免疫組化檢測與RNA 原位雜交檢測三陰性乳腺癌組織程序死亡受體1 一致性研究

郭一君，劉 丹，何 淼，呂晨光

北部戰區總醫院 普通外科，遼寧 沈陽 110016

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤［1-2］。三陰性乳腺癌（triple negative breast carcinoma，TNBC）患者的雌激素受體、孕激素及人表皮生長因子受體2 均呈現出陰性［3］。TNBC患者約占乳腺癌患者的15%，預后較其他類型乳腺癌患者預后差［4］。程序死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）是診斷和治療TNBC 新的突破口［5］。PD-1 為細胞表面膜的膜蛋白之一，是T 細胞與B 細胞表面的抑制性信號受體，與T 細胞表面程序性死亡-受體1（programmed death-gland1，PD-L1）相結合，具有抑制T 淋巴細胞免疫功能的作用，使腫瘤無法被免疫監視［6］。本研究采用免疫組化檢測（immuno-histochemistry，IHC）與RNA 原位雜交（RNA in situ hybridization，RNAscope）檢測PD-1 水平，分析并判斷兩種方法的一致性與優劣?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2019 年3 月到2021 年4 月北部戰區總醫院收治的62 例TNBC 患者為研究對象?；颊吣挲g40～70 歲；根據乳腺癌組織學分級分為Ⅲ級20 例，Ⅱ級11 例；伴大汗腺分化癌5 例，伴髓樣癌4 例，浸潤性小葉癌5 例，腺樣囊性癌4 例，化生性癌5 例，腺泡細胞癌7 例，低級別腺鱗癌1 例。納入標準：檢查前均為接受乳腺癌手術治療；病理學檢查為原發性乳腺癌；符合《乳腺癌雌、孕激素受體免疫組化學檢測指南》［7］及《乳腺癌外科學》［8］相關的TNBC 診斷標準。排除標準：合并有心、肝、腎等臟器腫瘤；合并凝血功能障礙；患有精神類疾病且交流溝通障礙。

1.2 研究方法 分別運用IHC 和RNAscope 檢測PD-1 狀態。石蠟組織進行切片為5 μm，使用二甲苯脫蠟15 min，使用100%、95%、85%、75%乙醇的梯度酒精脫二甲苯6 min，使用流動自來水反復沖洗，進行微波抗原修復，加入過氧化氫阻斷液，降低內源性過氧化物酶。加入PD-1（鼠抗人，克隆號UMAB187）抗體，用3，3-二氨基聯苯胺溶液顯色。將切片經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂封固。RNA 原位雜交檢測探針來自南京鐘鼎生物技術有限公司，熒光標記PD-1mRNA。比較RNAscope 與IHC 結果。根據細胞質或細胞核中有棕色標點判讀RNA 原位雜交結果：1～10 個點為1 分，10～15 個點記為2 分，15～20 個點記為3 分，棕色標點＞20 個點記為4 分，分數≥1 分為抗體表達陽性。IHC 檢測結果判讀：細胞膜或細胞質出現棕色黃色反應≥5%為陽性，出現棕色黃色反應＜5%為陰性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計數資料以例（百分率）表示，組間比較采用χ2檢驗、Kappa檢驗。Kappa ＞0.75 為一致性好，0.4 ≤Kappa ＜0.75 為一致性一般，Kappa ＜0.40 為一致性差。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者IHC、RNAscope 檢測結果 IHC 檢測方法定位于細胞膜，檢測陽性患者占83.9%（52/62），陰性患者占16.1%（10/62）。RNAscope 定位于細胞核與細胞質，檢測陽性率為91.9%（57/62），陰性率為8.1%（5/62）。

2.2 IHC 與RNAscope 檢測一致性 RNAscope檢測與IHC檢測結果相關性Kappa=0.758（P ＜0.05）。IHC 與RNAscope 檢測一致性較強。

3 討論

TNBC 病死率高、且容易復發，約占我國乳腺癌患者的15%，主要為絕經前女性［9］。TNBC 常見于年輕女性，40 歲以下女性患有TNBC 的風險是50 歲以上女性的2 倍，據美國癌癥協會統計，每年約有26 萬女性被診斷為乳腺癌，其中15%～20%患有TNBC，且發病率呈明顯上升趨勢［10］。

TNBC 多呈單發小腫塊，晚期可出現“酒窩征”、“橘皮樣變”、皮膚潰瘍、淋巴結腫大。部分患者可見遠處轉移，侵犯肺、肝、腦等臟器。乳腺癌的影像學表現與病理學預后指標之間存在一定關聯，TNBC 為高侵襲性的腫瘤，超聲檢查能有效觀測內部回聲與血流情況。對于TNBC 患者的診斷，應綜合分析臨床病理及影響學特征，結合不同患者的自身情況制定個體化診療方案，降低臨床診斷的假陽性或假陰性率，切實提高TNBC 患者診斷準確率。

有研究表明，PD-1 是細胞表面膜蛋白，能與腫瘤細胞配體PD-L1 結合，降低T 細胞的分化、增殖，但調節性T 細胞活性得到激活，機體對腫瘤細胞的殺傷效益被削弱［11］。這為臨床工作者提供治療思路：可通過抑制腫瘤表面的PD-1，減少對免疫系統的影響。靶向PD-1 治療也是TNBC治療的重要方法。目前檢查PD-1 的方法有多種，本研究選擇RNAscope 檢測與IHC。IHC 診斷效果顯著，但在腫瘤分辨中有一定的局限性，依賴于抗體［12］。RNAscope 技術是一種新型RNA 原位雜交技術，在6～8 h 即可完成，可進行單染色和多重染色、操作流程簡單，能有效了解腫瘤異質性，分析基因的表達情況。RNAscope 在臨床檢驗診斷上具有高度敏感性，根據堿基互補配對原理對特定基因的mRNA 水平進行檢測［13］。HC 檢測方法定位于細胞膜，檢測陽性患者占83.9%（52/62），陰性患者占16.1%（10/62）。RNAscope 定位于細胞核與細胞質，檢測陽性率為91.9%（57/62），陰性率為8.1%（5/62）。RNAscope 檢測與IHC檢測結果相關性Kappa=0.758（P＜0.05），IHC 與RNAscope檢測一致性較強。臨床工作者診斷 TNBC 時可使用IHC 與RNAscope 聯合檢測PD-1。

綜上所述，IHC 與RNAscope 檢測TNBC 效果較好，且IHC 和RNAscope 檢測PD-1 一致性較強。