中藥多成分藥代動力學分析技術研究進展

李元元，王彩虹，生 寧，馬聰玉，張金蘭

(中國醫學科學院藥物研究所，北京 100050)

中藥藥代動力學是研究中藥活性成分或指標成分在體內吸收、分布、代謝和排泄的動態變化規律，與藥效學結合詮釋中藥的安全性和有效性，為中藥發揮藥效的物質基礎、作用機制、復方組方原理及中藥傳統理論的科學闡釋提供依據，是詮釋中藥理論和機制的橋梁學科。由于中藥成分的復雜性及藥效物質尚不明確，其藥代動力學研究存在諸多困難，如中藥化學組成復雜、體內代謝途徑多樣、體內成分結構鑒定和代謝途徑詮釋困難；中藥藥效成分不明使藥代動力學研究的目標成分不明確，且目標成分在生物樣本中的濃度低、內源性基質和目標成分之間干擾大、中藥成分及其代謝產物對照品有限，使中藥多成分檢測和定量分析方法的建立存在困難。

隨著分析技術的快速發展，研究人員通過探索并開發適合中藥多成分分析的新技術，有力地推動了中藥多成分藥代動力學研究，實現了體內中藥多成分高效、全面的定性分析和靈敏、快速、準確、寬動態范圍的定量分析。本文將對近10年來中藥藥代動力學研究的分析技術發展及應用進行綜述。

1 樣本前處理技術

生物樣本的前處理技術主要包括提取、分離與富集，以達到提高分析靈敏度和準確度，同時降低基質干擾的目的[1]。在中藥多成分藥代動力學研究中，給藥液自身的復雜性和所采集生物樣本中內源性物質、中藥原型成分及代謝產物的復雜性等都對生物樣本前處理技術提出了更高的要求。中藥藥代動力學研究采集的生物樣本通常包括體液(血漿、血清、尿液、膽汁等)和組織器官(心、肝、腦、腸等)，前處理方法主要有蛋白沉淀法、液-液萃取法和固相萃取法[2]。由于生物樣本的基質復雜、中藥待測成分含量低且不易提取，研究人員需要針對具體生物樣本和待測目標成分的理化性質系統地優化并選擇適合的前處理技術。另外，針對特定化合物的理化性質還需采用特殊的方式，如黃芩苷和黃芩素在生物樣本中易發生氧化，需要在樣本采集后加入抗壞血酸進行保護[3-4]。針對生物樣本中不穩定成分采用的穩定劑列于表1。

表1 生物樣本中不穩定成分采用的穩定劑Table 1 Stabilizers for unstable components in biological samples

1.1 常用前處理技術

1.1.1蛋白沉淀法 蛋白沉淀法(protein precipitation,PPT)適用于含藥濃度較高的生物樣本，具有操作簡單、設備要求不高等特點，主要用于血漿和組織樣本的前處理，常用的有機溶劑包括乙腈、甲醇和乙醇等，將不同有機溶劑按不同比例混合能夠影響生物樣本中蛋白的變性和沉淀過程，從而影響化合物的提取回收率。例如，Chen等[14]使用含不同比例乙醇的乙腈蛋白沉淀法比較了大鼠血漿和組織樣本中沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸等15種中藥火炭母成分的提取效率，發現當乙醇與乙腈體積比為1∶1時，各成分的提取回收率最佳，均大于80%，實現了大鼠給藥火炭母提取物后多成分血漿藥代動力學和組織分布研究。

1.1.2液-液萃取法 液-液萃取法(liquid-liquid extraction,LLE)的優點在于其具有較高的選擇性，可通過使用不同的萃取溶劑選擇性去除生物樣本中的干擾物質。但該方法難以應用于多個極性差異較大化合物的同時提取，必要時需采用多步液-液萃取法。例如，尼莫地平和銀杏葉提取物聯用對血管性癡呆患者具有較好的臨床療效，但銀杏葉提取物的主要活性成分黃酮類化合物在體內以苷元、葡萄糖醛酸化代謝物和硫酸化代謝物3種形式存在，與尼莫地平的極性差異較大?；诖?，Xiao等[15]開發了兩步萃取法，即先用正己烷-乙醚混合溶劑提取大鼠血漿中的尼莫地平，剩余殘渣經酸水解，將黃酮的葡萄糖醛酸化代謝物和硫酸化代謝物轉化為黃酮苷元后，再用乙酸乙酯充分提取，實現了大鼠血漿中尼莫地平和銀杏葉提取物多成分的同時定量分析。實驗結果表明，與單藥給藥相比，聯用給藥不會改變尼莫地平或銀杏葉提取物成分在大鼠體內的藥代動力學行為，為聯用給藥劑量和方案的制訂提供了數據支持。

