十字花科植物次生代謝物硫代葡萄糖苷生物合成運輸分解的研究進展

王偉杰， 禹艷坤， 譚小力

(江蘇大學生命科學研究院，江蘇鎮江 212013)

植物在與食草動物和微生物的長期斗爭中，進化出了各類防御系統，例如快速反應的氧爆發、細胞壁蛋白富集的交聯反應、胼胝質沉淀等[1-2]。有些反應發生得較慢，如產生次生代謝產物來抵御外界威脅[3]。在十字花科植物中，次生代謝產物硫代葡萄糖苷(glucosinolate，GLS，硫苷)是主要的防御物質之一[4]。其化學結構主要包括3部分：β-D-硫苷葡糖基、醛肟酸、不同的R基。R基的前體是氨基酸，不同的氨基酸可以衍生出不同的R基，進而合成不同種類的硫苷[5]。根據不同的氨基酸前體，可將硫苷分為3類：脂肪族硫苷、吲哚族硫苷、芳香族硫苷[6-7]。脂肪族硫苷R基前體包括亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸；吲哚族硫苷的R基前體則是色氨酸等；芳香族硫苷R基前體是酪氨酸、苯丙氨酸。常見的硫苷類型如表1所示。

表1 常見硫苷的種類

硫苷的含量在植物不同的組織和生長階段是動態變化的，成熟種子中的硫苷含量通常高于葉片中的，營養生長期葉片中的硫苷含量通常高于生殖生長期的。硫苷轉運蛋白(glucosinolate transporter，GTR)參與了這一調節過程[8-9]。

參與硫苷水解的黑芥子酶位于質外體，合成的硫苷會儲存在細胞內，避免被黑芥子酶水解。當植物受到損傷或攻擊時，細胞破裂，硫苷與黑芥子酶反應，進而產生不同的水解產物來抵抗微生物和食草昆蟲。硫苷除了防御作用，在風味調節以及抗癌、生物熏蒸等方面都有較大的貢獻[10-11]。

本文將對硫苷的合成、運輸、分解以及硫苷的應用進行討論。

1 硫苷的合成

硫苷的合成分為3個步驟：主鏈的延長、核心結構的生成、側鏈的修飾。根據不同的R鏈可分為3種硫苷：脂肪族硫苷、吲哚族硫苷、芳香族硫苷[5，14]。硫苷在淀粉鞘和薄壁細胞中合成，儲存在硫細胞中或者由韌皮部轉運到不同部位[12]。硫苷主要在營養生長期的葉片和莖、生殖生長期的幼嫩角果皮中合成，成熟的種子中檢測不到硫苷合成必需基因的表達，因此一般認為種子中的硫苷累積主要來源于營養體，如葉片和角果[12-13]。

1.1 主鏈的延長

氨基酸首先在甲硫氨酸轉氨酶(branched-chain amino transferase4，BCAT4)的作用下脫氨基，生成對應的含氧酸，再經歷乙酰輔酶A縮合、異構化、氧化羧合循環進行主鏈延長(圖1-a)，主鏈的延長循環最多9次。硫苷的合成涉及到大量基因，包括上述的甲硫氨酸轉氨酶和甲硫烷基蘋果酸鹽合成酶基因MAMs(methylthioalkymalate synthase)[15]。MAM基因在主鏈延長步驟中起重要作用[17]，MAM1主要作用于前2個循環，MAM2僅催化循環的第1輪反應，MAM3主要作用于第6次延長反應，其余反應由MAM-L(methylthioalkymalate synthase-like，MAM-LIKE)基因完成[18]。

1.2 核心結構的合成

主鏈延長結束后，開始核心結構的合成，主鏈延長后的產物在細胞色素P450家族CYP79作用下生成醛肟[16]。CYP79在此步驟中主要負責N-羥基化反應，可以催化二高甲硫氨酸生成5-甲硫基戊醛肟，其中，脂肪族硫苷合成中此步驟主要由CYP79F1/F2負責(圖1-b)；吲哚族硫苷合成中的此步驟則主要由CYP79B2/B3負責[19-22]；芳香族硫苷研究較少，目前尚未明確在此步驟中起作用的關鍵基因。5-甲硫基戊醛肟在CYP83的作用下形成異硝基化合物，然后在谷胱甘肽轉移酶(glutathione transferase，GST)和C-S裂解酶的作用下形成硫基吲哚羥肟酸，最后在硫-葡糖轉移酶(sulfur glucotransferase，S-GT)和磺基轉移酶(sulfotransferase，ST)的作用下形成脫硫硫苷和硫苷。UGT74家族也作用于此步驟，主要參與的基因是UGT74B1/C1，分別參與吲哚族和脂肪族硫苷的合成。

