尖銳濕疣動物模型及三維細胞培養模型研究進展

雷雙旖,曾 抗

(南方醫科大學南方醫院皮膚科,廣州,510515)

0 引言

尖銳濕疣( Condyloma acuminatum,CA) ,是由人乳頭瘤病毒( human papillomavirus,HPV) 感染引起的以皮膚黏膜疣狀增生性病變為主的疾病。自1954年以來,CA就被認為是一種獨立的性傳播疾病[1]。除此之外它也是一種已知病毒病因的良性腫瘤,并且具有一定惡變的潛力[2]?；颊咂p最初體現為局部細小丘疹,隨著時間進展逐漸增大或增多,發展為乳頭狀、菜花狀、雞冠狀或團塊狀贅生物。一般無自覺癥狀,少數患者可因皮損位置原因出現瘙癢、異物感、壓迫感等。皮疹部位可因贅生物脆性增加、摩擦而出現破潰、糜爛、繼發感染等癥狀[3],影響患者的身心健康及生活質量。乳頭瘤病毒(Papillomaviruses,PV)是在分化的皮膚細胞中繁殖的無包膜雙鏈DNA病毒,呈高度多樣化,可在其天然宿主的特定部位中引起良性腫瘤(疣、乳頭狀瘤),某些特定類型的PV誘導的乳頭狀瘤增生具有惡性進展的高風險[4]。由于種屬特異性,人體是HPV唯一的自然宿主。目前普遍認為HPV感染僅限于粘膜皮膚復層上皮,病毒生命周期依賴于上皮細胞復制和分化,細胞周期的延續主要由PV E6和E7蛋白驅動,病毒顆粒在上皮細胞從上皮表面脫落并降解后釋放[5]。所描述的400多種乳頭瘤病毒中,218種與人類感染有關,其中約40多型與生殖器、肛周部位的感染有關。臨床上根據HPV潛在的致癌性,將其分為低危型和高危型[6]。尖銳濕疣病變中大概率含有多種HPV類型,其中低危型HPV類型HPV6和HPV11在尖銳濕疣的發病機制中占主導地位,也可合并HPV16、HPV18等高危型HPV類型。Hawkins等[7]發現免疫抑制患者感染高危型HPV概率較健康人高,特別常見高危型的高風險HPV類型包括HPV16、HPV55和HPV59型。由于HPV體外難以通過傳統細胞培養方式分離出大量病毒顆粒,又因其自然宿主局限于人,缺乏適宜的動物模型,這使人們對HPV的研究難以全面展開。近年來,隨著HPV感染引起的性傳播疾病和腫瘤的發病率逐年上升,HPV疫苗和HPV感染動物模型的研究與開發也受到越來越多的關注。人類在研究中使用動物模型已經持續了數千年,動物實驗對藥物的開發和理解人類疾病過程做出了重大貢獻,但有時因不同的動物種屬誘導疾病的模型與人類不相似、代謝途徑和藥物代謝物途徑有差異、人類和被測試動物物種之間存在內在差異等原因使動物研究中得出的結論不能簡單地轉移到人類研究中[8]。隨著分子生物學技術、基礎細胞科學和組織工程的發展,三維細胞培養模型技術逐步完善,通過更準確地模擬體內微環境,彌補了傳統二維單層培養和動物模型之間的差距[9]。

