寒區降解多環芳烴耐冷菌株的分離鑒定及特性

孫 楠，朱廣雷，楊安培，王思銘

寒區降解多環芳烴耐冷菌株的分離鑒定及特性

孫 楠，朱廣雷，楊安培，王思銘

（東北農業大學水利與土木工程學院，哈爾濱 150030）

多環芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）是土壤中一種典型的持久性有機污染物。典型寒區東北地區因農業投入品不合理使用、污灌等造成農田土壤中含有大量致癌、致畸與致突變的多環芳烴，針對寒區氣候特征致使農田中微生物降解多環芳烴效果不佳，難以改善農田土壤環境并降低食品風險的關鍵問題，基于目前常用商品化的降解微生物多來自于溫暖地區，且難以適應寒區氣候的特性，該研究以PAHs典型污染物-菲（PHE）為研究底物，馴化溫度15 ℃，篩選分離出適應寒區低溫環境的7株菌。經鑒定及降解性能研究，篩選了3株在溫度20 ℃、接種量5%、pH值為8、底物濃度500 mg/L，以及外源物質腐殖酸的促進的條件下PHE降解率達到80%的高效降解耐冷菌。以上3株菌兩兩之間與三者組合均無拮抗關系。對菌株進行碳源的廣譜性分析，菌株對2-5環多環芳烴降解率可達15%～85%之間，在將菌株應用至20 ℃土壤環境時，60 d可降解土壤中75%的PHE。該耐冷菌群適應條件符合寒區農田土壤實際環境，研究結果對黑土地區土壤多環芳烴污染的微生物修復提供了一定的基礎資料。

土壤；污染；微生物；寒區；PAHs；耐冷菌；生物修復

0 引 言

農業是中國經濟平穩發展的基石，隨著農業的發展及人為活動的參與，在保障了糧食安全的同時也造成了嚴重的環境污染風險[1-3]。2014年生態環境部發布的《全國土壤污染狀況調查公報》顯示中國農田土壤點位污染物超標率為19.4%，主要污染物便包括多環芳烴（PAHs）。農田土壤中PAHs的含量為9.90～5 911 ng/g，總體水平較高[4]。菲（PHE）是16種美國環保局（USEPA）所列優先控制的PAHs之一，在農田土壤含量為13.82%，各區域含量分布存在較大差異，其中東北地區PAHs含量為900.6 ng/g，污染水平較高[5]。PAHs屬持久性有機污染物，具有較強的化學穩定性和較低的水溶性[6]。隨著人類社會的不斷發展，各種廢氣污染物的排放有增無減，已經超過了環境自身的修復凈化能力，造成了PAHs的逐年蓄積[7-8]。PAHs易進入生態系統不斷積累，通過食物鏈在生物體內富集，威脅人類健康[9]。PAHs污染嚴重影響農田土壤環境的健康發展，危害著土壤的生產、生態功能以及農產品質量[10]，不利于農田土壤環境的可持續發展，因此對于多環芳烴污染的修復迫在眉睫。

PAHs污染土壤的修復技術可分為物理修復技術、化學修復技術及生物修復技術。物理修復技術成本較高，對目標污染物也只是完成了相轉移，并未真正將其從環境中去除?；瘜W修復技術雖然相對其他技術效果更理想，但在實際修復中存在氧化劑需求量大、能源消耗大、可能會對環境造成二次污染等問題。生物修復又因修復作用的主體不同，進而可分為植物修復技術、動物修復技術、微生物修復技術及其聯合修復技術[11-13]。其中，PAHs污染土壤的微生物修復是一種得到廣泛認可的處理技術，可實現PAHs類污染物的完全降解或將其轉化為毒性相對較低的化合物[14]，而不是簡單地將其轉移，同時具有成本低、環境擾動小、無二次污染、可就地處理等優點，是人們公認的一種利用微生物降解、同化、代謝或解毒有機污染的低成本、高效技術[15]。目前的研究中，能降解多環芳烴的微生物主要有假單胞菌屬、產堿桿菌屬、分枝桿菌屬、紅球菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和環圈菌屬等[16-17]。

東北地區是寒冷地區，有著廣袤的黑土地，土壤溫度狀況屬于冷性土壤溫度狀況，全年土壤溫度多為5～22 ℃[18-19]，黑土地中腐殖酸可達(7.03±2)g/kg[20]，土壤整體來看pH值多在5.5～8.5之間[21]。目前微生物修復技術的研究多進行于溫暖地區，試驗篩得的菌種多為中溫菌，適宜寒區溫度的低溫耐冷菌的研究較少；此外，耐冷菌主要集中于單一菌種的降解研究，研究表明單一微生物的降解效果低于混合菌群[22]。結合土壤污染狀況及PAHs含量的分析，本研究旨在以菲為篩選碳源，篩選出適宜修復寒區農田土壤PAHs污染的菌源，構建出可應用于修復寒區農田土壤的耐冷降解菌群，為黑土地保護及污染治理提供新思路。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