1.3 側鏈修飾

側鏈修飾包括羥基化、氧-甲基化、糖基化以及?；饔玫?，該步驟中起主要作用的是氧化戊二酸依賴的雙加氧酶AOP2(alkenyl hydroxalkyl producing 2)和AOP3以及FMOGS-OX1(FLAVIN-MONOOXYGENASE GLUCOSINOLATE S-OXYGENASE 1)(圖1-c)。AOP2的作用是將側鏈修飾為羥基，而AOP3的作用則是將側鏈修飾為苯甲酸基[23-24]。二者的主要區別是啟動子區域的差異以及AOP2開放閱讀框的部分缺失，導致AOP2是一個高度截短的蛋白[25]，FMOGS-OX1的作用是催化甲基硫代烷基轉化為甲基亞磺?；?。

研究發現，與野生型相比，AOP2過表達的擬南芥植株中MYB28/29的表達量顯著上調，且硫苷的含量上升了近2倍，其作用機制是AOP2控制MYB28/29的表達量來調節短鏈硫苷的合成。另外，AOP2不僅可以調控MYB轉錄因子的轉錄，還可以不經過MYB轉錄因子，對5個硫苷合成相關基因(GGP1、CYP83B1、SOT16、CYP81F4、GS-OX2)進行直接調控[26]。

R2R3MYB轉錄因子與植物代謝密切相關[28]，參與例如花青素、植保素等次生代謝產物的調控[29-30]。MYB28、MYB29在脂肪族硫苷的合成途徑中會與很多基因互作影響硫苷的合成，例如BCAT4、MAM、CYP79；這2個MYB轉錄因子與MAM基因結合共同調控短鏈脂肪族硫苷核心結構的生成[31]。脂肪族硫苷4-甲基硫代丁基硫苷(4-MTO)是典型的短鏈脂肪族硫苷，在myb28突變體中，其含量顯著下降，證明MYB28對短鏈脂肪族硫苷的合成十分重要[32]。另一個MYB28對短鏈脂肪族硫苷核心結構生成十分重要的證據是，使用外源葡萄糖誘導擬南芥后，發現MYB28的表達量和硫苷的含量顯著升高，并且上升趨勢與時間呈正相關線性關系[33]。進一步研究發現，葡萄糖分子被己糖激酶(hfexokinase，HXK)識別并被RGS1(regulator of G-protein signaling 1)調節，RGS1會持續地影響MYB28、MYB29、CYP79F1/F2的表達，但是葡萄糖調節硫苷合成相關基因的具體機制尚未清晰。在hkx突變體中，使用外源葡萄糖誘導，不能引起硫苷合成相關基因的表達量和硫苷含量的改變。另外，在myb29突變體中，經外源葡萄糖誘導，硫苷含量有所增加，在myb28中則沒有類似現象，說明MYB28在脂肪族硫苷合成中的作用要大于MYB29[34]。不僅外源葡萄糖可以影響硫苷合成，有研究表明外源硒誘導后，脂肪族硫苷合成相關基因的表達量下調，而吲哚族硫苷合成的相關基因表達量上調[35]。

主要涉及到吲哚族硫苷合成的基因是MYB家族的MYB34、MYB51、MYB122以及MYC家族的MYC2、MYC3[36-37]。在不同部位和激素刺激下，MYB基因的功能不同。例如，MYB34主要在根中起作用，當受到脫落酸(abscisic acid，ABA)刺激后，會產生大量的吲哚-3-亞甲基硫苷(indole-3-methylene，I3M)和1-甲氧基-吲哚-3-亞甲基硫苷(1-methoxy-indole-3-methylene，1-MO-I3M)。MYB51主要在側枝中起作用，在茉莉酸(jasmonic acid，JA)和乙烯(ethylene，ET)的刺激下，會提高I3M和4-MO-I3M含量。MYB122調節硫苷合成能力較弱，只有在JA的刺激下起作用[38]。MYC家族主要涉及植物激素的合成，在吲哚族硫苷的合成過程中，MYC家族與MYB家族的成員結合后，共同調控硫苷的合成[39]，例如MYC2需要和MYB51結合，調節硫苷的合成。另外，種子萌發以及受到病原微生物侵害時，吲哚族硫苷的含量會發生明顯變化，感知非病原微生物存在時，吲哚族硫苷含量變化相對較小。因此，吲哚族硫苷的含量變化或許可以開發為一項識別病原微生物的指標[40]。

