快速協同濁點萃取-高效液相色譜法測定水中4種苯酚類化合物

楊曉穎， 姜 勛， 羅幸玲， 葉小華， 王 梅*

(廣東藥科大學公共衛生學院，廣東廣州 510310)

苯酚和對苯二酚、間苯二酚、鄰苯二酚是重要的化工原料，也是環境水體中常見的有機污染物。因其具有高毒性和難降解性，已被多個國家和地區認定為環境污染物并限制排放[1,2]。酚類化合物具有致癌、致畸和致突變的潛在毒性，會對人體健康和生態環境造成威脅。因此，有必要建立準確、靈敏、高效的分離分析方法，對環境水中酚類化合物進行監測。濁點萃取(CPE)應用于酚類化合物的預富集已有不少報道，但大多存在以下不足：單純使用表面活性劑對具有一定親水性的苯酚類化合物(如苯酚、苯二酚)直接進行萃取，導致總體萃取效果不佳；步驟較繁瑣，耗時較長。

快速協同濁點萃取(RS-CPE)是在經典CPE基礎上，通過加入協同誘導劑，室溫下即可產生濁點現象，快速完成對目標物分離萃取和富集過程的新型樣品預處理方法，具有快捷、經濟、環保等優點。RS-CPE由溫曉東等[3]于2011年提出，與分光光度法聯用測定銅。此后該課題組[4 - 9]、Rahnama[10,11]、楊靜[12]等學者將此技術拓展應用于鉛、鉍、鎳、硒、鈷和鉻等其他金屬離子的測定。目前所報道方法通常以Triton X-114、Triton X-100為萃取劑，以辛醇為協同誘導劑，通過添加絡合劑，如二乙基二硫代氨基甲酸鈉、雙硫腙、1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚、2,2′-呋喃二肟等，將金屬離子轉化為可被表面活性劑相萃取的疏水性物質。在酚類污染物測定方面，我們課題組選用PEG-6000作萃取劑，克服Triton X系列所帶來的干擾，通過加入辛醇，將其濁點(100 ℃)降至室溫，成功建立了與熒光分光光度法聯用檢測苯酚的方法。

選擇合適的協同誘導劑是在常溫下實現RS-CPE的關鍵，我們課題組通過實驗發現，合適的協同誘導劑應具有以下共通性：(1)具有適當的疏水性，可降低濁點溫度；(2)粘度低，能直接稀釋富集相；(3)在特定條件下能與水溶液快速分離并快速完成萃取的過程。乙腈與水互溶，粘度小，是一種同時具有親水性和疏水性的兩親性極性非質子有機溶劑，可作為高效液相色譜的流動相；也常應用于各種樣品前處理中。此外，與傳統液-液萃取法中常用的有機溶劑相比，乙腈危害低，因此成為研究者使用有機溶劑的首選[13 - 15]。乙腈與水混溶時形成的是微觀不均一的溶液，這為乙腈/水溶液產生相分離，實現對疏水性和親水性的萃取提供了理論依據[16]。因此，若乙腈能應用于RS-CPE中，將會改善其萃取效果。目前尚未見乙腈RS-CPE應用于萃取苯酚類化合物的報道。本研究建立了以乙腈作協同誘導劑，測定水中4種苯酚類化合物的RS-CPE-HPLC新方法。對協同誘導劑、表面活性劑、絡合劑等影響因素進行優化，并將該方法應用于實際工業廢水中4種苯酚類化合物的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

LC-20A型高效液相色譜儀、Shim-pack VP-ODS型C18色譜柱、RF-10AXL型熒光檢測器(日本，島津公司)；F-2500型熒光分光光度計(日本，日立高新技術公司)；Synergy超純水系統(美國，Merck Millipore公司)。