土壤樣品采集于PAHs污染較嚴重的地區，鏟除表面1 cm左右的表土，以避免地面微生物與土樣混雜，用無菌鐵勺采取5～10 cm[23]處土壤裝入無菌瓶中，置于4 ℃冰箱臨時保存，至實驗室后及時放入?80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 耐冷菌的分離篩選與鑒定

根據對土壤PAHs污染成分構成分析如表1所示，根據前期文獻查找及實際污染土壤組分分析結果，選用PHE作為耐冷菌篩選的馴化碳源。PHE是一種典型的PAHs，分子量小，與有機質有較強的親和力，更容易在水相、固相和有機相之間轉移[24]。

表1 污染土壤中主要PAHs的濃度

1.2.1 試驗培養基

無機鹽培養基（MSM）：4.26 g Na2HPO4、2.65 g KH2PO4、0.02 g CaCl2、1.5 g (NH4)2SO4、0.2 g MgSO4·7H2O，pH值為7.0，加入1 mL微量元素[23]，蒸餾水定容至1 L。

LB 培養基：10.0 g胰蛋白、5.0 g酵母提取物、10.0 g NaCl，pH值為7.0，蒸餾水定容至1 L[25]。

牛肉膏蛋白胨培養基：5.0 g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0 g NaCl，pH 值為7.0，蒸餾水定容至1 L[26]。

篩選培養基：已滅菌的MSM培養基中加入一定量的用甲醇溶解的菲儲備液，甲醇揮發后備用。

固體培養基：在原有培養基基礎上加15 g/L瓊脂粉。

1.2.2 耐冷菌的富集培養及分離與鑒定

取土壤20 g，與無菌水混合振蕩培養，得到微生物懸液，接種到牛肉膏蛋白胨培養基內進行培養，富集其中微生物。富集培養5 d后，取上清液，轉入以菲為單一碳源的無機鹽液體培養基中，其中菲濃度為200 mg/L，在180 r/min，15 ℃低溫馴化培養[27-28]。每7 d取培養液傳代培養，逐級提高菲濃度至1 000 mg/L。取1 000 mg/L的培養液，稀釋涂布于LB固體培養基上，挑取單菌落，平板劃線分離純化。

將分離純化后的菌株進行形態特征鑒定[29]，革蘭氏染色鑒定及16S rDNA測序[30]。測序后通過NCBI中的BLAST軟件對測序結果進行同源比對，通過MEGA X 采用鄰接法（neighbor-joining）構建系統發育樹。

1.3 混合菌群構建方法

將鑒定后的菌株接種在含有液體LB培養基的錐形瓶中，經活化、離心、重懸等步驟后接種至以PHE為單一碳源的MSM培養基的150 mL三角搖瓶中，搖床振蕩培養7 d。分析篩選所得菌株的降解能力，將降解效果最優菌株選出進行拮抗特性分析，拮抗試驗采用劃線交叉法，將上述篩選出的菌株在牛肉膏蛋白胨固體培養基上兩兩之間進行交叉劃線，15 ℃培養48 h，觀察各菌株在劃線交叉處的生長狀況，兩者能生長為不拮抗，一株或兩株都不能生長為拮抗。選出最佳構建菌群方案。

1.4 PHE最優降解條件優化及菌群生長曲線分析

測試降解菌株及菌群對PHE降解的最佳條件。將菌株接入LB液體基礎培養基中，經活化、離心、重懸等步驟后，再用無機鹽培養基將懸浮液調節至OD600=1。分別以1%、2%、3%、4%、5%、7%、10%作為接種濃度試驗組；以5、10、15、20、25、30 ℃作為溫度試驗組；以100、200、400、500、600、800、1 000 mg/L的菲濃度作為底物耐受性試驗組；以5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0作為pH試驗組；以腐殖酸、淀粉、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母提取物作為接入外源物質試驗組。以上各組實驗，每組設置3個平行，對照組加菲但不接種降解菌，180 r/min搖床培養7 d后，檢測PHE的殘留量[31]。生長曲線繪制分析方法參考文獻[22]。

1.5 菌群降解的廣譜性分析

所用的培養基為以3，4-苯并芘、芘、熒蒽、菲、蒽、芴、萘為單一碳源的MSM液體培養基。按3 %的接種量轉接于含有30 mL以3，4-苯并芘、芘、熒蒽、菲、蒽、芴、萘為單一碳源的MSM培養基的三角搖瓶中，15 ℃，180 r/min搖床振蕩培養7 d。觀察培養7 d后所得的培養液是否有菌體生長以及唯一碳源多環芳烴固體底物是否有消耗，測量殘余濃度[30]。

