硫苷生物合成過程中硫來源的研究進展

何超超，祝 彪，楊 靜，朱祝軍

（浙江農林大學 農業與食品科學學院浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江杭州311300）

硫代葡萄糖苷（glucosinolates，GS），簡稱硫苷，又稱芥子油苷，是植物中一類富含氮硫的陰離子次生代謝物質，主要存在于十字花科Cruciferae，尤其是蕓薹屬Brassica植物中，如白菜Brassica rapa ssp.pekinensis，甘藍Brassica oleracea，油菜Brassica napus，芥菜Brassica juncea，蕪菁Brassica rapa，擬南芥Arabidopsis thaliana等［1］。自從BUSSY［2］于1839年從芥菜子中首次發現硫苷后，硫苷的種類以及降解產物逐漸被人所認識。目前，鑒定出結構的硫苷已經超過132種［3］。所有硫苷都有一個共同的化學結構：一般由β-D-硫葡萄糖基、硫化肟基團以及來源于氨基酸的側鏈R基團組成。根據氨基酸側鏈R基團的不同，可將硫苷分為3類：脂肪族硫苷（側鏈主要來源于甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸），吲哚族硫苷（側鏈主要來源于色氨酸）和芳香族硫苷（側鏈主要來源于苯丙氨酸或酪氨酸）［1,4］。硫苷本身性質比較穩定，并不具備生物活性，主要存在于植物細胞的液泡中，而硫代葡萄糖苷酶（又稱黑芥子酶）則位于特定的蛋白體中，只有當植物組織破碎時（如病蟲害侵襲或機械損傷），兩者得以接觸，硫苷在黑芥子酶的作用下水解產生異硫氰酸鹽、硫氰酸脂、腈類等生物活性物質［4］。這些水解產物具有重要的生物學功能，不僅是十字花科蔬菜獨特風味物質的主要來源，而且在抵御昆蟲取食［5－7］、病原菌侵染［8］以及各種非生物脅迫［9］（如水分、溫度、光照、鹽脅迫）等植物防衛反應中也發揮了重要作用，更重要的是它對人體而言具有預防結腸癌、乳腺癌、肺癌等癌癥發生的作用［10－11］。經過數十年的研究，硫苷的生物合成途徑及其調節基因在模式植物擬南芥中已經基本闡明［12－14］。硫苷的生物合成過程主要包括以下3個階段：氨基酸側鏈的延長，核心結構的形成和側鏈的次級修飾［12］。在硫苷核心結構形成過程中，硝基化合物或氧化腈在谷胱甘肽硫轉移酶（gultathione-S-transferase，GST）的作用下與硫供體（半胱氨酸或谷胱甘肽）結合，形成S-烷基硫代氧肟；以及脫硫硫苷在磺基轉移酶（sulfotransferase，SOT）的催化下， 與高能硫供體 3′磷酸腺苷 5′磷酰硫酸（3′-phospho-adenosine-5′-phosphosullfate， PAPS）結合， 在 N 末端生成一個SO42－，從而形成基本的硫苷結構。這2步反應都需要硫供體，也使得最終的硫苷中含有大量的硫元素且被運送到種子中儲存起來，用于應對缺硫脅迫，保證植物體內的硫平衡［15］。筆者總結了近年來硫苷生物合成過程中硫來源的研究進展，并在此基礎上分析了初生硫代謝與硫苷合成的關系，希望進一步完善硫苷的代謝網絡，為日后研究硫的初生與次生代謝途徑間的相互作用提供理論指導。

1 硫苷合成過程中的還原硫供體

1.1 半胱氨酸（Cys）作為還原硫供體

半胱氨酸（cysteine，Cys）是硫營養代謝的樞紐，植物吸收的無機硫經過一系列還原和同化反應進入有機骨架，形成Cys；植物以Cys為前體，合成眾多具有重要生物學功能的含硫化合物；因此，Cys在細胞內的積累量很低，但通量很高［16］。一直以來，Cys被認為是硫苷合成過程中的還原硫供體，在GST或者GST類似功能酶的催化下與硝基化合物或者氧化腈結合形成S-烷基硫代氧肟。同位素標記的體內試驗表明：半胱氨酸比甲硫氨酸等硫醇類物質更易參與到硫苷的合成過程；但是，體外試驗表明：硫醇類物質都易與硝基化合物結合［17］。而最近的研究表明，谷胱甘肽也可以為硫苷的合成提供還原硫。