1 HPV相關疾病動物模型

1.1 哺乳動物PV感染動物模型

已建立的幾種天然存在的動物乳頭瘤病毒模型,例如,棉尾兔乳頭瘤病毒(cottontail rabbit papillomavirus,CRPV)感染家兔模型、兔口腔乳頭瘤病毒(rabbit oral papillomavirus,ROPV)感染家兔模型、犬口腔乳頭瘤病毒(canine oral papillomavirus,COPV)感染犬模型和牛乳頭瘤病毒(bovine papillomavirus,BPV)感染牛模型以及小鼠乳頭瘤病毒( mouse papillomavirus type 1,MmuPV1)感染小鼠模型,CRPV是第一個鑒定的乳頭瘤病毒,早期的PV相關疾病模型主要集中在CRPV和BPV1。1933年,Shope 等[10]在野生棉尾兔中觀察到一種乳頭狀瘤,并發現其可傳染給野生兔和家兔。1964年,Cheville[11]通過劃痕接種牛疣組織導致牛接種部位上皮增生,通過皮下接種導致成纖維細胞增殖。Baker等[12]通過冷凍電子顯微鏡發現CRPV、BPV 1和HPV 1的玻璃質冰中的病毒顆粒具有基本相同的結構,進一步證實了CRPV和BPV1模型對HPV發病機制的適用性。CRPV與高危HPV的廣泛遺傳和功能同源性使該模型系統成為測試新型抗病毒和抗腫瘤治療的金標準,在開發HPV疫苗、抗病毒藥和抗腫瘤藥方面發揮了關鍵作用[13]。由于牛和人類具有多種相似的免疫生理學特征,包括子宮內免疫系統的發育,這使得牛成為模擬人類免疫學的優秀模型。BPV也有多種亞型,體外研究的牛病毒的生命周期、基因組結構、病毒蛋白和病理生理學為了解人類病毒鋪平了道路[14]。然而,CRPV僅感染皮膚部位,因此不是模擬肛門生殖器感染和疾病的理想模型[15]。在家兔感染模型中,CRPV產生的乳頭狀瘤不能適當支持完整的生產生命周期,并且產生很少或不產生感染性病毒顆粒[16]。與HPV不同,BPV E6和E7蛋白在生產性感染期間破壞細胞周期的作用較小,并且在更廣泛的組織中復制[17]。除此之外,由于體積較大,生物學、遺傳學與人類差別過大,以及病毒來源、實驗試劑局限等原因,限制了這些感染模型的應用。與CRPV一樣,COPV模型也進行了大量的疫苗開發工作,但由于飼養成本較高,且COPV不能感染生殖器組織,近年來該模型漸漸被ROPV模型所取代[18]。

2011年,在印度癌癥治療研究和教育高級中心的一群NMRI-Foxn 1(nu)/Foxn 1(nu)(裸)小鼠口鼻部黏膜交界處自發出現乳頭狀瘤,研究院分離得到MmuPV1,該病毒表現出嗜皮膚性,可感染免疫功能正常的小鼠背部皮膚[19]。之后Cladel等[20-21]發現MmuPV1在Foxn 1 nu/Foxn 1 nu小鼠陰道、宮頸、肛門、尿道、尾部、口鼻部、面部、內頰都易發生感染,并且可能具有惡性潛能。Spurgeon[22]實驗證明了MmuPV1可通過性傳播。至此MmuPV1感染小鼠模型被認為是研究肛門生殖器乳頭狀瘤病毒疾病的一種極具發展潛力的小動物模型。Wang等[23]發現MmuPV1感染小鼠的能力受到宿主免疫系統的強烈控制,MmuPV1可誘導用CD 3抗體去除T細胞的BALB/c或C57 BL/6小鼠產生乳頭狀瘤,并且瘤體可在免疫恢復的8周內完全消退,而單獨CD 4+或CD 8 + T細胞耗竭均不足以產生可見的乳頭狀瘤。2020年Wei等[24]成功建立了第1個MmuPV1誘導頭頸部鱗癌的體內感染模型。2021年Sauer等[25]通過MmuPV1感染有效地誘導NSG小鼠肛門高級別鱗狀上皮內病變,并且實驗表明在用UVB照射的免疫功能正常的FVB/NJ小鼠肛門,MmuPV1感染能持續長達6個月,提出了一種由自然感染驅動的肛門疾病和癌癥的新模型?？偠灾?雖然MmuPV1感染模型在概括人類感染和疾病的各個方面的能力存在固有的局限性[26],其仍具有令人難以置信的前景,MmuPV1的發現提供了一種實用且遺傳學上易于處理的實驗室動物物種背景下模擬HPV感染、傳播和發病機制的動物模型。非人靈長類動物因其與人類的進化較為接近,也是研究HPV發病機制的有利模型,但在實驗成本、技術、試劑等方面仍存在挑戰。

