一種新型冠狀病毒抗原檢測試劑性能分析和臨床評價

【作 者】 姜曉路，杜明秋，羊蘭翠 ，范晨霞 ，鄭明

1 浙江省醫療器械檢驗研究院，杭州市，310018

2 杭州協合醫療用品有限公司，杭州市，310018

0 引言

2019年末，由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome corona virus 2,SARS-CoV-2）導致引發的新型冠狀病毒感染（corona virus disease 2019,COVID-19）疫情席卷全球，根據世界衛生組織（World Health Organization,WHO）報道，截至2022年8月3日，全球已有575887049確診病例，其中6398412例死亡[1]。SARS-CoV-2是一種單鏈正義、有包膜、顆粒呈圓形或橢圓形、直徑為60～140 nm的線性RNA病毒[2]。測序顯示其全基因組長度約為30 kb（GenBank,MN908947.3），能編碼4種結構蛋白，包括刺突蛋白S、包膜蛋白E、基質蛋白M和核衣殼蛋白N[3-4]。N-蛋白在冠狀病毒中含量豐富，是一種高度免疫原性蛋白，參與基因組復制和細胞信號通路調節，具有高特異性等特點。作為SARS-CoV-2的核心蛋白，N-蛋白對新冠病毒的診斷和排查具有重要價值，也是其最重要的標志[5-6]。

目前商業使用的COVID-19診斷方法主要分為兩大類：一類為基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）的分子診斷技術；另一類是檢測患者感染新冠病毒后體內產生的抗原或抗體的免疫診斷技術[7]。分子診斷技術是新冠病毒檢測的 金標準”，具有早期診斷、靈敏度高和特異性強等特點，但其操作復雜、檢測時間長，需要專業人士進行。免疫層析技術由于操作簡單、檢測時間短等優點而廣泛應用。目前已有多種不同形式的免疫層析試紙被用于不同新冠感染相關標志物的檢測，包括抗體、蛋白等，并有一些免疫層析試紙已經獲批上市[8-11]。

雖然COVID-19 IgM抗體可反映近期感染，但病毒感染后COVID-19 IgM抗體的產生有滯后性（一般認為須在感染后7 d產生）[12]。新冠抗原檢測兼具方便、快速和低價這3項優勢，而相較抗體檢測，抗原檢測可對剛出現感染癥狀的患者及時檢測，可對疑似人群早期分流和快速管理，同時也可以滿足大規模人群篩查和欠發達地區應用的需求[13]。本研究對基于膠體金免疫層析法研制的新冠檢測試劑盒進行系統性的驗證，以評估試劑盒在快速診斷COVID-19的價值，以便能提供準確的檢測結果，為及時防控疫情提供依據。

1 材料和方法

1.1 研究設計與樣本采集

根據《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》[14]，該研究感染后出現癥狀的時間分布于多個時期（0～3 d（40%）、4～7 d（40%）、>7 d（20%）），共采集陽性樣本209份，在病毒核酸RT-PCR檢測中的Ct值分布為10≤Ct＜20有61例，20≤Ct＜25有40例，25≤Ct＜30有56例，30≤Ct＜38有52例；另采集健康對照人群的401份陰性樣本。

1.2 主要材料和試劑

評估試劑新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗原檢測試劑盒（膠體金法）為杭州協合醫療用品有限公司自制；對照試劑新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）購于華大生物科技（武漢）有限公司和深圳華大基因股份有限公司；復核試劑新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗原檢測試劑盒（膠體金法）購于南京諾唯贊醫療科技有限公司；新冠滅活病毒培養物外購于常州歐吉生物科技有限公司，初始濃度為7.8h 107TCID50/mL（TCID50即50%組織培養感染劑量，median tissue culture infective dose）。

