發可替代化肥農藥使用，減少其產生的負面影響，同時促進了植物生長、土壤修復。越來越多的研究致力于生物菌肥功能性菌種的選育和應用[27-29]，如一些已經用于農業生產的菌種如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌、黑曲霉[30-33]等。在本研究中，從菌肥工業生產中選擇的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉可以產生多種如蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，纖維素酶等酶系，分解土壤中的有機質，促進植物根際微生物生長，提高作物對氮磷鉀及中微量元素等的相互協調和吸收率。同時枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌能夠產生生長素等促進植物生長[34]，產生的抗菌物質能夠抑制多種植物病菌生長[35]，與共生的有益菌種能長期共存，使土壤微生態平衡；黑曲霉具有優良的解磷、解鉀能力，同時可以競爭性抑制其他有害真菌的生長[36]。通過將3種功能微生物共生發酵，增加了菌肥的多種功能性，同時3菌種均可以產生植酸酶，將玉米漿中的有機磷轉化為游離磷酸根，被微生物進一步利用。

在發酵過程中先接種黑曲霉可以產生多種有機酸將玉米漿中的不溶解性磷轉化為可溶性磷，降低玉米漿的滲透壓，培養24 h后接種枯草芽孢桿菌，它可以在玉米漿發酵系統中迅速生長，同時將黑曲霉的成團的菌絲體剪稀，增加其孢子數量。同時，地衣芽孢桿菌是兼性厭氧菌，避免了發酵液中溶氧不足造成活菌數降低的問題，所以應在發酵后期接種，以提高發酵pH值，并分解產生更多的氨基酸供枯草芽孢桿菌在發酵過程中利用。芽孢桿菌與黑曲霉共生系統的建立以及共生系統中黑曲霉數量的增加將在今后的研究中進一步深入研究。

本研究測定了發酵體系中的溶氧參數以及流變系數，體積氧傳遞系數表征了工程水平發酵罐內的氧傳遞情況，它與發酵液的流變性質有關[37-38]。這種時序變化的混合傳質情況進而又會影響菌體的生長以及產物的生成，從而對生產造成一定的影響。在發酵過程中，作為好氧微生物的黑曲霉被體系中的溶氧含量所限制，避免了黑曲霉的高密度生長成為優勢菌株，同時地衣芽孢桿菌是兼性厭氧菌，避免了發酵液中溶氧不足造成活菌數降低的問題。本研究對發酵液的流變特性進行分析顯示，黏度系數在12 h最大，隨后開始降低。黏度越大，體積氧傳遞系數越小。而溶氧量的降低反過來又會影響菌體生長以及產物合成。菌絲形態及菌體濃度等會嚴重影響發酵液的流變特性。隨著菌體的生長，值逐漸增大；后期菌體逐漸衰亡，值也開始下降。因此菌體濃度過高，嚴重影響了霉菌發酵液溶氧量的增加，影響其其生長代謝。因此應考慮改良發酵罐物理結構或盡可能保持高轉速，降低發酵液稠度，提高氧傳遞系數，使菌株有更高的活性，從而使菌肥具有更高的品質。

雖然關于共生發酵的研究已被廣泛報道[39-40]，但共培養系統中不同微生物可能會相互抑制[41]。本研究評估了三菌種在有無添加葡萄糖的玉米漿中共生發酵過程的參數變化，以此模擬結晶葡萄糖母液與玉米漿結合用于共生發酵的過程。結晶糖母液是工業生產精制葡萄糖過程中蒸發濃縮制得的葡萄糖再經過攪拌降溫離心分離出晶體后的剩余部分。結晶糖母液中葡萄糖含量約40%～50%[25]，因此在發酵罐分批培養過程中，選用40%濃度的葡萄糖作為流加補料。試驗結果發現流加葡萄糖可以顯著提高共生發酵體系中的活菌數量，尤其是發酵后期地衣芽孢桿菌活菌數；同時，流加葡萄糖還可以增加體系中對可溶性磷以及總糖的利用率；以及增加發酵體系的穩定。相反，葡萄糖的流加導致了培養物中氨基酸態氮的含量降低。這可能是在增加細胞量的同時，過高的細胞生長利用了氨基酸態氮，從而導致氨基酸態氮含量降低。至此，本試驗模擬結晶葡萄糖母液的添加，有效的將兩種工業廢料（玉米漿；結晶葡萄糖母液）結合到了一起，制作出的“廢料”培養基營養物質豐富，輔以菌株從而制造出生物菌肥。本研究為兩種工業廢料的處理再利用提供了選擇，對生物肥料的開發以及工業廢料的再利用有著積極作用。