1.1.3固相萃取法 固相萃取法(solid phase extraction,SPE)在降低內源性物質干擾、減少基質效應方面極具優勢。通常采用商品化的固相萃取小柱，按其所用填料主要分為反相填料[16](硅膠鍵合C4、C8、C18和Phenyl)、正相填料[16](硅膠鍵合Si-CN、Si-NH2和Si-Diol)、離子交換填料[17](硅膠鍵合Si-WAX、Si-SAX、Si-SCX和Si-WCX)以及混合型填料[18](分子印跡聚合物和分子印跡膜)，一般需依據分析物的極性、溶解度、解離常數(pKa)等理化性質選擇合適的固相萃取柱。Zheng等[19]開展了益氣復脈粉針劑在心力衰竭大鼠體內的藥代動力學研究，使用甲醇或乙腈蛋白沉淀法，以及乙酸乙酯、氯仿或正丁醇液-液萃取法均無法排除大鼠血漿中內源性物質對人參皂苷類成分的基質干擾，且提取回收率較低；而采用Waters Oasis HLB固相萃取小柱前處理后可使基質效應符合要求，各人參皂苷類成分的提取回收率大于60%，實現了益氣復脈粉針劑給藥后大鼠血漿中10種人參皂苷類成分的準確定量。

近年來，隨著新型固相吸附劑的開發，固相萃取小柱得到了較快發展。從傳統的反相固相吸附劑發展到兩親性固相吸附劑(同時具備非極性和極性官能團)，其可以保留極性至非極性化合物，適用于理化性質差異較大的中藥多成分前處理要求。同時，為適應生物樣本的大規模、平行、快速處理，高通量固相萃取板和集成式全自動固相萃取儀相繼產生，并出現了一些無需活化和平衡的“快速”固相萃取小柱(例如，默克SupelTMSwift HLB小柱)，極大地提高了中藥多成分藥代動力學研究的分析通量。

1.2 微萃取技術

除常規PPT、LLE和SPE外，一些新型的生物樣本前處理技術不斷涌現。微萃取技術具有高通量、消耗樣本量和溶劑量小等特點，主要包括固相微萃取技術(solid-phase microextraction,SPME)[20]、攪拌棒吸附萃取技術(stir bar sorptive extraction,SBSE)[21]、填充吸附劑微萃取技術(microextraction by packed sorbent,MEPS)[22]和單滴微萃取技術(single drop microextraction,SDME)[23]等。微萃取技術的最大優勢在于集生物樣本分離、富集、濃縮于一體，可與分析儀器直接聯用，極大地提高了樣品的前處理效率。同液相色譜相比，微萃取部件更容易直接與氣相色譜進樣口端嵌和連接。例如，Deng等[24]通過優化纖維涂層種類、樣品溫度、萃取時間、攪拌速度等關鍵參數，建立了適用于兔血漿中細辛醚提取和富集的頂空固相微萃取-氣相色譜聯用技術，整個樣品的前處理僅需20 min，且無需有機溶劑，高效快速地表征了兔口服石菖蒲揮發油后血漿中細辛醚的藥代動力學。但與常規的前處理技術相比，微萃取技術需要實驗前期繁復的條件摸索和優化，對操作人員的要求較高，限制了其廣泛應用。

