HPLC法測定苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿含量

盧向紅 劉利輝 汪 霞 佘林立

1.湖南省婁底市食品藥品檢驗檢測所，湖南 婁底 417100；2.岳陽新華達制藥有限公司，湖南 岳陽 414000

苦柏洗劑是由岳陽市第二人民醫院制劑室委托岳陽新華達制藥有限公司生產的中藥制劑，其處方組成為苦參、鴉膽子、黃柏、丁香、蛇床子、海馬、白鮮皮、薄荷素油和艾葉。具有清熱解毒，燥濕殺蟲，祛風止癢的功效，臨床主要用于真菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎、老年性陰道炎、宮頸糜爛、濕疹及陰部瘙癢等癥屬濕熱者[1]。處方中君藥黃柏的主要活性成分為生物堿,其中鹽酸小檗堿是含量最高的生物堿,可達1.4%～5.8%[2], 體外研究[3-5]表明，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿均具有較強的抗炎作用和抗菌能力以及廣泛的抗菌譜。臣藥蛇床子主要成分是香豆素類化合物，如蛇床子素等,蛇床子素具有抑制炎癥發生、抗過敏等作用[6-7]。這三個成分是該藥發揮臨床療效的主要化學成分，原標準中未對這三個成分進行質量控制，使得制劑質量難以得到有效控制。本文采用高效液相色譜法同時測定苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的含量，制定了與臨床療效相關成分的含量控制方法，對增強藥品質量可控性，保證臨床用藥安全性，具有十分重要的意義，為進一步提高和完善藥品質量標準提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Thermo Fisher HPLC色譜儀(U3000) Chromeleon色譜工作站；梅特勒托利多 XSE205DU電子天平(十萬分之一)；超聲波清洗儀 KQ-300DE

1.2 試劑 水為I級純化水，乙腈(HoneyWell，批號：T8FA1H)為色譜純，磷酸(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20190301)為優級純、十二烷基硫酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160413)為分析純。

鹽酸巴馬汀對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號：110732-201913，含量85.7%)；蛇床子素對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號：110822-202111，含量99.7%)；鹽酸小檗堿對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號：110713-202015，含量85.9%)。

苦柏洗劑由受委托生產企業岳陽新華達制藥有限公司生產，批號為200701、201201、210301、210701。

2 試驗方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Zafex Acutfex PA-C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：25 ℃，0.1%磷酸溶液(含15%乙腈和0.2%十二烷基硫酸鈉)-乙腈(63∶37)，流速:1.0 mL·min-1，PDA檢測器，檢測波長：322 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸巴馬汀對照品15.24 mg，蛇床子素對照品16.35 mg，鹽酸小檗堿對照品23.80 mg，分別加甲醇制成每1 mL含鹽酸巴馬汀32.65 μg·mL-1，蛇床子素16.30 μg·mL-1，鹽酸小檗堿817.77 μg·mL-1的溶液，作為儲備液備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品3瓶內容物混勻，離心，精密取上清液10 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇8 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)20 min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按苦柏洗劑的處方和制備工藝，分別制備缺黃柏和蛇床子的陰性樣品，再按2.2.2供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗 分別取對照品溶液、樣品溶液、陰性對照溶液進樣12 μL，色譜圖如圖1。峰形對稱尖銳，基線平穩，各峰之間的分離度為2.17、3.54，達到基線分離，陰性樣品在三個主峰位置無干擾峰，如圖1所示。