仲醇聚氧乙烯醚15-S-7(Tergitol 15-S-7)、磷酸三丁酯(TBP)均購自美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈均購自上海安譜公司；鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚、苯酚(純度為99%，均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司)；乙酸(天津，科密歐公司)。以上試劑純度均在分析純以上，實驗用水均為Synergy超純水機系統制備。實驗所用器皿均用10%硝酸+10%乙醇溶液浸泡12 h后,超聲清洗20 min，然后依次用自來水、超純水清洗，晾干待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜條件流動相A：甲醇；流動相B：乙腈；流動相C：1%乙酸水溶液；流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10.0 μL。采用梯度洗脫程序：0～6 min，A∶B∶C=20∶20∶60；6～7 min：A上升至65%；7～12 min：A∶B∶C=65∶20∶15；12～13 min：A下降至20%；13～20 min：A∶B∶C=20∶20∶60。檢測波長程序為：0～3.8 min：激發波長/發射波長為295/325 nm，3.8～20 min：激發波長/發射波長為275/305 nm。

1.2.2 苯酚類化合物標準溶液的配制1.00 mg/mL的4種苯酚類化合物的各標準儲備液配制：分別準確稱取25.00 mg的4種目標物標準品于4個25.00 mL容量瓶中，用純甲醇定容至刻度并密封保存于4 ℃冰箱中。5.00 mg/L的4種苯酚類化合物混合標準工作液配制：分別取50.0 μL(1.00 mg/mL)的上述4種苯酚化合物的標準儲備液于10.00 mL容量瓶中，用純甲醇定容至刻度并密封保存于4 ℃冰箱中。

1.2.3 快速協同濁點萃取過程分別移取50.0 μL 5.00 mg/L的4種苯酚類化合物混合標準溶液或者取7.0 mL水樣至10.0 mL離心管中，依次加入Na2SO40.28 g，20% Tergitol 15-S-7溶液1.0 mL，乙腈1.0 mL，磷酸三丁酯0.5 mL，用HCl將溶液pH調節至4.0，并用超純水定容至10.0 mL。隨后旋緊瓶蓋，振蕩搖勻，并以3 500 r/min轉速離心5 min加速分相，離心后直接取上層富集相過濾，進行HPLC檢測。

1.2.4 樣品制備自來水和工業廢水樣品用0.45 μm水系濾膜(津騰，混合纖維素膜，Φ=50 mm)過濾后，貯存于4 ℃冰箱中，盡快測定。

2 結果與討論

2.1 絡合劑的選擇與優化

苯酚類化合物作為親水性較強的極性物質，在RS-CPE過程中需要使用適當的絡合劑與之形成疏水性強的絡合物，才能更好地被萃取進入富集相中。磷酸三丁酯作為一種中性磷氧類萃取劑，常被用作多種金屬、酚類化合物的絡合劑[17,18]。因此，本研究選擇磷酸三丁酯作絡合劑并考察其用量對目標物萃取的影響，結果如圖1所示。由圖可見，使用0.5 mL磷酸三丁酯時，所得峰面積最大，繼續增加其用量則峰面積基本保持不變，說明0.5 mL即可使目標物完全被絡合。因此，選擇0.5 mL磷酸三丁酯作后續研究的最優條件。

2.2 協同誘導劑的選擇與用量

為選擇合適的協同誘導劑，本實驗對甲醇、乙醇、乙腈進行了評估，以簡化CPE過程。將甲醇、乙醇、乙腈分別與0.5 mol/L Na2SO4結合，發現甲醇不能將濁點溫度降至室溫，也未觀察到渾濁；加入3.0 mL乙醇則形成了大量富含表面活性劑的相；而隨著乙腈體積的增加，體系的濁點溫度在逐漸降低。此外，與乙醇相比，乙腈與HPLC的相容性更好，且產生的富表面活性劑相體積較小。分析原因可能是乙腈的加入改變了溶液的極性、溶解度、密度等相關參數，并且在電解質鹽析的作用下，乙腈的弱親水基氰基與水的作用力被打斷，從而為表面活性劑提供一個疏水作用力，間接影響膠束的臨界膠束濃度、膠束大小以及析相行為[19]。乙腈自身具有一定的疏水性和萃取目標物的能力，故其還可以輔助萃取提高萃取率；并且由于乙腈的粘度小，少量的乙腈溶解于表面活性劑富集相中可起到降低富集相粘度的效果，萃取后的富集相可直接過濾后進行HPLC檢測。故選用乙腈為RS-CPE的協同誘導劑。