1.3 抗原檢測試劑的制備

分別將雞IgY、新冠抗體N-M1205與膠體金顆粒偶聯在一起，用金標稀釋液稀釋膠體金-新冠抗體N-M1205和膠體金-雞IgY，體積占比分別為50%和25%，用噴金機按2.0 μL/cm將溶液點在載體上，45 ℃烘干；將NC膜粘在PVC底板上，用劃膜稀釋液將新冠抗體N-M1204和羊抗雞IgY分別配制成一定濃度的溶液，后用劃膜儀將溶液均勻地噴在粘好的硝酸纖維素膜（NC膜）上，45 ℃烘干12～24 h；用樣品墊處理液涂布處理玻璃纖維，37 ℃烘干12～24 h；將制備好的片材、金標墊、樣品墊及吸水濾紙組裝，用切條機切割成相應的寬度，裝入檢測卡，鋁箔袋密封包裝。

測試時將鼻拭子樣本或鼻咽拭子插入裝有抗原提取緩沖液的抗原提取管中，拭子頭應在抗原提取緩沖液中旋轉并混勻至少30 s，同時用手隔著管外壁擠壓拭子頭，將拭子頭液體擠干，取出棄去拭子，加入3滴樣本提取物至加樣孔中，結果應在15～20 min。具體操作，如圖1所示。

圖1 抗原檢測試劑操作示意Fig.1 Procedure for COVID-19 antigen test kit assay

1.4 檢測試劑分析性能評估

根據LI等[15]和TAKEUCHI等[16]的研究，對檢測試劑的分析靈敏度、分析特異性、精密度和鉤狀效應進行評估。

1.4.1 分析靈敏度（最低檢測限）評價

將滴度為7.8h 107TCID50/mL的滅活病毒培養液依次稀釋2萬倍（3.90h 103TCID50/mL），4萬倍（1.95h 103TCID50/mL）、8萬倍（9.75h 102TCID50/mL）、16萬倍（4.875h 102TCID50/mL）和32萬倍（2.438h 102TCID50/mL）進行最低檢出限檢測，每種稀釋度重復檢測20次。

1.4.2 精密度評價

使用企業質控品測定3批產品，每個濃度質控品重復檢測5次，連續檢測5 d，共得到25個結果，計算25次檢測結果的陰/陽性檢出率。

企業質控品組成：企業陽性質控品（將一級企業標準品（COVID-19重組抗原）原液稀釋為100萬倍、20萬倍、1000倍，作為企業陽性質控品P1～P3）；企業檢測限質控品L1～L3（將一級企業標準品原液稀釋為2000萬倍、200萬倍、100萬倍）；企業重復性質控品（一級企業標準品原液稀釋100萬倍，作為企業重復性質控品J）。

1.4.3 分析特異性評價

將不同干擾物質用健康人鼻咽拭子洗脫液為陰性基質稀釋相應質控品，得到3種不同干擾樣本：①陰性質控加入不同干擾物質；②陽性質控P3加入不同干擾物質；③檢測限質控L3加入不同的干擾物質，檢測干擾物質對檢測結果是否有影響。

對臨床上能引起相同或相似癥狀的常見交叉反應病原微生物，在其醫學相關水平進行交叉反應驗證，通過在COVID-19滅活病毒培養液（9.75h 102TCID50/mL）中加入病原微生物制成陽性干擾，陰性樣本加入病原微生物制成陰性干擾，對常見呼吸道病原體高濃度毒株進行測試，確認常見的病原微生物是否存在交叉反應。

1.4.4 鉤狀效應評價

將原始滴度為7.8h 107TCID50/mL的滅活病毒培養液，依次稀釋400倍、4000倍、20萬倍、200萬倍，根據檢測結果判斷是否存在鉤狀效應。

1.4.5 穩定性評價

將試劑打開，取出其中的抗原提取緩沖液，打開蓋子放置于室溫下，用該緩沖液將P3配制成L1～L3濃度的標準品，分別放置0 h、24 h、48 h和72 h后檢測。在每個時間點，使用3批產品進行檢測，將每個結果與0 h進行比較。

1.5 臨床性能評價

用iPonatic快速核酸檢測系統及杭州協合醫療用品有限公司制備的抗原檢測試劑盒同時取鼻咽拭子樣本進行臨床比對測試；按說明書用檢驗試劑檢驗標本，將檢驗結果記錄在表中。將結果與RT-PCR檢測比較，分析試劑臨床檢測的性能，包括靈敏度（包括不同Ct值的陽性樣本的靈敏度）、特異性以及與RT-PCR的總符合率。