1.2 HPV相關異種移植物模型

異種移植,即將一個物種的細胞組織移植到另一個物種體內?；颊邅碓吹漠惙N移植物(Patient-derived xenografts,PDX),即將新鮮人腫瘤組織的細胞或完整片段移植到免疫系統中具有防止移植排斥的遺傳缺陷的實驗室動物(通常是小鼠),有助于體內抗腫瘤研究和篩選臨床新型藥物。1987年,Kreider等[27]將感染了HPV11的新生兒包皮的碎片移植到無胸腺小鼠的腎包膜下,建立了第1個HPV相關的異種移植模型。后續也有研究者利用相似方式構建出HPV40、HPVLVX 82/MM 7、HPV16的裸鼠/免疫缺陷小鼠腎包膜下/表皮下異種移植物模型[28-29]。1989年,Stanle等[30]嘗試將含有高拷貝數HPV16 DNA的宮頸角質形成細胞系W12移植到無胸腺裸鼠上皮。次年Sterling等[31]同樣將W12細胞系移植到裸鼠上,并成功誘導其形成復層分化上皮;長期移植顯示出低度宮頸發育不良的組織學特征,終末分化細胞含有擴增水平的HPV-16 DNA、病毒衣殼抗原和病毒顆粒。Duan等[32]改良了Kreider的異種移植模型,以網狀移植物模式接種,提高了模型低風險HPV的繁殖率和可重復性。2012年Kimple等[33]描述了一組HPV陽性和HPV陰性人頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)腫瘤移植物模型,移植瘤具有典型的臨床組織病理學標本的分化譜,并且在原始患者腫瘤和移植瘤之間具有高度的一致性。2018年,Larmour等[34]首次證明了新鮮宮頸癌、宮頸不典型增生和正常宮頸組織可以在高度免疫功能低下小鼠的腎包膜下生長,其中來自宮頸癌異種移植物的腫瘤在小鼠體內至少傳代3次,重現了親本腫瘤的結構和p16和HPV的免疫組化特征。

與癌細胞系或細胞系異種移植物相比,通過異種移植涉及人體組織的模型更適用于人類疾病。PDX模型在分子特征和治療反應方面可能更接近其人類原始腫瘤,并且可能保留人類癌癥典型的腫瘤間和腫瘤內異質性。盡管如此,仍需要確認已建立的PDX模型成功植入率,以及是否保留了原始人類腫瘤的特征,是否適用于進一步的研究[35]。但最近Kruse等[36]和Zottnick等[37]構建了一種新型MHC人源化小鼠原位HPV腫瘤模型。與現有的HPV 腫瘤模型相比,它適用于在排除鼠MHC呈遞的表位的干擾下,研究HLA-A2和DR 1介導的免疫應答。A2.DR1小鼠經工程改造以缺乏所有鼠MHC分子,具有人MHC分子的排他性表達,因此可直接用于體內治療性疫苗接種。Kruse等[36]通過用HPV 16 E6和E7轉導A2.DR1肉瘤細胞系2277 NS產生E6+/E7+細胞系PAP-A2,并注射到A2.DR1小鼠的側腹形成原位腫瘤。由于PAP-A2 luc細胞系中轉導的HPV16蛋白表達水平較低且細胞存活不依賴于這些蛋白。Zottnick等[37]建立了一種新的E6+/E7+依賴性細胞系,用HPV 16 E6和E7轉導A2.DR1衍生的肺細胞,用活化的癌蛋白H-ras G12 V轉染細胞以使其致瘤,用螢火蟲熒光素酶基因轉染細胞使其能夠被跟蹤,該細胞系被命名為E6/7-lucA 2。將細胞系滴注到已同步到相同間情狀態的小鼠陰道內。PAP-A2-luc細胞使3只小鼠中的2只形成陰道腫瘤,而E6/7-lucA 2細胞能夠在所有3只小鼠中形成陰道腫瘤。Tseng等[38]和Peng等[39-40]也用HLA-A2(AAD)人源化小鼠構建HPV16 E6/E7口腔癌、頭頸部鱗狀細胞癌和HPV18 E7 E6宮頸陰道腺鱗癌模型。AAD轉基因小鼠含有表達人HLA-A2的α1、α2結構域和源自小鼠的H-2Dd的α3跨膜胞質結構域的嵌合HLA I類分子,這種小鼠通常用于模擬人類T細胞HLA-A2呈遞抗原的免疫應答。以上的腫瘤模型都可以形成自發的、局部的HPV致癌基因誘導的腫瘤,能跟蹤從正常組織到侵襲性和/或轉移性狀態的進展,易于檢測,可能適用于不同的人源化轉基因小鼠,未來在測試各種疫苗和新型免疫療法方面具有巨大的潛力。