實驗對乙腈用量進行探討(圖2)，當乙腈用量為0～1.0 mL時，4種苯酚類化合物的峰面積逐漸增大，并保持相對平穩狀態，1.5～2.5 mL開始下降?？赡苁巧倭康囊译鎱f同輔助萃取效果較差，所得富集相較粘稠，需進一步稀釋；然而大量的乙腈會增大富集相體積，稀釋了目標物，使萃取率下降。綜合考慮環保、經濟與實驗效果，最后選定1.0 mL的乙腈進行后續研究。

圖1 磷酸三丁酯(TBP)對4種苯酚類化合物萃取率的影響Fig.1 Effect of tributyl phosphate (TBP) on the extraction of four phenolic compounds

圖2 乙腈對4種苯酚類化合物萃取率的影響Fig.2 Effect of acetonitrile on the extraction of four phenolic compounds

2.3 表面活性劑用量

RS-CPE中表面活性劑的用量是影響萃取效率和富集倍數的重要因素之一。Tergitol 15-S-7因不含苯環結構，不干擾4種目標物的HPLC檢測，同時其支鏈少，對目標物的增溶能力強，所得的富集相體積較小，可獲得較高富集倍數，本研究選用Tergitol 15-S-7作萃取劑。

實驗分別考察了0～1.25 mL 20%Tergitol 15-S-7對目標物萃取效果的影響。如圖3所示，4種目標物的峰面積隨萃取劑用量的增加而逐漸上升，當用量達到1.0 mL后，峰面積保持平穩。因此，選擇20%Tergitol 15-S-7用量為1.0 mL。

2.4 溶液pH的優化

溶液pH值在RS-CPE過程中起著至關重要的作用，目標分析物含有羥基，其存在狀態會隨溶液pH的改變而改變。此外，pH值過高或過低也會導致苯酚類化合物與磷酸三丁酯形成的絡合物不穩定或發生其他反應，影響萃取效果。在確保其他條件一致的情況下，用HCl、NaOH溶液調節溶液的pH，考察了溶液pH在2.0～9.0范圍內，4種苯酚類化合物萃取率的變化情況(圖4)。結果表明，4種目標物的萃取率在pH=2.0～8.0范圍內相對穩定，在pH=9.0時苯酚和間苯二酚有輕微降低的趨勢，鄰苯二酚和對苯二酚下降明顯，故選溶液pH=4.0作最佳實驗條件進行后續研究。

2.5 電解質種類與濃度的選擇

濁點萃取時，添加適量電解質會迫使膠束中的氫鍵斷裂并使疏水基團脫離水相，可降低表面活性劑的濁點溫度、減小凝聚相體積、改變主體水相的密度，從而加速分相。前期實驗探索了4種常用NaCl、Na2CO3、Na2SO4、Na3PO4對濁點溫度和目標物萃取效果的影響。結果顯示Na2SO4效果最佳，故選擇Na2SO4為電解質增強離子強度。同時考察了Na2SO4濃度范圍在0～0.7 mol/L時對目標分析物萃取效果的影響，結果顯示，萃取率隨Na2SO4濃度的增加而增加，至0.2 mol/L時，萃取率達到最大，之后基本保持不變。因此實驗選擇無水Na2SO4最佳濃度為0.2 mol/L。

圖3 20% Tergitol 15-S-7對4種苯酚類化合物萃取率的影響Fig.3 Effect of 20% Tergitol 15-S-7 on the extraction of four phenolic compounds