硫苷合成涉及的基因不是簡單的基因加和效應，而是一個復雜的網絡結構。不同的轉錄因子作用于不同的基因，并且每個轉錄因子在基因網絡中作用不同。例如，MYB28對短鏈脂肪族硫苷的合成具有重要作用，但是在復雜的基因網絡中，對于不同種類的硫苷，MYB29的作用有時會大于MYB28。并且，同樣的基因在不同的環境和組織中會產生不同的效應。在不同酶的作用下或在不同組織中，原本起協同作用的轉錄因子可能會轉變為拮抗作用[41]。對于MYB34來說，在與MYB51協同作用的同時與MYB122是拮抗作用，因此3個轉錄因子能夠精準地調控吲哚族硫苷的含量[42-43]。

環境條件也會對硫苷含量造成影響，如濕度、溫度等。當溫度較高時，吲哚族硫苷的含量會受到較大影響，而脂肪族硫苷則受影響較小[86]。光強可以影響CYP83B1的表達量從而改變吲哚族硫苷和IAA的含量[16]。

2 硫苷的轉運

硫苷主要在營養器官中合成，然后通過轉運蛋白運輸至生殖器官[12]，不同時期和不同部位的硫苷含量也會隨著基因表達量的不同而改變[44]。例如，當葉片衰老以及種子萌發時，硫苷含量會下降[45]。研究硫苷運輸最直接的方法是利用放射性元素標記來指示硫苷的運輸路徑，可以觀測到硫苷從合成部位(如葉片)被運輸至其他部位(如種子)。此外，由于擬南芥不表達CYP79A1基因，將白菜型油菜的CYP79A1基因導入擬南芥，可以通過該基因參與合成的硫苷來研究運輸[46-47]。另外，在韌皮部運輸的是完整的硫苷，而不是脫硫硫苷[48-50]。

種子中沒有檢測到硫苷合成基因MYB28/29、MAMs的表達，說明在種子中幾乎沒有硫苷合成的主鏈延伸和核心結構生成這2個步驟，所以種子中的硫苷主要源于其他器官[13]。在低硫苷油菜早期的角果壁中，硫苷含量大約為30 μmol/g，種子成熟后角果壁中硫苷含量降至1 μmol/g，這個現象說明硫苷可能從角果壁轉運至種子中[4]。在過表達MYB28基因的植株中，其葉片硫苷的含量相比于野生型高了近3倍，而在種子中僅有微量的上升，這說明營養體中的硫苷并不會完全轉運到種子中，或者種子中的硫苷含量有一定的上限[51]。

GTR轉運蛋白是一個H+/硫苷共轉運蛋白，屬于硝酸鹽和肽轉運蛋白NPF(NRT1-PTR)家族，并且該蛋白的運輸效率不受底物側鏈結構的影響[9]。從進化的角度來看，NPF轉運蛋白可能是生氰糖苷的轉運蛋白進化而來，并且進化時間要早于硫苷合成途徑[52-53]。異源表達試驗發現，在非洲爪蛙卵母細胞中表達GTR后，細胞可以轉運4-甲基硫代丁基硫苷(4-MTB)和3-丙烯基(3-BUT)2種硫苷[54]。