盡管異種移植物模型的概念和初步建立已經存在了幾十年,但隨著個體化治療方法改變癌癥治療,它們在腫瘤藥物開發中的價值才剛剛實現,在增加人們對疾病生物學的理解,開發新的治療方法和生物標志物方面,異種移植物模型仍是一個有吸引力的臨床前替代癌癥治療模型。

1.3 HPV轉基因動物模型

轉基因技術是將期望的目標基因,經過人工分離、重組后,導入并整合到生物體的基因組中,從而改變生物原有的性狀或賦予其新的性狀。將基因導入哺乳動物的生殖系是生物學上重大技術進步之一。轉基因動物在發育和發育基因調控機制、癌基因的作用以及免疫系統內復雜的細胞相互作用方面發揮了重要作用[41]。構建轉基因動物模型克服了HPV的種屬特異性這一缺點,通過組織特異性的外源啟動子,使HPV癌蛋白定向表達在特定的組織細胞中。按 HPV 基因功能可分為早期區(E區)、晚期區(L區)和上游調控區(URR)3個區域(以HPV16為例):E區包括 E1～E7開放閱讀框架,主要編碼與病毒復制、轉錄、調控和細胞轉化有關的蛋白;L 區分為 L1和L2的2個開放閱讀框架,分別編碼主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白;URR位于E區與L區間,負責復制和轉錄的調控,與 HPV 在人皮膚粘膜上皮的定向表達有關[42]。HPV16和HPV18是最常見的2種高危HPV,約占所有HPV相關宮頸癌和頭頸癌的70%。占高風險HPV表達2種有效的癌蛋白E6和E7,分別介導細胞p53和pRb的降解,這2種腫瘤抑制蛋白對細胞周期控制和基因組穩定性至關重要,導致HPV誘導的癌變[43]。最初研究員們運用BPV-1研究乳頭瘤病毒的轉基因模型,發現BPV-1基因組通過小鼠生殖系傳播導致皮膚纖維乳頭瘤形成,并為HPV相關轉基因小鼠的構建提供了理論基礎[44]。人乳頭瘤病毒的上游調控區(URR)又稱長控制區(LCR)含有轉錄啟動子和增強子元件,這些元件決定了病毒的細胞類型特異性。Yang等[45]將HPV 16基因組串聯的頭尾二聚體的形式與內源性HPV 16URR以顯微注射到CD-1小鼠中。在沒有其他干預的情況下,中年轉基因鼠出現了多器官自發性惡性腫瘤,腫瘤發生在皮下、胸腔或腹部,一半小鼠出現肺、肝、腎、腦、淋巴結和脾中轉移。腫瘤可在裸鼠體內移植并迅速生長。宮頸是女性HPV 16感染的主要部位,然而沒有觀察到宮頸的病變,Yang等考慮可能是由于E2區缺失/截短,或者動物沒有存活足夠長的時間來顯示腫瘤。利用HPV調節區來驅動HPV癌蛋白的表達的研究并不順利,腫瘤往往是非上皮來源的,且出現在非理想的靶器官中。于是研究者們嘗試用異源啟動子驅動癌蛋白的表達。

角蛋白K5和K14的表達通常局限于表皮基底層,表皮異常增生與這些標記物的超基礎表達相關。表皮發育不良的增加與DNA合成增加,與角蛋白K5和K14出現在顆粒層,K10和微絲蛋白表達減少有關。角質形成細胞終末分化的標志物K10和微絲蛋白的表達降低,與上皮細胞分化的喪失一致[46]。人角蛋白14啟動子(HK14)定位于各種復層表面上皮細胞的基底層表達,并驅動高水平的表達。1994年Arbeit等[47]為了模擬人乳頭瘤病毒誘導的腫瘤進展,使用人角蛋白14(hK14)增強子/啟動子將人乳頭瘤病毒16型(HPV 16)的早期區域的表達靶向于轉基因小鼠中鱗狀上皮的基底細胞,建立了K14-HPV16進展型鱗狀上皮腫瘤轉基因鼠。小鼠耳、軀干皮膚、面部、口鼻部、眼瞼以及肛門表皮和黏膜出現增生、乳頭狀瘤病和發育不良癥狀。K14控制的HPV癌蛋白轉基因小鼠模型也已用于研究其他HPV類型蛋白的致癌潛力。在沒有任何物理或化學致癌物治療的情況下,HPV8轉基因小鼠發生了非黑色素瘤皮膚癌[48]。Marcuzzi等[49]也發現,帶有HPV 8的全部早期區域(CER)的轉基因小鼠自發地發生皮膚的乳頭狀瘤、發育不良和鱗狀細胞癌,另外幾乎所有的HPV8 E6陽性小鼠自發地發生多灶性腫瘤,與HPV 8 CER小鼠相當,證明E6是誘導自發腫瘤發展至鱗狀細胞癌水平所必需且足夠的主要癌基因。當在小鼠子宮頸中給予雌激素時,K14 E7小鼠可發生宮頸癌,證明了E7癌蛋白與雌激素在小鼠宮頸中的強效共致癌活性[50]。除了K14啟動子外,Borchers等[51]用人角蛋白10(hK10)作為啟動子構建K10-HPV16-E6/E7轉基因小鼠,并推斷E7轉基因表達在細胞毒性T淋巴細胞(CTL)水平上誘導特異性免疫耐受。Michel等[52]也用K10構建在基底層上表達HPV20和HPV27 E6和E7蛋白的轉基因SKH-hr 1無毛小鼠,并暴露于慢性UV照射,兩品系小鼠表皮層和乳頭狀瘤形成的增殖增強,并發展成鱗狀細胞癌。