圖4 溶液pH對4種苯酚類化合物萃取率的影響Fig.4 Effect of solution pH on the extraction of four phenolic compounds

2.6 離心轉速與時間的優化

離心可使分散在溶液中的萃取劑聚集，促進萃取劑與水相的分離。但離心時間過長，溫度升高，可能會使表面活性劑熔化而發生損失[20]，導致萃取率下降；若離心時間過短則會導致相分離不完全。實驗結果表明，離心轉速與時間對4種目標物萃取率的影響均不大，且離心轉速為3 500 r/min，離心時間為10 min時，即可獲得澄清的富集相和水相，故選該條件用于后續實驗。

2.7 方法評價

以4種苯酚類化合物的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，峰面積的倒數作權重，做線性回歸方程，結果如表1所示。對苯二酚、間苯二酚、鄰苯二酚和苯酚在0.1～191 μg/L濃度范圍內具有良好線性，線性相關系數(r)均大于等于0.9996。分別以3倍和10倍的信噪比計算方法的檢出限和定量限，4種目標物的檢出限范圍為0.02～0.04 μg/L，定量下限為0.07～0.13 μg/L。同時，為了考察該方法的精密度，在最佳的實驗條件下，對4種苯酚類化合物的濃度為25.0 μg/L混合標準溶液平行萃取測定6次，所得相對標準偏差均小于2.58%，說明該方法的重現性高，精密度好。此外，在最佳實驗條件下，4種苯酚類化合物的富集倍數為8.68～9.96，萃取率高達86.8%以上。

表1 4種苯酚類化合物乙腈RS-CPE方法的分析特征、萃取率和富集倍數

2.8 方法的實際應用

為了驗證該方法的實際應用性，在優化的實驗條件下，對采集的7份工業廢水和1份實驗室自來水水樣進行檢測，結果見表2。在樣本工業廢水4、5、6中檢測到苯酚濃度為1.06～5.04 μg/L，在工業廢水7中檢測到鄰苯二酚和苯酚濃度分別為1.52 μg/L和5.37 μg/L，4種目標物的樣品加標回收率在93.9%～107%之間，相對標準偏差均小于5.53%，表明該方法適用于實際環境水樣中苯酚類化合物的分析檢測，4種苯酚類化合物的空白水樣和加標水樣的色譜圖見圖5。

表2 4種苯酚類化合物水樣檢測結果和加標回收率±RSD(%，n=3)

(續表3)

圖5 經RS-CPE(乙腈)后的空白水樣和加標水樣色譜圖Fig.5 Chromatograms of blank and spiked sample after acetonitrile RS-CPEA:the addition of 25 μg/L mixed standard solutions,B:the addition of 5 μg/L mixed standard solutions,C:the blank water sample.

2.9 與其他方法的比較

將本方法與其他方法進行對比(表3)，本實驗通過使用協同誘導劑，省去了水浴和稀釋步驟，更為簡捷，1 min內即可同時完成對目標物的萃取，8 min可完成整個前處理過程，相較于On-line FI-ME、UA-CPE，特別是SPE有突出優勢。而且所用的試劑均已商品化，可購買且價格低廉，不需要花費長時間進行前期制備，重復性好。其次，本實驗盡管獲得的富集倍數不高，但其檢測限較低，同時在實驗過程中選用環保的表面活性劑作萃取劑，減少了有毒有害有機溶劑的使用，更符合“綠色化學”的理念。

表3 不同方法測定4種苯酚類化合物的比較

3 結論

本實驗表明，乙腈作為一種新型的協同誘導劑，不僅可以輔助降低濁點、稀釋富集相，還可以協同萃取，提高萃取率。本文成功將乙腈RS-CPE方法應用于分析測定環境水樣中4種苯酚類化合物(鄰/間/對苯二酚和苯酚)，取得了較為滿意的結果。該方法簡單、靈敏、成本低、省時、重現性良好；同時也符合綠色環保的要求，因此在分析測定痕量污染物中有較好的應用前景。