1.2 谷胱甘肽（GSH）作為還原硫供體

谷胱甘肽（glutathione，GSH），是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽化合物，是植物體內廣泛存在的生物活性物質，其活性位點為半胱氨酸的巰基［18－19］。巰基的存在使其具有很強的還原能力；此外，谷氨酸與半胱氨酸之間存在1個不多見的γ-肽鍵能夠保護GSH不被許多肽酶水解［18］。GSH特殊的化學結構使其具有重要的生物學功能。它在還原硫的儲存和轉運，酶活性的調節，清除活性氧，抵抗各種逆境脅迫（重金屬、干旱脅迫、鹽脅迫、病菌侵染）等方面都具有重要作用［20－26］。最近的研究表明：GSH也可以作為還原硫供體與硝基化合物或者氧化腈結合，直接參與硫苷的生物合成過程。

首次指出GSH參與硫苷合成的試驗來自于對pad2突變體的分析，此突變體缺失γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-Glu-Cys synthetase，GSH1）［27］，即GSH合成的關鍵酶，突變體的GSH含量只有野生型的20%，同時Cys含量上升了5倍，但是與野生型相比硫苷的含量卻沒有顯著變化；而經過24 h的昆蟲（夜蛾Noctuidae）誘導，突變體的吲哚-3-甲基硫代葡萄糖苷和4-甲基亞磺酰丁基硫代葡萄糖苷的含量只有野生型的50%［17,28］，這就說明GSH與硫苷的合成存在一定的關系，但是由于GSH功能的復雜性，具體關系在此研究中并未闡明。

GEUFLORES等［29］利用基因工程手段在煙草Nicotiana tabacum中首次證明了GSH可以為硫苷合成提供還原硫。當苯甲基硫代葡萄糖苷（benzylgulcosinolate，BGLS）合成基因（CYP79A2，CYP83B1，SUR1，UGT74B1，SOT16）在煙草葉片中共表達時，產生低含量的BGLS，但同時積累了GSH與硝基化合物的共軛物（S-［（Z）-phenylacetohydroximoyl］-L-glutathione， GS-B）［29］。 這是因為 C-S 裂解酶（C-S lyase，SUR1）不能催化谷氨酸與半胱氨酸之間的γ-谷?；乃?。這就意味著存在一個酶對γ-谷?；哂兴庾饔?。然而，有類似功能酶的γ-谷?；D肽酶家族（GGT家族）定位于非原質體或者是液泡，而硫苷的合成定位于細胞質，這就排除了GGT酶在硫苷合成中的作用［30］。另外，在大腸埃希菌Escherichia coli中也發現了具有類似功能的酶，此酶含有一個γ-谷?；D移酶結構域［30］。而當含有同型結構域的γ-谷?；饷福é?glutamyl peptidase，GGP）重組體在上述煙草葉片中共表達時，GS-B的積累下降， BGLS的含量上升（大約5倍），這就證明了非GGT家族的γ-谷?；饷傅拇嬖冢?9］。此外，體外試驗也證明了GGP1可以催化γ-谷?；乃?。

以上在不合成硫苷的植物（煙草）中證明了GSH為硫苷的合成提供硫，并且證明了GGP1對γ-谷?；乃庾饔?，但還需要證明在含有硫苷的植物中也存在這種機制。GEUFLORES等［31］又以模式植物擬南芥的GGP1和GGP3的雙突變體為研究對象，研究表明此突變體的硫苷含量顯著下降，并且積累了10種GSH與硝基化合物的共軛物；同時亞細胞定位表明，GGP1和GGP3定位于細胞質，這與硫苷合成的相關酶系相一致，這就為GSH可以作為硫苷合成過程中的還原硫供體提供了更為明確和直接的證據，而且也進一步證明GGP對γ-谷?；乃庾饔?。然而，GGP1和GGP3的雙突變體中仍然含有大量的硫苷，這說明可能還存在其他的γ-谷?；饷?，有待于進一步研究和確認［30］。

2 高能硫供體3′磷酸腺苷5′磷酰硫酸（PAPS）為硫苷合成提供了活化硫酸鹽

高能硫供體3′磷酸腺苷5′磷酰硫酸（PAPS）是活化硫酸鹽在細胞內的積累形式，也是磺基轉移酶（SOT）作用的底物［32］。在硫苷核心結構合成的最后一步，PAPS在SOT的作用下將硫酸根（SO42－）轉移至脫硫硫苷的羥基，形成基本的硫苷結構［33］。目前，在擬南芥中發現磺基轉移酶家族共有18個成員，根據編碼序列的同源性可分成7個亞家族，主要功能是催化硫苷、黃酮、植物磺肽素等次生代謝物的硫酸化反應［34］。其中，SOT16，SOT17和SOT18主要負責硫苷的硫酸化反應，表達水平受到組織器官、生長階段以及光照條件等的影響，且具有不同的底物專一性，SOT16主要催化吲哚族和芳香族硫苷的硫酸化反應，而SOT17和SOT18對長鏈的脂肪族脫硫硫苷具有更高的親和性［34－35］。