1.6 模擬土壤中菌群對PHE降解率分析

選用正常的農田土壤?？屯寥』睾笞匀伙L干，剔除根莖和大顆粒雜物，粉碎后過篩，確保粒徑小于2 mm。向土壤中加入溶于甲醇的菲溶液，不斷攪拌使土壤染毒均勻。陳化一周后使用，最終土壤中PHE的濃度為(16.3± 1.19) mg/kg（干質量），pH=7.3。分別按照1%、2%、3%、4%、5%的接種量與6 kg染毒土壤拌勻置于容器中，每組設5個平行，對照組含菲但不加入菌液。20 ℃條件下于10、20、60 d檢測PHE濃度。PHE檢測方法參照文獻[31]。

2 結果與討論

2.1 鑒定結果分析

2.1.1 菌落形態特征及革蘭氏染色結果

通過逐步增加菲濃度（最終濃度為1 000 mg/L）的方法進行馴化，再通過平板劃線分離的方法，從受多環芳烴污染的土壤中最初篩選出有降解效果的有效菌株7株，分別命名為DX-1、DX-2、DX-3、DX-4、DX-5、DX-6、DX-7。7株PAHs降解菌在LB固體平板上的菌體形狀、革蘭氏染色及形態特征如表2所示。

表2 7株菲降解菌形態特征

注：G-為革蘭氏陰性菌；G+為革蘭氏陽性菌。

Note: G-is Gram negative bacteria; G+is Gram positive bacteria.

2.1.2 測序結果分析

如圖1所示，通過對細菌序列NCBI核酸數據庫中同源性比對發現，使用MEGA X構建得到的系統發育樹。DX-3與假單胞菌屬（sp.）高度相似，DX-1與無色桿菌屬（sp.）高度相似，DX-2與寡養單胞菌屬（sp.）高度相似，DX-5與布氏桿菌屬（sp.）高度相似，其余3株菌與甲基桿菌屬（sp.）具有相似性。

圖1 采用鄰接法構建16S rDNA系統發育樹

2.2 耐冷降解菌群構建

2.2.1 單菌降解效果評估

單株菌在土壤中定植能力差，菌株組合對土壤環境有較強的適應能力，PHE等難降解有機物的生物降解過程是通過不同菌株協同作用的結果。不同菌株對于PHE的降解能力不同，構建菌群需要提前挑選出最適合的菌株，在構建菌群前將篩選得出菌株的降解能力進行評估，對菌株在初始接種量3 %、溫度為15 ℃、pH值為7.25、PHE初始濃度1 000 mg/L不添加外源物質的條件下的降解能力進行分析，選取降解能力較強的菌株構建菌群。由圖2所示，菌株降解過程中，7株菌中，DX-2降解能力最強，可降解超過35%的PHE，DX-1、DX-3、DX-5、DX-6降解能力略弱于DX-2，可降解20%以上的PHE，DX-4與DX-7降解能力稍弱。由此將降解能力最強的DX-1、DX-2、DX-3初步選出做拮抗試驗，檢驗構建菌群的可行性。

2.2.2 拮抗特性分析

將降解效果較好的3株菌株進行完全隨機組合，劃線培養時，均生長良好，長勢接近，由此說明菌株之間不存在拮抗關系。如表3所示，拮抗試驗中PHE降解菌DX-1、DX-2與DX-3兩兩之間均無拮抗關系，3株菌株組合間無拮抗關系。該結果表明，3 株菌在同一環境下，不會因互相抑制生長而造成降解效果的降低。結合上述7株菌對PHE降解及拮抗試驗，選取互不拮抗且降解性能較好的菌株DX-1、DX-2、DX-3來構建PAHs降解菌群。

圖2 單菌降解能力評估

表3 不同降解菌組合之間拮抗試驗結果

注：—表示無拮抗。

Note: — means no antagonism.

2.3 耐冷降解菌群降解條件優化

2.3.1 初始接種量對菌群降解PHE的影響

初始接種量與微生物進入新環境后的遲緩期長短有密切關系，會影響微生物在一定時間內對多環芳烴底物的降解效果。圖3為探究菌群降解PHE時最適宜初始接種生物量的試驗結果。當接種量達到5%時，培養7 d后PHE的降解效率達到64.62%。繼續提升接種量時降解率反而降低，推測當初始接種量達5%后便不能再通過增大接種量來提高降解效率。產生該現象的原因可能是當初始接種量很大的情況下，微生物進入新環境后遲緩期很短，細胞數量在短時間內的急劇增加使得底物能夠快速降解，同時可累積的大量中間產物產生可能會表現出一定的抑制作用。