GTR蛋白家族成員GTR1(NPF2.10)、GTR2(NPF2.11)、GTR3(NPF2.9)負責硫苷運輸[9]。GTR轉運蛋白主要在根部和莖表達，亞細胞定位試驗顯示GTR蛋白定位在質膜上，GTR1一般富集在葉片葉肉細胞的周圍，主要在韌皮部周圍的細胞中運輸硫苷。GTR2一般富集在脈管系統、韌皮部和質外體運輸硫苷[54]。GTR3主要富集在根器官韌皮部的伴隨細胞質膜上，其作用可能是將吲哚硫苷轉運到儲存細胞，從而保證根中硫苷含量[55]。GTR3轉運蛋白對吲哚族硫苷具有極高的偏好性，其轉運吲哚族硫苷的能力幾乎是轉運脂肪族硫苷的10倍。

gtr2突變體的種子由于轉運蛋白的部分缺失，影響硫苷從營養器官運輸到種子，從而引起硫苷在營養器官中的累積，種子中硫苷含量顯著下降。在gtr1、gtr2雙突變體種子中幾乎檢測不到硫苷的含量[13]。另外，與脂肪族硫苷大量滯留在營養器官中不同，色氨酸衍生的硫苷即吲哚族硫苷，雖然在種子中的含量明顯下降，但是在營養器官中卻沒有發現累積，這說明吲哚族硫苷可能存在其他轉運機制[56]。

NPF(nitrate transporter)轉運蛋白家族不僅涉及到硫苷的轉運，并且與植物激素的運輸也有關系，例如生長素、赤霉素、脫落酸[57]。在gtr1中，與野生型相比，不僅種子中硫苷的含量下降，植株表型也發生了變化，花絲延長能力和花粉開裂能力都下降，且角果也變得干癟，經赤霉素誘導可恢復部分表型。其原因是GTR1轉運硫苷的同時，也可以轉運具有生物活性的赤霉素(gibberellin，GA)和茉莉酸衍生物(JA-Ile)，由于GTR1在花器官中的表達部位主要是花絲基部、維管束、花藥，影響花絲部位GA從維管束到細胞的運輸，導致gtr1突變體花藥表層的厚度變薄，并減少了開裂所需的機械力。使用外源GA處理花苞后，角果變得飽滿，生殖能力恢復，但角果中的種子卻不能完全發育，可能是因為GA只能補償JA的部分作用。但是，當硫苷和GA等植物激素同時存在時，GTR1仍具有對硫苷的偏好性，會優先轉運硫苷[54]。

硫苷在細胞中合成后具有多個轉運途徑，使硫苷在葉片不同部位的分布情況不同：(1)硫苷合成后，被運輸至質外體，進入韌皮部，再通過GTR蛋白進入葉肉細胞和硫細胞，這些細胞大概具有 130 mmol/L 的硫苷滲透壓來保證運輸的效率[48]；(2)葉肉細胞同樣可以通過胞間連絲吸收硫苷，硫苷隨后會被運輸至表皮細胞，并在液泡表面GTR蛋白的作用下儲存在液泡中；(3)如果硫苷合成細胞位于韌皮部周圍，硫苷會被GTR轉運至韌皮部相連的細胞，然后通過胞間連絲進入韌皮部[13，53](圖2-d)。

在葉片中，硫苷主要集中在邊緣，葉柄以及葉片中軸(圖2-a)。硫苷的分布模式影響了昆蟲的攝食習慣，導致其更加偏好攝食低硫苷含量的葉肉細胞[58]。硫苷在GTR的作用下運輸至葉片邊緣 (圖2-b、圖2-c)，硫苷轉運至表皮細胞胞質的液泡中，在液泡中形成濃度梯度，在保證表皮細胞中高硫苷含量的同時，也可以使硫苷向葉片邊緣流動[9]。

植物抽薹后硫苷不再大量儲存在葉片，而是通過GTR轉運蛋白逐漸運輸至花序[59]。另外，由于衰老器官中前體的減少和氮元素的重新分配，也會造成葉片中硫苷含量的大幅下降[60]。

硫苷的轉運模式提供了一種新的育種方向，可以通過調節轉運基因的表達，實現保證葉片或者營養生長期較高硫苷含量的同時，盡可能降低種子中硫苷含量的目標，這樣既能保證抗性不受影響，又提高了菜籽油品質。