以牛角蛋白6(bK6)基因為啟動子也可產生表達HPV 16早期區基因的轉基因小鼠,HPV 病毒的轉錄一般在基底上層被激活,且依賴細胞分化,bK6 E6/E7轉基因小鼠中,E6/E7轉錄物在皮膚、子宮頸、十二指腸、胃和舌中過表達[53-55]。Crish等[56]用人外皮蛋白(hINV)啟動子建立hINV-HPV16-E6/E7-SV 40轉基因小鼠,導致棘皮癥、角化不全和脫屑,小鼠的頰粘膜和舌上皮中也觀察到過度增殖。hINV是一種上皮組織基底上層早期分化的標記,與角蛋白相比,外皮蛋白的表達水平相對較低,普遍認為該啟動子比角蛋白啟動子的活性低[42]。國內高慧等[57]以pCEP4載體為骨架,人巨細胞病毒(CMV)啟動子啟動下游基因表達,構建pCEP4-CMV-HPV16 E6/7真核表達質粒,通過受精卵顯微注射法獲得了可繁殖傳代的整合了HPV16E6/7基因,可自行發生皮膚腫瘤的HPV轉基因小鼠模型。為了模擬成年人HPV感染,最近研究人員構建了2種誘導型轉基因模型,他莫昔芬[58]和多西環素[59]分別誘導表達K14-CreERTam和K5-rtTA啟動子系統,誘導后癌基因E6和E7均高表達,導致表皮快速增生。

高危型HPV與癌癥有關,且這些病毒編碼的E6/E7癌蛋白已被證明在滅活p53和Rb方面更有效。上述研究都與高風險HPV不同亞型的癌蛋白的靶向作用相關。相比高危型HPV,低危型HPV轉基因小鼠相關的研究較少。1992年Tinsley等[60]用角蛋白6(K6)基因的啟動子區來調節轉基因小鼠中HPV1早期區域的表達,HPV 1的存在與良性疣的形成有關,作者在小鼠爪、耳、背部皮膚和舌的上皮覆蓋物中檢測到HPV轉錄本。新生兒尾部皮膚變得堅硬,表面破裂成薄片,皮質層角化不全、角化過度,基底上層增生。爪和尾部的皮膚的上基底層中檢測到E1-E4蛋白,轉基因小鼠的角蛋白K6和K16水平升高,與其過度增殖狀態一致,其表現與人類病毒疣觀察到的相似。最終小鼠的皮膚在出生后3周內恢復正常,沒有觀察到良性或惡性乳頭狀瘤。Schenkel等[61]利用HPV11自身URR作為啟動子,并觀察到報告基因的毛發特異性轉錄。Michel等[52]構建K10-HPV27-E6/E7轉基因小鼠在慢性UV照射下發展成鱗狀細胞癌。

總的來說,低危型HPV癌蛋白的表達不產生穩定的表型改變,而高危型HPV癌蛋白的表達產生穩定和進行性疾病。不同的組織特異性啟動子在發育過程中的不同時間被激活,表達HPV癌蛋白,靶向組織方面HPV自身啟動子不如異源啟動子成功。在多種轉基因小鼠,小鼠呈現出相似或相矛盾的表型,有的還需要各種輔因子促進致癌進展。每種品系都有其自身的潛力和局限性。但轉基因動物模型允許選擇性地去除特定免疫途徑中的不同分子、其他細胞致癌基因和腫瘤抑制基因,通過減少或增加其抗腫瘤活性和/或其促腫瘤信號,有助于進一步研究HPV的致病機理和開發新的預防和治療措施。