采用SPSS V23.0和Excel 2010對試劑盒的臨床檢測性能進行分析，計算Kappa (K)值，K≥0.75，具有高度的一致性；0.40

2 結果

2.1 檢測試劑的分析性能評估結果

2.1.1 分析靈敏度（最低檢測限）

熱滅活的病毒培養液稀釋到滴度為9.75h 102T C I D50/m L 時，所有檢測結果均為陽性；再稀釋至4.875h 102TCID50/mL時，僅有7次陽性結果，計算出陽性檢出率為35%，病毒培養液稀釋至滴度為2.438h 102TCID50/mL時，所有結果均為陰性（見表1）。根據檢測結果判定試劑最低檢測限為9.75h 102TCID50/mL。

表1 分析靈敏度測試結果Tab.1 Results of analysis sensitivity test

2.1.2 精密度

表2顯示L1濃度時有部分檢測結果為陰性，數量不大于測試總數的1/3，其余為陽性；檢出限參考品L2～L3、重復性質控品J和陽性參考品P1～P3的陽性檢出率均為100%，且條帶結果顯色均一，表明抗原檢測試劑的精密度良好。

表2 精密度測試結果Tab.2 Results of precision test

2.1.3 藥物和血液中若干物質的干擾試驗結果

根據檢測結果，2 mg/mL的血紅蛋白和黏蛋白、5 mg/L人抗鼠抗體（HAMA）、10 mg/mL生物素、500 μg/mL黏液、120 μg/mL色甘酸鈉、60 μg/mL鹽酸羥甲唑啉、200 μg/mL的鹽酸去氧腎上腺素和N-乙酰對氨基苯酚、3 μg/mL的慶大霉素、阿司匹林、布洛芬、嗎啉鹽酸鹽、頭孢氨芐、卡那霉素、四環素、氯霉素、紅霉素、萬古霉素、萘啶酸、氫化可的松、人胰島素，以及30 μg/mL的β-丙內酯均不會影響本品的檢測結果。

2.1.4 呼吸道疾病病原體干擾試驗結果（分析特異性）

COVID-19是一種由冠狀病毒引起的呼吸道疾病，它的癥狀類似其他類型的呼吸道疾病和流感。為了確認產品特異性，使用29種常見交叉反應病原微生物進行檢測。結果顯示對下述的病原微生物無交叉反應（見表3），證明試劑特異性較好。

表3 常見病原微生物的干擾Tab.3 Interference from common pathogenic microorganisms

2.1.5 試劑穩定性

表4顯示，抗原提取緩沖液室溫放置24 h、48 h和72 h后三個濃度的參考品檢測結果均為陽性，與0 h相比無明顯差異。

表4 試劑穩定性驗證結果Tab.4 Results of reagent stability verification

2.1.6 鉤狀效應

當病毒培養液滴度達到7.8h 107TCID50/mL時，未觀察到高劑量鉤狀效應。相比初始濃度，原液稀釋20萬倍后條帶顏色變弱；直至原液濃度稀釋200萬倍，試紙條帶十分微弱，甚至無明顯條帶顯現。高劑量鉤狀效應驗證如圖2所示。

圖2 高劑量鉤狀效應驗證Fig.2 High-dose hook effect validation

2.2 臨床檢測性能評價

2.2.1 試劑盒的臨床檢測靈敏度、特異性及與RT-PCR結果的總符合率

本研究試劑盒臨床檢測的靈敏度和特異性樣本總數為610個，其中209個為陽性，401個為陰性。與RT-PCR檢測結果相比，本抗原檢測有3例漏檢樣本和4例假陽性測試結果，臨床統計結果如表5所示，該產品的靈敏度為98.56%（置信區間為95.87%～99.51%），特異性為99.00 %（置信區間為97.46%～99.61%），與RT-PCR結果的總符合率為98.85%（置信區間為97.65%～99.44%）。K值為0.9745，大于0.75，試驗結果顯示，本產品與新型冠狀病毒核酸檢測結果具有良好的一致性?；谀z體金法建立的新冠抗原檢測試劑盒與核酸檢測結果基本一致，臨床評價良好，達到了預期的研究目的。