1.3 微透析技術

中藥藥代動力學研究常用的取樣方法主要是在給藥后不同時間點取動物全血或動物組織進行勻漿，采集的生物樣本通常要經過分層、離心、萃取、過濾等繁瑣的前處理操作。微透析(microdialysis)作為一種生物活體取樣技術，基于擴散的分離原理將帶有半透膜裝置的探針植入生物體內，在非平衡條件下只有游離的小分子藥物能沿濃度梯度擴散至探針，并被灌流液不斷帶出，得到含有藥物的透析液，操作流程示于圖1。由于該技術使用的半透膜只允許小分子物質透過，大分子蛋白和脂類物質則被截留，因此透析液可以不經前處理直接測定。除此之外，微透析技術可以實現單個或多個部位的連續實時采樣，降低實驗動物體液損失、減少動物個體差異對結果的干擾[25]，該技術已應用于中藥多成分體內分析研究。例如，Fu等[26]經微透析采樣，結合液相色譜-三重四極桿質譜聯用技術比較了正常大鼠和阿爾茨海默癥模型大鼠的血漿和腦脊液中10種木脂素類成分的藥代動力學差異，發現阿爾茨海默癥病理狀態能夠顯著改變木脂素類成分在大鼠體內的藥代動力學行為，提示研究人員應充分關注疾病狀態對中藥多成分藥代動力學的影響。歐詠[27]在大鼠血管、肝臟、膝關節多部位同時植入微透析探針，可同時動態監測中藥復方三妙丸給藥后小檗堿在大鼠血、肝臟和膝關節中的濃度。微透析技術的另一優勢在于其可與分析儀器直接聯用，提高實驗效率且避免前處理過程中的交叉污染和操作誤差。例如，Wang等[28]研發了在線聯用的接口裝置，實現了微透析實時取樣與超高效液相色譜-串聯質譜的聯用，并將其應用于慢性腦缺血大鼠給藥刺五加提取物后6種主要活性成分在腦內的藥代動力學研究，同時監測腦內神經遞質的動態變化規律，闡明了刺五加提取物活性成分透過血腦屏障的能力和對神經遞質的調控作用。

圖1 微透析技術示意圖Fig.1 Schematic diagram of microdialysis technique

1.4 樣本自動化前處理技術

中藥藥代動力學研究常需要對大批量樣本進行前處理，快速、準確和自動化的前處理技術不僅能夠提高檢測通量，還有助于減少人為過程的影響。目前，多家公司已經研發出專門用于蛋白沉淀法和固相萃取法的96孔板和固相萃取系統，如Waters公司的Sirocco蛋白沉淀板、Oasis固相萃取板和配套的96孔正壓提取裝置，Agilent公司的Captiva蛋白沉淀板和Bond Elut固相萃取板，Thermo公司的HyperSep蛋白沉淀板和HyperSep-96固相萃取裝置等；另外，在線固相萃取、固相微萃取和微透析技術也漸趨成熟。自動化的前處理技術極大提高了中藥生物樣本的前處理通量，如Tao等[29]以甲醇和乙酸乙酯為洗脫溶劑，采用Waters Oasis HLB μElution 96孔固相萃取板對大鼠灌胃給予麝香保心丸后的血漿樣本進行前處理，結合液相色譜-質譜聯用技術研究9種人參皂苷和7種蟾蜍二烯羥酸內酯成分的藥代動力學特征；Pascale等[30]采用Agilent Captiva EMR-Lipid 96 孔蛋白沉淀板用于人口服5種姜黃提取物制劑后血漿樣本的前處理，結合液相色譜-質譜聯用技術研究姜黃素及其主要代謝產物的藥代動力學特征，實現了生物樣本的高通量分析。