3 硫苷的水解

硫苷水解過程中黑芥子酶起重要作用，黑芥子酶是自然界中發現的唯一可以裂解含硫基團葡糖基的酶[61]。黑芥子酶主要由TGG1～TGG6(thioglucoside glucohydrolases，TGG)合成；另外，黑芥子酶合成后需要在ESM1(epithiospecifier-modifier 1)蛋白的協助下分解硫苷[62]。黑芥子酶通常存在于葉片、莖和花序的韌皮部組織。植物細胞完整時，黑芥子酶和硫苷是被生物膜隔離的；當植物受到食草類昆蟲和病原菌的攻擊時，硫苷與黑芥子酶之間的隔離被破壞，在黑芥子酶的催化下，硫苷被水解為異硫氰酸酯和腈類等物質[63]。硫苷水解生成有毒的水解產物，來抵抗昆蟲或者病原菌的侵害[64]。當植物感知到細菌鞭毛蛋白時，會提高吲哚族硫苷的產量，并同時提高黑芥子酶相關基因的表達量，使吲哚硫苷大量水解，其水解產物會進一步刺激胼胝質沉淀，從而激活植物的免疫[65]。在某些物種中(如芥末)，黑芥子酶和硫苷可以共存而不發生水解。這個現象可能是由于抗壞血酸抑制了黑芥子酶的活性，具體機制仍需要進一步研究[66]。

在不同的條件下硫苷會產生不同的水解產物：(1)當pH值=5～8時會產生異硫氰酸酯(isothiocyanate，ITC)；(2)當pH值=2～5或者有ESP(epithiospecifier protein)存在的情況下會產生腈類物質；(3)末端雙鍵捕獲腈類形成時釋放的S原子則會形成環硫醚；(4)如果在硫苷的3號位C原子上連接有羥基官能團則會形成惡唑烷-2-硫酮；(5)當pH值=8時還有可能會形成硫氰酸酯[67]。腈類是硫苷的簡單水解產物，其毒性往往不如同一底物產生的ITC[68]。不同種類硫苷的水解產物也不同，水解產物的毒性也有差異。以ITC為例，ITC的毒性取決于硫苷的R基種類以及鏈長度，芳香族硫苷產生的ITC毒性要大于脂肪族硫苷產生的，而短鏈硫苷產生的ITC毒性則要大于長鏈硫苷產生的[69]。另外，ITC在植物的耐熱性方面也有貢獻，可以作為一種信號分子來調節耐熱性[70]。

擬南芥受到綠桃蚜蟲(Myzuspersicae)的攻擊時，葉片中硫苷總量顯著上升，其中4MI3M、8MSO的含量上升最明顯；進一步試驗發現，相較于脂肪族硫苷，吲哚族硫苷會在CYP81F2酶的作用下產生4-甲氧基吲哚硫苷用于保衛細胞，可能吲哚族硫苷在抵抗昆蟲的攝食方面作用更大[71-72]。但是，cyp83a1突變體中不僅吲哚族硫苷的含量下降，表面蠟質也減少，這也會影響蟲類的攝食行為，因此不能簡單地歸因于吲哚族硫苷[73]。

吲哚-3-乙醛是吲哚族硫苷合成過程的中間產物，同時也是生長素(IAA)和植保素的中間產物，當IAA缺乏時，吲哚族硫苷被分解起到補償作用。如果吲哚族硫苷的合成被終止，累積的吲哚-3-乙醛會衍生為生長素，植物會表現出高生長素累積的表型。cyp79f1突變體中會產生大量的不定根，是因為根中的吲哚硫苷比例較高[45]，同時cyp79f1突變體會更吸引昆蟲的攝食。造成這種現象的原因一方面是由于硫苷含量降低，另一方面也與IAA含量上升有關，兩者共同導致了昆蟲攝食偏好性的改變[84]。

UDP-糖基轉移酶基因(UDP-glucosyltransferasegene)是吲哚族硫苷核心結構生成的重要基因，對核盤菌和灰霉菌的抗性研究發現，在ugt74中葉片染菌的面積更大，軟腐的現象也更嚴重；脂肪族硫苷合成關鍵基因突變后，染菌情況沒有明顯的差別，這說明在核盤菌和灰霉菌的抗性方面，吲哚族硫苷起到了更為重要的作用[74]。

硫苷的水解產物不是對所有食草性昆蟲都具有毒性，有些昆蟲會對硫苷的水解產物產生抗性，甚至有些昆蟲會將硫苷水解產物作為誘導劑在植株上產卵。這些昆蟲對硫苷的水解產物具有抗性的原因有很多，有些昆蟲體內會產生類似于黑芥子酶的蛋白來影響硫苷的水解，不會產生對昆蟲有害的ITC，而是將硫苷水解為腈類物質，進而排出體外[75]；另一種方式是昆蟲體內的裂解酶起作用，將硫苷結合的硫酸根裂解后，導致硫苷無法被黑芥子酶水解，也就不會產生毒害物質[76]。