注：DX-1、DX-2、DX-3為菌株名稱，MIX 表示混合菌群。下同。

2.3.2 培養溫度對菌群降解PHE的影響

隨著溫度的升高，PHE的溶解度會增大，進而增加PHE分子的生物利用度。在溫度升高的情況下，PHE可能會轉化為更加難以降解的物質。因此，溫度超過或低于最適溫度都會抑制菌群的降解作用。如圖4所示，為探究在低溫條件下菌群是否還有降解PHE的能力，測定不同培養溫度條件下菌群的降解效率。結果表明，菌群在5～30 ℃范圍內均能有效降解PHE，降解率的峰值出現在20 ℃，在此溫度下菌群在7 d內對底物初始濃度500 mg/L的PHE的降解率達69.70%。當溫度超過25 ℃時菌群的降解率開始降低，說明此時的溫度條件已經不是最適合菌群降解PHE的溫度條件。通過試驗得知5～30 ℃時皆可對PHE進行較為有效的降解，峰值出現在20 ℃附近，這與文獻[32]關于耐冷菌的研究相似。符合試驗想要得到適宜寒區土壤溫度的耐冷菌的需求。

2.3.3 底物初始濃度對降解菌群降解PHE的影響

降解體系中底物初始濃度的不同，也反映著毒性的高低，試驗通過控制底物PHE 的初始濃度，探究菌群對PHE毒性的耐受性。試驗結果如圖5所示，在低濃度下（100和200 mg/L），PHE降解率可保持降解70%以上。在底物濃度逐漸升高的情況下，底物毒性和底物代謝產生中間產物的累積毒性對菌群的抑制效果也更加地明顯，菌群的降解率開始降低。根據底物濃度與降解率的換算可知，PHE的實際降解量沒有降低，隨著濃度的增高，實際降解量增加。結果表明在高濃度環境下菌群仍有理想的降解效果，菌群對PHE毒性有很強的耐受性，為嚴重污染區PAHs的生物修復提供參考。在底物濃度為500 mg/L時PHE降解率達到70%左右，實際降解量與其他高濃度情況下基本一致，出于耗材和人員安全考慮，本研究選取此濃度作為最佳濃度，以在實驗室進行操作。

圖4 培養溫度對菌群降解 PHE的影響

圖5 底物初始濃度對菌群降解 PHE 的影響

2.3.4 初始pH值對降解菌群降解PHE的影響

pH是影響細菌生長的關鍵因素，會對核酸、蛋白質、以及細菌體內的酶活性造成影響，適宜的pH條件益于細菌的生長，能夠最大限度地降解環境中的PHE。為了探究菌群的pH耐受范圍，本研究考查了不同pH下，混合菌群降解PHE的效率。如圖6所示，試驗結果表明菌群具有較好的pH普適性，堿性較強(pH=10)的環境中，PHE降解效率較低，在極端pH條件下，菌株生長變慢，活性降低。試驗結果表明在pH值5.0～9.0的環境中皆可降解45 %以上的PHE，最適條件為pH=8，菌降解率最高，為70.66 %，此時混菌的菌量最大，菌群的新陳代謝能力最強。在堿性環境中菌群仍能發揮降解作用，菌群有優異耐堿性，這與文獻[32]的研究結果相似，降解菌株皆有較好的耐堿性。寒區大部分農田土壤的pH值在5.5～8.5之間，極個別地區土壤pH值達到了9.4，且PAHs污染土壤的pH會有上升的情況[33]。實際土壤與菌群活性發揮的pH區間相似，有著較高的實用價值。

圖6 初始pH值對菌群降解PHE的影響

2.3.5 外源物質對降解菌群降解PHE的影響

現實環境中，微生物降解會受到環境中營養缺乏的影響而降低菌株對多環芳烴的降解效果。通過向降解體系中添加額外的碳源及氮源等外源營養物質，檢測降解效率。如圖7所示，與不添加任何外源營養的對照組相比，添加外源物質對菌群降解PHE 的降解的效果有著或高或低的影響，蛋白胨和蔗糖與對照相比沒有明顯變化，甚至比不添加時效率低。分析是因為加入的這些外來營養源，恰好菌株可以利用維持其生長繁殖，且加入的碳/氮源較之PHE更好利用，故降解PHE的量減少。這與文獻[30]研究類似，外源物質的加入并非一定增加降解效率。腐殖酸的添加使得菌群對PHE底物的降解效果大大提高，達到了83.40 %，這與文獻[28]的研究結果相似，在腐殖酸的加入下，可提高菌株對PAHs的降解效率?？赏茰y在富含腐殖酸的實際土壤中利用菌群修復PHE污染會有更好的效果，而實際寒區農田土壤中含有大量腐殖酸，與實驗室研究情況相似。