2 分析技術

中藥體內成分和代謝物分析具有成分復雜、干擾多、含量低、濃度變化動態范圍寬和數據處理工作量大等特點，需要分離效能高、靈敏度高、選擇性好的分析技術。

2.1 色譜分析技術

2.1.1高效液相色譜法 高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)是目前中藥藥代動力學應用最廣泛的分離技術，能夠分離極性、離子化、不易揮發和熱不穩定的化合物，具有分離效能高、適用范圍廣、選擇性好的特點。為進一步縮短高效液相色譜的分析時間，提高分離效率，超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)逐漸得到應用，其基于HPLC原理，采用小顆粒填料色譜柱(粒徑小于2 μm)和超高壓系統(壓力大于105 kPa)，具有分離效率更高、分析速度更快、重現性更好等優點，在中藥及中藥生物樣本的分析中發揮了巨大的優勢[31]。Wei等[32]采用超高效液相色譜-三重四極桿質譜技術同時測定比格犬灌胃給藥補骨脂提取物后血漿中的10種活性成分，研究補骨脂提取物中多成分藥代動力學特征，在保證待測的2對同分異構體達到基線分離的同時，每個樣本的分析時間僅需8.5 min，該方法適用于大樣本量的藥代動力學分析。

根據流動相與固定相極性的差別程度，將高效液相色譜分為反相液相色譜(reversed phase liquid chromatography,RPLC)和正相液相色譜(normal phase liquid chromatography,NPLC)。RPLC是目前應用最廣的色譜分離技術，它能與各種常規的檢測方法結合，解決多種分析問題，但對極性和親水性化合物卻很少或無法保留。采用NPLC法分析極性和親水性化合物同樣存在局限性。親水相互作用色譜(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)采用極性固定相和高比例有機相-水的流動相。近年來，HILIC受到越來越多的關注[33-35]：一方面是對強極性和親水化合物有很好的保留和分離選擇性，與反相色譜有很好的互補性，同時，使用的流動相體系相對簡單，克服了正相色譜流動相對水溶性物質溶解性差、與質譜檢測器不兼容的問題。另一方面是因為強極性化合物的分離引起各研究領域的關注，如代謝組學、藥物分析等；氨基、酰胺基、氰基、二醇基等都是親水相互作用色譜常見的鍵合相類型，實驗時可依據待測成分性質進一步優化色譜柱類型。Sun等[36]在開展中藥烏頭活性成分附子寧堿在大鼠血漿中的藥代動力學研究時發現，附子寧堿在反相色譜柱上幾乎無保留(保留時間小于2 min)，而使用鍵合有聚丙烯酰胺的HILIC色譜柱后，附子寧堿可與血漿中其他干擾物質有效分離，能夠滿足藥代動力學研究的要求。

經典的一維色譜分離有時存在峰容量低和峰重疊等問題，難以實現中藥及其代謝物全組分的準確定性和定量。而二維液相色譜通過2個不同分離模式的色譜柱分離樣品，顯著提高了系統峰容量和分離度[37]，成為分離中藥復雜樣品的有效工具。針對中藥莪術提取物在常規一維液相色譜分離時存在色譜峰重疊、基線干擾、成分鑒定少的問題，Zhou等[38]建立RPLC×RPLC-Q-TOF/MS分析方法，第一維采用苯基/四唑硫醚(PTAS)鍵合相色譜柱，第二維采用C18色譜柱，兩者的正交性可達93.2%，從莪術提取物中識別出439個色譜峰，鑒定出105種成分，其中有73種成分尚未見文獻報道，解決了莪術成分表征不充分的問題。但受限于二維流動相兼容性差、閥切換過程樣品丟失和多維數據處理困難等技術瓶頸，尚未見二維液相色譜在中藥多成分藥代動力學中的應用，但其提供的全新分析模式值得借鑒。

2.1.2氣相色譜法 氣相色譜(gas chromatography,GC)與質譜聯用后用于中藥揮發性成分的分析，具有分離效率高、靈敏度高和通量高的特點。電子轟擊離子源(EI源)是氣相色譜-質譜聯用儀最常用的電離源，其性能穩定、碎片重現性好、特征性強，且有成熟的化學物質標準譜庫(如NIST和Wiley數據庫等)可供檢索。目前，氣相色譜工作站均搭載了上述化合物標準譜庫，極大地提高了化學成分結構鑒定的效率和準確度。Lan等[39]采用氣相色譜-質譜法結合NIST 14標準譜庫快速表征了莪術藥材中40種揮發油成分，與聚類分析相結合實現了來源于5個產地共30批莪術藥材的區分和質量評價。氣相色譜-質譜技術同樣適用于分析中藥生物樣本中的揮發性成分，如Fan等[40]采用氣相色譜-質譜技術表征了大鼠口服細辛提取物后血漿中揮發性成分黃樟素和甲基丁香酚的藥代動力學特征；Wang等[41]基于氣相色譜-質譜技術研究了石菖蒲揮發油給藥后大鼠血漿中4種揮發性苯丙素類成分的藥代動力學特征。