(A)混合對照品 (B)苦柏洗劑樣品

(C)缺黃柏陰性樣品 (D)缺蛇床子陰性樣品1.鹽酸巴馬??；2.蛇床子素；3.鹽酸小檗堿圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性關系考察 精密吸取2.2.1項下各對照品儲備液適量，稀釋成含鹽酸巴馬汀0.6530 μg·mL-1、1.3061 μg·mL-1、1.6326 μg·mL-1、3.2652 μg·mL-1、6.5303 μg·mL-1、9.7955 μg·mL-1，蛇床子素0.3260 μg·mL-1、0.6520 μg·mL-1、0.8150 μg·mL-1、1.6301 μg·mL-1、3.2602 μg·mL-1、4.8903 μg·mL-1，鹽酸小檗堿16.3554 μg·mL-1、32.7107 μg·mL-1、40.8884 μg·mL-1、81.7768 μg·mL-1、163.5536 μg·mL-1、245.3304 μg·mL-1的混合標準溶液，進樣體積為10 μL，按上述色譜條件測定，以峰面積為縱坐標，以各對照品的濃度為橫坐標，進行線性回歸。結果見表1。

表1 苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的線性關系考察結果

2.5 精密度試驗 取對照品溶液連續進樣6次，每次12 μL，計算得到鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為：0.29%、1.01%和0.37%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一批號(210301)樣品6份，按2.2.2項下供試品液制備方法制備，依法測定，結果鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿含量RSD分別為：1.17%、1.23%和1.79%，表明本法重復性好。

2.7 穩定性試驗 取同一樣品溶液(批號：210301)在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h分別進樣12 μL，依法測定，鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為：0.72%、0.71%和0.34%，表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.8 加樣回收試驗 精密量取已知含量(鹽酸巴馬?。?.462 μg·mL-1,蛇床子素：1.270 μg·mL-1，鹽酸小檗堿：59.434 μg·mL-1)的同一樣品(批號：210301)6份，各5 mL置20 mL容量瓶中，各加水5 mL，精密加入含鹽酸巴馬汀(8.490 μg·mL-1)、蛇床子素(4.108 mg·mL-1)和鹽酸小檗堿(216.450 μg·mL-1)的混合對照品溶液1.5mL，加甲醇適量，超聲處理20 min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按樣品測定方法測定含量，計算回收率。結果見表2。

表2 苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的加樣回收試驗結果 (n=6)

表2(續)

2.9 樣品測定 取四批樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，依法測定鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的含量。結果見表3。

表3 苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿含量測定結果

3 討論

3.1 流動相的選擇 通過查閱文獻[8-11],在實驗過程中分別考察了0.1%磷酸溶液(含15%乙腈和0.2%十二烷基硫酸鈉)-乙腈，甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液-三乙胺，乙腈-水等流動相系統及多個比例，經過反復比較，采用0.1%磷酸溶液(含15%乙腈和0.2%十二烷基硫酸鈉)-乙腈(63∶37)進行洗脫，鹽酸巴馬汀、蛇床子素、鹽酸小檗堿與相鄰峰達到基線分離，峰形對稱性好，理論塔板數均在20000以上。

3.2 檢測波長的選擇 苦柏洗劑中的鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的結構不同，其紫外最大吸收波長也不同。采用PDA檢測器在190～400 nm波長范圍內進行全波長掃描，結果鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿在346 nm波長處有最大吸收，蛇床子素在322 nm波長處有最大吸收，為提高檢測靈敏度，因此選擇322 nm作為檢測波長。

3.3 提取方法的考察 本實驗對苦柏洗劑中指標性成分的提取方法進行了探索，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿屬于異喹啉生物堿，蛇床子素屬于香豆素類，均不溶于石油醚。分別考察了萃取和超聲兩種提取方法，結果顯示用石油醚(30～60 ℃)萃取除雜或者用二氯甲烷提取樣品，雜質成分減少，但主成分也會有所損失，且操作繁瑣。取樣品溶液加甲醇超聲提取，結果樣品中其他成分峰對主峰無干擾，結果準確、重復性好、操作簡便。同時比較了不同的超聲時間(10 min、20 min和30 min)，結果超聲20 min樣品含量最高，因此本實驗選擇用甲醇超聲20 min的方法提取樣品。

4 結論

本實驗采用高效液相色譜法法測定苦柏洗劑中的鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的含量，結果準確，重復性好，專屬性強，為進一步提高、完善原質量標準，更好地控制苦柏洗劑的質量提供了科學依據。