圖7 外源物質對降解PHE的影響

2.3.6 最適條件下菌群生長曲線及構成分析

如圖8所示，通過對菌群生長情況的檢測分析，生長曲線中菌株和菌群較快的進入對數生長期，在同等環境下3株菌的生長情況不同，結果表明菌群的生長情況好于單個菌株。對菌群構成的檢測中，降解前后的菌群構成出現了細微的變化，由初始的1∶1∶1的配比變為了31%∶44%∶25%，結果表明菌群中每株菌生長情況不同，都得到了較好的生長。

注：OD600指溶液在600nm波長處的吸光值。

2.4 菌群降解的廣譜性

污染土壤中，PAHs污染多為多種多環芳烴的復合污染，不同類型的多環芳烴的毒性與生物有效性也不同。表4為菌株PAHs的抗毒性及降解能力試驗結果，由表4可知，所得菌株對2-4環的PAHs抗毒性及降解能力（除FLU以外）較強，菌株對2-4環可降解40%以上；菌株對5環PAHs BaP僅有15%左右的降解效果。菌株在不添加任何外源物質的情況下能夠利用多種常見的多環芳烴底物，其底物適應性顯示出了較大的研究及應用價值。這與文獻研究[23-24,27,32-34]相似，同一菌株或菌群可降解多種多環芳烴。

表4 菌株在其他多環芳烴中的生長情況

注：“+”表示能夠以此底物生長，“-”表示降解體系未見明顯現象。

“+”Grown with this substrate, “-”Had no obvious phenomenon.

2.5 土壤體系中菌群降解PHE效果

圖9為土壤菌液接種量對土壤環境中降解PHE的影響結果。由圖9可知，加入菌液的土壤對PHE的降解效果明顯高于土壤中的自然降解。不同的接種量對降解率影響較大，表明復雜的土壤環境體系中，細菌的遲緩期較長，適應環境發揮作用的時間較長。在60 d時，接種量為4%或5%時，土壤最終降解皆為75%左右。表明此時接種量的增加對降解效果促進作用很低，菌群在實際土壤中的降解效率略低于實驗室條件下的效果。從長遠考慮，在實際生產中對于PAHs污染可通過試驗確定合適的濃度，以便后續菌劑生產的成本控制。

圖9 菌群在土壤中降解 PHE 效果

綜上所述，菌株的最適降解條件與土壤的實際情況并非完全一致，皆在菌株降解能力的有效區間內，具有實際的利用價值及意義。

3 結 論

目前研究的降解微生物多來自于溫暖地區，難以適應寒區氣候特征的特性，難以改善農田土壤環境。本文研究基于寒區農田土壤PAHs污染，進行選取典型污染物PHE試驗設計，得到以下結論：

1）設計低溫菌株篩選分離試驗，得到可在溫度15 ℃條件下降解PHE的菌株7株，將性能評估選取其中降解性能最優且互不拮抗的3株菌構建混合菌群。

2）通過不同環境下菌株的降解能力的分析，確定菌株可發揮最佳降解性能的環境條件為溫度20 ℃、pH值為8、腐殖酸參與的環境，在7 d降解PHE達到80%。將菌株應用在實驗室PHE污染土壤中可在20 ℃、土壤pH值為7.3的情況下，60 d降解土壤中75%的污染物。

3）根據試驗結果表明菌株具有良好的耐低溫，抗毒、抗堿性效果，經驗證，所得菌株可利用多種類型PAHs，如萘、蒽、芴、芘、熒蒽、苯并[a]芘等，可對修復寒區實際土壤多環芳烴復合污染，高毒性污染土壤pH上升情況提供基礎，為土壤環境可持續發展提供思路。

[1] 展曉瑩，張愛平，張晴雯. 農業綠色高質量發展期面源污染治理的思考與實踐[J]. 農業工程學報，2020，36(20)：1-7.

Zhan Xiaoying, Zhang Aiping, Zhang Qingwen. Controlling agricultural non-point source pollution: Thinking and practice in the era of agricultural green high-quality development[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(20): 1-7. (in Chinese with English abstract)

[2] 陳浮，曾思燕，葛小平，等. 資源環境硬約束下中國耕地休耕優先區識別[J]. 農業工程學報，2021，37(22)：226-235.

Chen Fu, Zeng Siyan, Ge Xiaoping, et al. Identifying the fallow priority areas of cultivated land under resources and environmental constraints in China[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(22): 226-235. (in Chinese with English abstract)

[3] 叢宏斌，沈玉君，孟海波，等. 農業固體廢物分類及其污染風險識別和處理路徑[J]. 農業工程學報，2020，36(14)：28-36.

Cong Hongbin, Shen Yujun, Meng Haibo, et al. Classification of agricultural solid wastes and identification of pollution risks and utilization paths in China[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(14): 28-36. (in Chinese with English abstract)

[4] Ma W L, Liu L Y, Tian C G, et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons in Chinese surface soil: Occurrence and distribution[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2015, 22(6): 4190-4200.