表5 臨床檢測性能評價Tab.5 Results of clinical performance evaluation

2.2.2 不同Ct值陽性標本的檢測靈敏度

對不同C t 值陽性樣本進行分層分析，顯示10≤Ct＜20有61例，占全部陽性樣本的29.19%，試劑檢測結果均為陽性，檢測靈敏度為100.00%；20≤Ct＜25有40例，占總陽性樣本的19.14%，其中1例結果為陰性，檢測靈敏度為97.50%；25≤Ct＜30有56例，占總陽性樣本的26.79%，其中2例結果為陰性，檢測靈敏度為96.43%；30≤Ct＜38有52例，占總陽性樣本的24.88%，結果均為陽性，檢測靈敏度為100%，結果表明該抗原檢測試劑性能優越（見表6）。對抗原檢測結果與核酸檢測結果不一致的病例，用已上市的抗原試劑進行復核，結果與本公司試劑的檢測結果一致。

表6 不同Ct值陽性標本的檢測靈敏度Tab.6 Results of detection sensitivity of positive specimens with different Ct values

3 討論

免疫層析法能夠快速檢測人體是否含有抗原或抗體，是現有核酸檢測法良好的補充手段，該方法對臨床實驗室的操作要求更低，在基層實驗室即可完成，而且對檢驗人員的要求也沒有核酸檢測那么高，簡單培訓即可操作[17-18]。由于低病毒載量可能導致假陰性，因此抗原檢測試劑的分析性能評估是十分重要的步驟，試劑的精確度、靈敏度和特異性是基礎[19]。本研究的目的是評估生產的抗原檢測試劑盒診斷SARS-CoV-2感染（包括變異株）的分析敏感性和特異性。數據顯示該抗原檢測試劑的檢測結果與PCR檢測結果基本一致，臨床評價良好。

分析特異性是指試劑盒對樣品中的非特異性物質產生假陽性反應的可能性，有時也指與應該反應的物質不發生反應的可能性，即假陰性。同時，要識別可能引起類似臨床癥狀的其他病毒的交叉干擾[20-21]。試驗結果證明研究建立的抗原檢測試劑性能良好，與29種常見呼吸道病原微生物均無交叉反應，分析敏感性和特異性表現優異。經驗證，本抗原檢測試劑提取液在開封三天內使用無差異，但考慮到使用時所處環境可能更加惡劣，特別是在室溫高于30 ℃或高度潮濕的環境中，應盡快使用?？傮w來看，新型冠狀病毒（2019-nCoV）檢測試劑盒（膠體金法）與核酸檢測結果一致性較高，按照Ct值分層，靈敏度相對較高；有一部分核酸檢測結果為陽性，而抗原檢測結果為陰性，分析其可能原因是用抗原檢測試劑檢測時，在檢出限范圍內檢測結果呈陰性，是因為核酸比蛋白降解快，或者是核酸轉錄到一半時細胞破裂，此時蛋白組裝未完成，其含量未達到檢測試劑的檢出限要求，因此核酸檢測試劑能檢測到，而抗原檢測試劑無法準確檢測。我們同時用已上市的抗原檢測試劑檢測樣本，復檢結果仍為陽性，也能說明其原因。

根據評估其檢測結果具有指導意義[22]，總體上能滿足臨床需求?？乖瓩z測的主要優點是快速、易于解釋、可居家自行操作。但本試劑也存在一些缺陷，只能進行定性檢測且結果存在一定誤差，有待今后進一步完善。

4 結論

通過分析性能評估，本試劑的最低檢出限為9.75h 102TCID50/mL；測試29種常見呼吸道病原體均無交叉反應。臨床鼻咽拭子樣本及健康人群鼻拭子樣本測試，分析靈敏度為98.56%（置信區間95.87%～99.51%），分析特異性為99.00%（置信區間97.46%～99.61%），準確度為98.85%（置信區間97.65%～99.44%）；一致性檢驗K值為0.9745。對不同Ct值陽性樣本進行分層分析，各個層級內檢測靈敏度優良。結果表明COVID-19抗原檢測試劑檢測靈敏度和特異性高，檢測速度快，操作便攜，可作為現有核酸檢測法的補充手段，用于新型冠狀病毒感染的早期篩查。