2 HPV相關三維細胞培養模型

HPV在最初感染基底細胞后,HPV DNA擴增并建立為低拷貝數的染色體外基因組,HPV基因組與宿主基因組一起復制。作為細胞分化周期的一部分,受感染的細胞從基底膜脫離并進入基底上皮層。病毒E6和E7蛋白的表達促進非預定的細胞周期進展,支持連續的病毒復制。隨著細胞繼續分化,E1和E2蛋白的表達增加導致向生產性病毒DNA擴增過渡。最后,病毒衣殼蛋白L1和L2在上皮的終末分化層內合成,完成病毒體組裝。這意味著HPV的生命周期是分化依賴性的,需要重現三維復層上皮[62]。以下主要介紹3種三維細胞培養模型,器官型筏式培養模型、多細胞球體模型、類器官模型。

器官型筏式培養模型由Asselineau和Prunieras[63]開發,是公認能代表上皮組織的三維細胞培養模型,角質形成細胞被置于含或不含成纖維細胞的真皮等同物(例如去表皮皮膚、膠原蛋白或基質膠)的頂部,通過在空氣-液體界面中支架上培養來實現分化和分層。由于角質形成細胞培養物“漂浮”在空氣/液體界面處,故這種上皮細胞培養物通常被稱為“筏”培養物。該模型形成的復層和分化的上皮,為研究人員提供了研究嗜上皮病毒的有用手段,已應用在研究HPV-癌癥/其他病毒相互作用、HPV生命周期、HPV的傳播及感染、評估HPV治療的有效性等方面,在體內觀察到的HPV-宿主相互作用已被證明與該模型中的表現類似[9]。器官型筏式培養模型是迄今為止HPV研究中的一個重要里程碑。建立人原代上皮細胞的三維器官型培養模型步驟如下,第1步使用成纖維細胞(可使用永生化的人包皮成纖維細胞系或原代人成纖維細胞)和膠原蛋白建立真皮等同物;第2步將角質形成細胞的基底層接種到含有活性成纖維細胞的真皮等同物上;第3步將“筏”提升到空氣-液體界面,及將“筏”轉移到一個預濕的膜插入物上,該膜插入物位于6孔板中分化培養基的表面上。然后使組織分化1—3周,進行完全上皮分層。目前研究人員開發了來自肛門生殖道、口咽和皮膚上皮的人類HPV相關粘膜惡性腫瘤的體外三維器官型培養模型[64-65]。從健康或腫瘤相關角質形成細胞和成纖維細胞來源的組織建立的器官型培養模型在體外概括了其天然對應物的組成和結構組織(上皮分層、功能性基底膜、成纖維細胞聚集的基質、復合細胞外基質),能更好地闡明致癌過程中基質和上皮間室之間的相互作用,代表了用于研究腫瘤進展和評價非動物模型中的聯合療法的新模型[66]。