[5] 尚慶彬，段永紅，程榮. 中國農業土壤多環芳烴污染現狀及來源研究[J]. 山東農業科學，2019，51(3)：62-67.

Shang Qingbin, Duan Yonghong, Cheng Rong. Pollution status and sources of polycyclic aromatic hydrocarbons in Agricultural Soils in China[J]. Shandong Agricultural Sciences, 2019, 51(3): 62-67. (in Chinese with English abstract)

[6] 馬虎根，羅行，馮曉瓊，等. 污染土壤中PAHs水蒸氣剝離法試驗研究[J]. 農業工程學報，2005，21(2)：121-125.

Ma Hugen, Luo Xing, Feng Xiaoqiong, et al. Experimental research on steam stripping of Polycyclic Aromalic Hydrocarbons (PAHs) from contaminated soil[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2005, 21(2): 121-125. (in Chinese with English abstract)

[7] Meng Y, Liu X H, Lu S Y, et al. A review on occurrence and risk of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in lakes of China[J]. Science of the Total Environment, 2019, 651: 2497-2506.

[8] Wilcke W. Global patterns of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soil[J]. Geoderma, 2007, 141(3/4): 157-166.

[9] 王忠，安玉光，許廣舉，等. 柴油機多環芳香烴類污染物的測量方法[J]. 農業工程學報，2011，27(4)：174-178.

Wang Zhong, An Yuguang, Xu Guangju, et al. Measurement method of polycyclic aromatic hydrocarbon emission of diesel engine[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2011, 27(4): 174-178. (in Chinese with English abstract)

[10] Matar T, Stefano A, Di B M, et al. Source patterns and contamination level of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in urban and rural areas of Southern Italian soils[J]. Environmental Geochemistry and Health, 2018, 41: 507-528.

[11] 白建峰，秦華，王景偉，等. 蚯蚓和發酵牛糞促進南瓜苗修復PAHs污染農田土壤[J]. 農業工程學報，2012，28(10)：208-213.

Bai Jianfeng, Qin Hua, Wang Jingwei, et al. Remedying PAHs contaminated farmland soil by zucchini with earthworm and fermented cow dung application[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2012, 28(10): 208-213. (in Chinese with English abstract)

[12] Liao X Y, Zhao D, Yan X L, et al. Identification of persulfate oxidation products of polycyclic aromatic hydrocarbon during remediation of contaminated soil[J]. Journal of Hazardous Materials, 2014, 276: 26-34.

[13] Yu D S, Kazanietz M G, Harvey R G, et al. Polycyclic aro?matic hydrocarbon o-quinones inhibit the activity of the cat?alytic fragment of protein kinase C[J]. Biochemistry, 2002, 41(39): 11888-11894.

[14] Sun S L, Wang Y X, Zang T T, et al. A biosurfactant-producing Pseudomonas aeruginosa S5 isolated from coking wastewater and its application for bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons[J]. Bioresource Technology, 2019, 281: 421-428.

[15] Ferraro A, Massini G, Miritant V M, et al. Bioaugmentation strategy to enhance polycyclic aromatic hydrocarbons anaerobic biodegradation in contaminated soils[J]. Chemosphere, 2021, 275: 130091.

[16] Wang B, Teng Y, Xu Y, et al. Effect of mixed soil microbiomes on pyrene removal and the response of the soil microorganisms[J]. Science of Total Environment, 2018, 640: 9-17.

[17] Sun K, Habteselassie M Y, Liu J, et al. Subcellular distribution and biotransformation of phenanthrene in pakchoi after inoculation with endophyticsp. as probed using HRMS coupled with isotope-labeling[J]. Environmental Pollution, 2018, 237: 858-867.

[18] 張天鵬，保萬魁，雷秋良，等. 1951－2010年中國土壤溫度時空變化特征及其影響因素[J]. 地理學報，2022，77(3)：589-602.

Zhang Tianpeng, Bao Wankui, Lei Qiuliang, et al. Characteristics of spatio-temporal changes in soil temperature in China from 1951 to 2010 and its influencing factors[J]. Acta Geographica Sinica, 2022, 77(3): 589-602. (in Chinese with English abstract)

[19] 張忠學，孫迪，李鐵成，等. 節水灌溉減施磷肥對黑土稻作產量及土壤磷利用與平衡的影響[J]. 農業工程學報，2022，38(4)：67-74.

Zhang Zhongxue, Sun Di, Li Tiecheng, et al. Effects of water-saving irrigation and reducing phosphorus fertilizer on rice yield, phosphorus utilization and soil phosphorus balance in black soil[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(4): 67-74. (in Chinese with English abstract)

[20] 趙紅，鄭殷恬，呂貽忠，等. 免耕與常規耕作下黑土腐殖酸含量與結構的差異[J]. 生態環境學報，2010，19(5)：1238-1241.