2.2 質譜分析技術

2.2.1質譜離子化技術 中藥多成分藥代動力學要求盡可能多的分析中藥原型成分及代謝產物，因此要求質譜能夠同時電離不同種類和結構的化合物，給離子化技術帶來了挑戰。電噴霧電離(electrospray ionization,ESI)[42]和大氣壓化學電離(atmospheric pressure chemical ionization,APCI)[43]是近年來液相色譜-質譜中的主流離子化技術。ESI通過液滴的形成、去溶劑化和氣相離子的形成，使非揮發性溶液相離子轉為氣相，適合分析極性化合物和生物大分子。APCI是在大氣壓下以試劑離子和靶分子之間的電荷轉移為基礎，對產生的靶離子進行質量分析，其對ESI源難以電離的弱極性化合物有較好的電離能力，與ESI源優勢互補。羽扇豆醇是中藥中廣泛存在的一種活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、促進創面愈合等藥理作用，但其為五環三萜類成分，分子結構中缺少發色團，難以應用紫外檢測器檢測，且分子極性弱，ESI源電離效率低。因此，Khatal等[44]基于APCI源，使用UPLC-MS/MS技術成功表征了大鼠給藥羽扇豆醇后的血漿藥代動力學。

電子轟擊電離(electron impact,EI)和化學電離(chemical ionization,CI)是氣相色譜-質譜中常用的電離方式。在一定能量的電子作用下，EI將易揮發的樣品分子電離，使其聚焦成離子束進入質量分析器，可獲得豐富的化合物碎片信息，譜圖重現性好。Li等[45]采用 Agilent 7890B氣相色譜系統聯用配備EI源的 Agilent 5977A質譜系統，建立了同時測定大鼠口服姜黃精油后血漿中7種主要活性成分的定量方法，與Ji等[46]采用的HPLC-MS/MS方法相比，目標化合物的檢測靈敏度提高了7～21倍。CI通過反應氣試劑電離產生活性反應離子，與樣品發生離子-分子反應實現樣品分子的電離，常用的反應氣試劑有甲烷、異丁烷、氨氣等。對于EI源下不穩定的化合物，CI源能夠獲得豐度較高的分子離子峰信息。例如，合成代謝類固醇是一類在結構及活性上與人體雄性激素睪酮相似的化學合成衍生物，EI源產生的分子離子峰豐度低，難以獲得化合物的分子質量信息。Polet等[47]以氨氣作為反應氣，采用GC-CI-MS技術測得3種不同結構類型的合成代謝類固醇分子離子峰，并結合碰撞誘導解離(collision-induced dissociation,CID)獲得這些化合物的特征碎片離子，總結不同類型合成代謝類固醇質譜的特征碎片與結構之間的關系。但由于CI譜圖的重現性不如EI，而且沒有標準譜庫，尚未見將其應用于中藥藥代動力學研究的報道。

常壓離子化技術以解吸電噴霧電離(desorption electrospray ionization,DESI)和實時直接分析(direct analysis in real time,DART)為代表，具有樣品前處理過程簡單，可以進行實時和原位分析的特點。Wei等[48]建立了LC-MS/MS法結合DESI技術監測人參皂苷Rg1在大鼠肝、腎、肺、腦等多個組織中的分布情況，通過DESI成像將人參皂苷Rg1在不同組織中的空間分布可視化，直觀地表征了Rg1在大鼠體內的代謝輪廓。Li等[49]應用DART技術識別和鑒定烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿在大鼠腸內菌中的36種代謝產物，整個分析過程無需樣品前處理，單個樣品的分析時間少于10 s。與傳統的離子化方式相比，常壓離子源具有一定的優勢，但其在靈敏度和重現性等方面還存在不足，限制了在中藥藥代動力學的應用。