在植物生長環境營養缺乏時，硫苷還可以起到后備能源的作用。研究發現，在缺乏硫的土壤上，野生型萌發時期擬南芥的質量相較于正常生長條件大幅下降，同時體內的硫苷也下降到了無法探測的水平，有可能是因為在營養缺失時，硫苷作為能源和營養儲備發揮作用[56]。另外，有研究發現硫苷合成的前體物質和水解物質之間有聯系，且這種聯系是屬間特異的，這賦予了硫苷作為化學分類標志物的潛能[77]。

4 硫苷的應用

雖然硫苷會影響油菜籽的品質，但是硫苷仍然有非常重要的應用價值。比如，研究人員利用硫苷抗菌抗蟲的特性，開發出其作為生物熏蒸材料的功能[78]；植物長期連作會造成土地營養缺失和病蟲害暴發，通過使用高硫苷含量的十字花科植物作為生物熏蒸材料，不僅可以補充土地肥力[79-80]，同時硫苷的水解產物如異硫氰酸酯可有效抑制土傳病害[81-82]。試驗證明，在不同溫度和不同添加物下抑菌效果也不同，例如在28.5 ℃時，芥菜與麥麩共同作用，對黃瓜枯萎病菌的抑制效率最高，抑菌率為68.2%；當枯草芽孢桿菌作為添加物，與芥菜結合使用時，對于種植茄子土壤中的大麗輪支菌(Verticilliumdahliae)的抑制率能達到33%[83]。

研究發現，很多植物的次生代謝物在抗癌方面有重要的作用。20世紀80年代研究發現，硫苷具有抗癌功能[86-88]，起作用的主要物質是異硫氰酸酯，對多種癌癥都有抑制作用，例如前列腺癌、胃癌、皮膚癌等[89]。研究人員通過純化異硫氰酸酯等水解產物進行抗癌研究時發現，它可以通過阻斷細胞周期來抑制前列腺癌細胞PC-3的增殖[90-91]。目前對于異硫氰酸酯如何阻斷細胞周期的機制尚未研究清晰，研究人員普遍猜測可能是由于其影響了癌細胞中的Ⅰ相和Ⅱ相還原酶，進而影響了癌細胞的代謝[92]。

另外，在風味方面，吲哚族硫苷和帶有烯基的硫苷水解產物可以產生特殊的苦味以及辛辣味[93]，通常會被作為調味品使用，例如辣根[94-96]。

5 總結與展望

十字花科植物種植廣泛，營養豐富，通過對十字花科植物次生代謝物硫苷的合成、轉運、代謝等方面作更深層次的研究，有助于進一步提高硫苷的利用率，進而實現更高的經濟價值。

首先，在硫苷合成方面，通過控制合成MAM、AOP2等關鍵基因的表達，可以調節硫苷總量，也可以調節脂肪族硫苷和吲哚族硫苷的比例，實現不同目標。例如，可以增加吲哚族硫苷的比例來提高其抗癌的作用，或提高脂肪族硫苷的比例來使其更加辛辣。其次，對于硫苷水解也值得進一步研究。水解產物對于維持植物自身的抗逆性十分重要，在抗癌和風味調節等方面也有貢獻。除此之外，如何利用水解產物的特性來開發更多的功能，仍需要繼續研究。對硫苷轉運能力的調節可以改變硫苷在不同部位的含量，在轉運能力被限制后，大量的硫苷會滯留在營養器官，使植株的抗逆性增加，并且能夠減少餅粕中硫苷的含量，提高餅粕的經濟價值。最后，硫苷被人體攝入后的反應及作用機制仍未被闡明，而最大化提升該機制對人體抗癌功能的同時，減少硫苷水解物對人體的危害十分關鍵，因此該方向具有很強的研究價值。

總之，硫代葡萄糖苷研究的重點是生物合成、運輸、分解，隨著相關基礎研究的不斷深入，可以預見這3個機制將會被闡明，使硫苷在試驗和生活中發揮更多作用。