Zhao Hong, Zheng Yintian, Lv Yizhong, et al. The difference of black soil humus content and structure in no-tillage and plowing tillage[J]. Ecology and Environment Sciences, 2010, 19(5): 1238-1241. (in Chinese with English abstract)

[21] 劉憶瑩，裴久渤，汪景寬. 東北典型黑土區耕地有機質與pH的空間分布規律及其相互關系[J]. 農業資源與環境學報，2019，36(6)：738-743.

Liu Yiying, Pei Jiubo, Wang Jingkuan. Spatial distribution and relationship between organic matter and pH in the typical black soil region of north?east China[J]. Journal of Agricultural Resources and Environment, 2019, 36(6): 738-743. (in Chinese with English abstract)

[22] Kumari S, Regar R K, Manickam N. Improved polycyclic aromatic hydrocarbon degradation in a crude oil by individual and a consortium of bacteria[J]. Bioresource Technology, 2018, 254: 174-179.

[23] 余薇薇，疏明慧，謝明原，等. 沼灌土壤17-雌二醇專性降解菌的分離篩選及降解特性[J]. 農業工程學報，2022，38(8)：218-224.

Yu Weiwei, Shu Minghui, Xie Mingyuan, et al. Isolation, screening, and degradation characteristics of 17-estradiol obligate degradation bacteria in the soil of marsh irrigation[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(8): 218-224. (in Chinese with English abstract)

[24] Wang X, Jian A, Huang X, et al. Reducing phenanthrene uptake and translocation, and accumulation in the seeds by overexpressing OsNRT2. 3b in rice[J]. Science of The Total Environment, 2020, 761: 143690.

[25] 任曉潔，賀壯壯，單昕，等. 百菌清降解菌的分離鑒定及功能基因分析[J]. 農業工程學報，2020，36(19)：209-216.

Ren Xiaojie, He Zhuangzhuang, Shan Xin, et al. Isolation, identification and functional gene analysis of chlorothalonil degrading bacteria[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(19): 209-216. (in Chinese with English abstract)

[26] 劉標，尹紅梅，劉惠知. 豬毛角蛋白降解菌的分離篩選及其降解特性研究[J]. 農業工程學報，2019，35(7)：311-316.

Liu Biao, Yin Hongmei, Liu Huizhi. Isolation and identification of pig hair keratin-degrading strain and its degradation characteristic[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(7): 311-316. (in Chinese with English abstract)

[27] 郭亞男，張馨予，胥夢，等. 低溫萘降解菌的篩選、鑒定及降解條件優化[J]. 生物技術通報，2019，35(7)：100-107.

Guo Yanan, Zhang Xinyu, Xu Meng, et al. Screening, identification of naphthalene degrading bacteria at low temperature and optimization of their degradation conditions[J]. Biotechnology Bulletin, 2019, 35(7): 100-107. (in Chinese with English abstract)

[28] 蘇丹，鞏春娟，王鑫，等. 耐冷腐殖酸吸附態PAHs降解菌篩選及其降解特性[J]. 環境科學學報，2017，37(10)：3943-3950.

Su Dan, Gong Chunjuan, Wang Xin, et al. Isolation and charactrizaton of cold-resistance, PAHs-degrading bacterium[J]. ActaScientiaeCircumstantiae, 2017, 37(10): 3943-3950. (in Chinese with English abstract)

[29] 陽剛，楊第芹，曹文濤，等. 白酒糟纖維素降解菌的優選及酒糟降解工藝[J]. 農業工程學報，2020，36(13)：212-221.

Yang Gang, Yang Diqin, Cao Wentao, et al. Screening of cellulose degrading bacteria in distiller's grains and degradation technology of distiller's grains[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(13): 212-221. (in Chinese with English abstract)

[30] 董星辰，張曉昀，王亞男，等. 高效降解苯并芘假單胞菌的分離、鑒定與應用[J]. 環境科學與技術，2021，44(3)：1-7.

Dong Xingchen, Zhang Xiaoyun, Wang Yanan, et al. Isolation, identification and application of a benzopyrene degrading bacteriasp.[J]. Environmental Science & Technology, 2021, 44(3): 1-7. (in Chinese with English abstract)

[31] 劉聰洋，王美妮，張佳夢，等. 一株多環芳烴降解菌及其在多種強化體系中降解菲的潛力[J]. 生物工程學報，2021，37(10)：3696-3707.

Liu Congyang, Wang Meini, Zhang Jiameng, et al. A polycyclic aromatic hydrocarbon degrading strain and its potential of degrading phenanthrene in various enhanced systems[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2021, 37(10): 3696-3707. (in Chinese with English abstract）

[32] Yao S, Ni J, Ma T, et al. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification at low temperature by a newly isolated bacterium, Acinetobacter sp. HA2[J]. Bioresource Technology, 2013, 139: 80-86.