4 結 論

本研究通過菌種組合確定了3菌種共生發酵生產菌肥。采用延遲接種技術在5 L發酵罐中共生發酵，并流加40 g/L的葡萄糖作為補料，結果為流加葡萄糖作為補料可顯著提升3種菌株的生物量，總生物量從6.6×109提升到了2.17×1010CFU/mL，并且在52 h氨基酸態氮含量達到最大。采用葡萄糖模擬結晶葡萄糖母液流加補料使共生體系中溶磷利用率提升了50%，并且添加葡萄糖還能保持發酵體系的pH穩定，奠定了生產穩定以及使用廣泛的玉米漿生物菌肥基礎。該研究是對玉米漿共生發酵生物菌肥的初步系統研究，并為玉米漿生物肥料的生產提供了系統的生產步驟。

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Symbiotic fermentation characteristics of biotransformed maize pulp for biofertilizer production

Ren Xiaojie1,2, Ban Heng1, He Zhuangzhuang1, Wang Xiaolong3, Zhao Yubin4, Song Yuanda1, Zhao Xinhe1,4,5※

(1.,255000; 2253000,; 3.100015,; 4.276400,; 5.266237,)

Maize deep processing has been the second-largest agricultural processing industry in the world. The products (such as starch sugar, maize oil, and crude fiber) have been very important food and chemical raw materials. Among them, maize starch is currently the main resource for the production of glucose syrup and various sugar derivatives. However, the preparation process of maize starch can produce a large number of by-products, such as Maize Steep Liquor (MSL). Alternatively, the maize pulp has been confined during processing, due to the dark color, heavy taste, high toxin content, and difficult handling. Particularly, maize pulp presents great potential in the field of bio-exploitation, due to a large number of nutrient contents with more than 40% nitrogen and more than 25% carbohydrates. Therefore, a cheap nitrogen source can be served for the fermentation production of bioproducts. This study aims to develop microbial fertilizers using the abundant source of fast-acting nitrogen in the maize pulp and the growth-promoting factors of microorganisms. The slow release and degradation of toxins by soil were avoided to reduce the direct toxicity of biotoxins to humans and livestock. A systematic evaluation was made on the high-density fermentation of three strains of plant inter-rhizosphere growth-promoting bacteria (PGPMs) in the maize pulp. The fermentation characteristics were investigated via the symbiotic fermentation of three strains of PGPMs that screened in the previous stage. The experimental results showed that the three species significantly increased the biomass in the fermentation system after the symbiotic fermentation. The flow addition of starch industrial waste (crystalline glucose mother liquor) was taken as a supplement during the simulation. The total biomass was elevated from 6.6×109to 2.17×1010CFU/mL in the fermentation system. The maximum viable bacterial count and amino acid nitrogen were obtained at the end of 45 h fermentation. Meanwhile, the glucose was added in the mimic crystalline glucose mother liquor flow in the symbiotic system. Then, there was a significant increase in the utilization of total sugars and soluble phosphorus. Specifically, the soluble phosphorus utilization increased by nearly 50%. The addition of glucose also maintained the stable pH value in the fermentation system, particularly for the stable production of bacterial fertilizer. This finding can provide a better solution and practical basis for the reuse of maize pulp in the production of low-cost biofertilizers using a variety of bacteria. The high value-added reuse of crystalline glucose mother liquor can be produced using the waste of maize starch.

bacteria; fermentation; Maize Steep Liquor (MSL); biofertilizer; inter-root promoting bacteria; microecology

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.17.022

S-3

A

1002-6819(2022)-17-0205-08

任曉潔，班恒，賀壯壯，等. 生物轉化玉米漿生產生物菌肥的共生發酵特性[J]. 農業工程學報，2022，38(17)：205-213.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.17.022 http://www.tcsae.org

Ren Xiaojie, Ban Heng, He Zhuangzhuang, et al. Symbiotic fermentation characteristics of biotransformed maize pulp for biofertilizer production[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(17): 205-213. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.17.022 http://www.tcsae.org

2022-06-01

2022-08-30

山東省自然科學基金項目（ZR2020MC201）；中國博士后基金項目（2019M662362）；促進與加拿大、澳大利亞、新西蘭及拉美地區科研合作與高層次人才培養項目（2022-1007美洲留學基金）

任曉潔，博士，講師，研究方向為發酵工程。Email：renxiaojie2020@163.com

趙新河，博士，副教授，研究方向為發酵工程。Email：zhaoxinhe@sdut.edu.cn