球狀體是研究腫瘤的有力的模型,因為它們概括了腫瘤細胞的細胞間信號傳導途徑和生長動力學,產生球體的基本概念是促進細胞相互作用,在附著表面或支架上聚集并經歷自組裝,在這個過程中,單一分散的細胞形成三維微組織,它具有與人類腫瘤組織接近的表型特征[67]。最常用的模型是多細胞腫瘤球體模型,1970年Sutherland等[68]就開始培養多細胞腫瘤球體。構建球狀體可以使用培養基和特殊方法避免細胞粘附在容器表面,比如轉瓶法,通過持續攪拌防止細胞附著在容器表面,促進細胞與細胞接觸,該方法相對簡單,能產生大量球狀體,但具有高剪切力并且細胞大小和數量不可控[69]。懸滴法,依賴于重力在倒置的基底上形成球狀體,該方法價格低廉,球體大小可控,但大規模生產受到限制[70]。液體覆蓋法,用非粘附材料處理,防止細胞附著于組織培養板并促進球狀體形成,該方法簡單、產量高,但球狀體的大小和形狀是不均勻的。轉壁式生物反應器(RWV)法,反應器可使細胞在懸浮液中水平旋轉,產生微重力,并促進細胞聚集成球狀體,該方法提供低流體剪切環境和促進細胞生長和隨機化重力矢量的最小湍流[71],但設置較復雜,成本較高。磁懸浮法,用鐵或金氧化物處理細胞,再用磁鐵將它們懸浮在介質中,促進球體的形成,該方法能快速生成球體,但成本過高,金屬納米顆粒也可能會干擾球體的相關實驗。除了運用特殊方法避免細胞粘附外,還可以運用基質促進球體生長,其提供細胞-細胞以及細胞-基質相互作用,細胞懸浮接種在基質包被的平板上方或包埋在基質內。天然來源的基質更能代表腫瘤微環境,因為它們類似于實體瘤的基質成分,最常用的是膠原蛋白或基質膠,除此之外還可用成纖維細胞衍生基質、絲素蛋白、藻酸鹽、透明質酸等。合成基質如聚乙二醇(PEG)、聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)和聚ε-己內酯(PCL)可自行定制培養所需的生長因子、細胞因子等添加劑,與天然基質相比,這些基質更均勻,但生理學適用性較差[72]。

類器官是三維細胞培養技術的最新發展成果,可用于通過引入疾病突變或使用患者來源的人多能干細胞來模擬疾病,模擬疾病的類器官可以用作藥物測試的替代系統,可以更好地再現人類患者的治療效果,甚至可能運用到組織替代療法。類器官是從干細胞或器官祖細胞發育而來的器官特異性細胞類型的集合,并以類似于體內的方式通過細胞分選和空間限制的譜系定型進行自組織[73]。這使得類器官能夠比任何其他類型的三維細胞培養物更有效地復制親本組織的基因型和表型,甚至能夠刺激體內細胞外囊泡的形成和分泌[74]。類器官并非沒有缺陷,其最常用的培養基質為基質膠,基質膠來自小鼠肉瘤,不能完全重現人體組織微環境。但這個問題已經有所改善,研究者將類器官與免疫細胞、基質細胞或生態位細胞的分泌組分共培養,以模擬人體組織微環境條件[75]。其次并非所有原代細胞都可以容易地培養為類器官,類器官生成也是一個相當昂貴的過程。目前人類多能干細胞生成三維類器官仍處于起步階段,迄今為止,人類多能干細胞已經被誘導產生腸、腎、腦、視網膜、子宮頸等類器官,子宮頸類器官提供了一個新的平臺,以研究HPV驅動的宮頸癌發展[73.76],但隨著三維細胞培養技術和組織再生技術的飛速發展,相信在不久的將來,人類類器官會變得更加成熟且多樣化。

3 總結

尖銳濕疣由HPV感染引起,導致人肛門和外生殖器的皮膚黏膜贅生物生成。HPV6和HPV11在其發病機制中占主導地位,若由HPV16、HPV18等高危型HPV感染引起,則伴有一定惡變潛力。在以上所描述的動物模型和三維細胞培養模型中,MmuPV1感染小鼠模型可以模擬HPV感染、傳播和引起人類肛門生殖器乳頭狀瘤的發病機制,是研究尖銳濕疣極具潛力的模型之一。異種移植物模型雖然在研究初期有著移植物存活時間短、成功率低、缺少模擬HPV感染及發病過程等缺點,但隨著轉基因人源化小鼠和種類增多和異種移植技術的成熟,尖銳濕疣異種移植物模型仍可作為其他模型在免疫應答方面的替代或補充。各種高危型和低危型HPV癌蛋白轉基因小鼠模型,也有助于研究HPV引起尖銳濕疣的致病機制,促進相關疫苗和治療措施的開發。各種三維細胞培養模型有各自的優勢和缺陷,但足以滿足研究HPV的整個分化依賴性生命周期,包括病毒體形態發生、病毒生長、感染、發病機制和病毒-宿主相互作用等,相比動物模型來說更適合研究嗜上皮病毒,在倫理問題、費用、處理方法以及將研究結果從非人類模型轉化為臨床方面都要更有優勢?？偠灾?隨著三維細胞培養技術的改善,這些模型將成為研究人員研究尖銳濕疣和相關治療方案的主要平臺。本片文章分類總結了HPV相關疾病動物模型和三維細胞培養模型,研究者可參考各模型優缺點,根據實驗需求選擇適合的模型。