[33] 甄靜，李磊，王繼雯，等. 多環芳烴降解菌的篩選及降解特性分析[J]. 生物學雜志，2022，39(1)：46-50.

Zhen Jing, Li Lei, Wang Jiwen, et al. Isolation and analysis of degradation ability of PAHs-degrading bacteria tolerant to diverse physical settings[J]. Journal of Biology, 2022, 39(1): 46-50. (in Chinese with English abstract)

[34] 張秋雨，郭立泉，徐淼，等. 多環芳烴蒽在兩種貝類中的檢測及生物降解研究[J]. 食品安全質量檢測學報，2022，13(3)：902-908.

Zhang Qiuyu, Guo Liquan, Xu Miao, et al. Study on the detection and biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbon anthracene in 2 kinds of shellfishs[J]. Journal of Food Safety and Quality, 2022, 13(3): 902-908. (in Chinese with English abstract)

Isolation, identification and characterization of cold resistance and PAHs-degrading bacteria

Sun Nan, Zhu Guanglei, Yang Anpei, Wang Siming

(,150030,)

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are highly toxic organic contaminants. The ubiquitous class of aromatic compounds is usually composed of 2 to 7 aromatic rings in nature. The accumulation of PAHs has been widely spread in farmland soil in recent years. The reason can be that the various wastes and gas pollutants have been ever-increasing beyond the repairing and purification capacity of the environment in the world. Microbial remediation of PAHs can be expected to serve as high efficiency, low cost, and no secondary pollution. Among them, biodegradation has been the most potential soil remediation to eliminate the PAHs pollutants in the environment. Particularly, the PAHs have posed an enormous safety risk to the farmland soil ecosystems in Northeast China. The farmland soil contains a large number of carcinogenic, teratogenic, and mutation polycyclic aromatic hydrocarbons at present, due to the unreasonable use of agricultural inputs and sewage irrigation. However, the most commonly-used, commercial and microbial microorganism degradation of PAHs is confined to the climatic characteristics of the cold region in the farmland. It is a high demand for efficient PAH-degrading bacteria in the natural environment, particularly for the PAH-contaminated soil in the northern cold area. In this study, a typical pollutant of PAHs, phenanthrophene (PHE) was used as the substrate, in order to reduce the food risk of the farmland soil environment. The domestication temperature was 15℃ for the seven cold-resistant bacteria. The PHEs as the sole carbon and energy sources were screened from the soil. The bacterial mixtures were obtained from an equal volume mixture of seven strains. The high-performance liquid chromatography was then utilized to optimize the use conditions for the most effective strains or mixtures of strains. Three highly effective PHE-degrading capabilities (named DX-1, DX-2, and DX-3) were identified and screened out by the morphological observation and 16S rRNA gene sequencing. 16S rRNA gene sequencing analysis was performed on the DX-1, DX-2, and DX-3, which were identified assp.,sp., andsp., respectively. After identification and degradation performance, three strains with no antagonistic relationship between two and three combinations were selected, where the degradation rate of PHE reached 80% at 20°C, 5% inoculum, pH=8, 500mg/L substrate concentration, and the humic acid as exogenous substance. The broad-spectrum analysis of the carbon source of the strain showed that the cold-resistant bacterium degraded the PAHs of 2-5 loops between 15% and 85%. 75% PHE was degraded in the 60d, when the strain was applied to the soil at the temperature of 20℃. Consequently, the cold-resistant bacterium can be expected for the adaptation conditions of the actual soil environment. The finding can provide the immobilized strain and theoretical basis for the microbial remediation of PAH pollution in the contaminated black soil in cold areas.

soils; pollution; microbiology; cold area; cold resistant bacterium; PAHs; bioremediation

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.17.024

X53

A

1002-6819(2022)-17-0224-08

孫楠，朱廣雷，楊安培，等. 寒區降解多環芳烴耐冷菌株的分離鑒定及特性[J]. 農業工程學報，2022，38(17)：224-231.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.17.024 http://www.tcsae.org

Sun Nan, Zhu Guanglei, Yang Anpei, et al. Isolation,identification and characterization of cold resistance and PAHs-degrading bacteria[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(17): 224-231. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.17.024 http://www.tcsae.org

2022-07-02

2022-08-25

國家自然科學基金項目（52179034、51809043）；黑龍江省自然科學基金項目（YQ2019E006）；中國博士后科學基金項目（2017M621233）；中國黑龍江省土壤保護與修復重點實驗室開放項目（SPR2018002）

孫楠，教授，博士生導師，研究方向為農業水土環境修復。Email：sunnan@neau.edu.cn