質譜成像技術(mass spectrometry imaging,MSI)是將質譜的離子掃描過程與專業圖像處理軟件結合，對樣本表面的化學組成、相對豐度和空間分布進行全面、快速分析，可以原位反映內源性物質及外源性物質的種類、濃度和空間分布信息，便于藥代動力學的深入開展，質譜成像示意圖示于圖2。Tan等[50]采用MSI技術研究紫杉醇在豬腹膜組織上的濃度和空間分布，為紫杉醇在靶向治療腹膜癌癥方面提供有效信息。光學顯微鏡與質譜儀的聯用不僅可以獲得組織切片圖像，還可以獲得藥物與代謝產物的空間分布信息，并且能夠區分兩者，獲得分子結構信息[51]。Wang等[52]采用基質輔助激光解吸電離質譜成像技術(MALDI-MSI)獲得小鼠腎組織切片中燈盞乙素及其代謝產物的原位空間分布圖，發現燈盞乙素及其脫糖苷化代謝產物(野黃芩素)分布在腎臟皮質和髓質區域，豐度相對較高，而其余代謝產物則分布在腎臟皮質中，豐度較低。雖然質譜成像技術有諸多優勢，但其在中藥藥代動力學的應用仍存在許多限制，如背景基質干擾、很難準確定量和圖片分辨率低等問題。

圖2 MALDI質譜成像示意圖Fig.2 Schematic diagram of MALDI mass spectrometry imaging

2.2.2質量分析器及質譜聯用技術 通常按照質量分析器的不同對質譜儀進行劃分，包括四極桿(quadruple,Q)、離子阱(ion trap,IT)、飛行時間質譜(time of filght,TOF)、傅里葉變換-離子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance,FT-ICR)、軌道阱(Orbitrap)以及將不同類型的質量分析器串聯起來的復合式串聯質譜。在中藥藥代動力學研究領域，具有多反應監測功能的三重四極桿質譜(QqQ)是中藥定性鑒定和定量測定不可缺少的工具[53-55]，而離子阱質譜的多級串聯功能和四極桿-飛行時間質譜(Q-TOF)的高分辨及串聯功能可為中藥代謝物的結構表征提供重要信息[56]。此外，離子回旋共振及軌道阱質譜得到的精確質量數將提供準確的元素組成信息，可以進一步確證中藥未知代謝物的結構。

Fu等[57]建立了液質聯用分析方法研究急性痛風性關節炎模型大鼠單獨和同時灌胃給予白術和黃柏提取物后的血漿藥代動力學特征，詮釋了中藥二妙丸中白術和黃柏治療急性痛風性關節炎的協同作用機制。此外，質譜還可以與其他分析技術聯用，如紫外光譜、核磁共振、圓二色譜等，其中液相色譜-核磁共振-質譜(LC-NMR-MS)聯用技術由于能夠提供更豐富的結構信息，被越來越多地應用于中藥微量代謝產物的結構鑒定。Su等[58]首先采用LC-MS/MS技術初步識別和鑒定大鼠膽汁中異巴伐查酮的15種代謝產物，再通過LC-NMR-MS技術確定代謝產物的取代基位置。但由于核磁共振對13C的靈敏度很低，目前只能做1H核磁共振，這樣會導致化合物結構信息的缺損；另外，采用溶劑信號抑制技術會丟失與溶劑峰有重疊的目標化合物的部分結構信息。

3 結語與展望

分析技術的進步有力地推動了中藥多成分的藥代動力學研究，為中藥物質基礎和機制研究拓展了可行手段，但依然需要突破一些關鍵的瓶頸。例如，如何建立中藥體內多成分藥代動力學數據與中藥藥效的關聯分析策略，識別中藥藥效物質；如何以藥代動力學數據為指導開展后續的中藥藥效成分驗證實驗，以及更深入的中藥藥效成分作用機制研究。前處理技術和分析技術的不斷創新發展對中藥藥代動力學的深入研究不可或缺，未來將為中藥多成分藥代動力學研究提供更多的技術支撐，為更全面、更清晰地闡明中藥物質基礎和藥效機制奠定基礎。