PAPS是植物吸收的SO42－在腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的參與下由ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase，ATPS）和APS激酶（APS kinase，APK）催化合成。目前，在擬南芥中發現APK家族共有4個成員，而只有apk1apk2雙突變體的硫苷含量顯著減少，同時積累了大量的脫硫硫苷［34,36－37］。且亞細胞定位表明：硫苷的合成定位于細胞質（SOT16，SOT17和SOT18均位于細胞質），而APK基因家族中只有APK3位于細胞質，APK1，APK2和APK4均位于葉綠體［34,37］。這說明存在一個轉運機制將PAPS從葉綠體轉運至細胞質以供硫苷的合成。近來的研究證實了PAPS轉運蛋白（PAPS transporter，PAPST1）可以順著濃度梯度將PAPS跨膜轉運至細胞質［37］。

進一步的研究表明： PAPS 脫去硫酸根后的產物 3′,5′磷酸腺苷（3′,5′-phosphoadenosine， PAP）具有細胞毒性 （抑制RNA酶對畸形RNA的分解作用），而PAPST1可以順著濃度梯度將PAP轉運至葉綠體，在葉綠體中存在PAP磷酸酶（PAP phosphatase，FRY1）催化PAP降解形成腺苷酸（adenosine monophosphate,AMP）［37］。因此，在PAPST1順濃度梯度跨膜轉運機制的基礎上，PAPS的合成與利用以及PAP的降解相互作用，共同調控硫苷的生物合成途徑。缺失PAPST1的擬南芥突變體硫苷含量也顯著減少且積累了脫硫硫苷，但是積累程度不及apk1apk2雙突變體，說明可能還存在其他的PAPS轉運體，還有待于進一步研究確認。同時這也說明了SOT催化的脫硫硫苷的硫酸化作用不僅受到低濃度PAPS的抑制，而且當PAPS/PAP的轉運機制失調時，此反應也受到抑制［37］。

3 初生硫代謝與硫苷合成的關系

植物根部吸收的硫酸鹽，在多種硫酸鹽轉運蛋白的協同作用下，通過木質部和韌皮部，最終進入葉綠體或質體被 ATPS 活化形成 5′腺苷磷酸硫酸（adenosine 5′-phosphosulfate， APS）［16,38－39］。 APS 在能量上是不穩定的，可以被APS還原酶（APS reductase，APR）還原形成SO32－，進入硫的初生代謝途徑，形成半胱氨酸、谷胱甘肽、甲硫氨酸等含硫化合物，并進一步為硫苷等次生代謝物的合成提供原料；也可以在APK的作用下磷酸化形成PAPS，PAPS進入次生代謝途徑，為硫苷等次生代謝物的合成提供活化硫酸鹽［34,37］。因此，硫苷的合成與硫代謝間有著密切的關系。

3.1 初生硫代謝為硫苷的合成提供原料

初生硫代謝為硫苷的合成提供了前體氨基酸（甲硫氨酸，Met），還原硫供體（Cys和GSH）以及活化硫酸鹽（PAPS），而硫苷的合成受植物體內硫營養水平的調控。研究表明：增施硫肥能夠顯著提高植物體內硫苷的積累［40］；而在缺硫條件下，擬南芥的硫苷合成基因的表達下調，黑芥子酶編碼基因的表達上調，說明植物一方面通過減少硫苷的合成以降低次生代謝對硫的利用，另一方面增加其降解以提高硫從次生代謝向初生代謝的轉化，以緩解缺硫脅迫，保證植物正常的生長發育［41］。HUSEBY等［42］研究表明：光照條件下，硫酸鹽轉運蛋白、APR等初生硫代謝基因表達上調，同時硫苷合成基因的表達也上調，硫苷含量上升。此外，Met是合成脂肪族硫苷的前體氨基酸，而與吲哚族和芳香族硫苷相比，脂肪族硫苷對環境供硫水平的反應更為靈敏［41］。

3.2 初生硫代謝與硫苷合成的調控機制

初生硫代謝與硫苷合成的調控機制錯綜復雜，受到APK和APR等硫代謝關鍵基因，MYB等硫苷合成轉錄因子以及細胞內的氧化還原水平等多方面的影響。

在硫代謝途徑中，APS可以在APK的作用下，與ATP反應形成PAPS，PAPS為硫苷的合成提供活化硫酸鹽；或者在APR的作用下，進入硫的還原和同化途徑［16,39］，因此，APS成為硫初生與次生代謝途徑的分支點，APK和APR則成為重要的調控因子。MUGFORD等［36］研究表明，apk1apk2擬南芥突變體的硫苷含量只有野生型的15%，微陣列分析顯示硫苷合成基因（UGT74B1，CYP83B1，SUR1，SOT16，SOT18）的轉錄水平上調，脫硫硫苷積累；PAPS合成受阻導致初生硫代謝途徑上調，Cys和GSH的含量顯著上升，但是APS含量下降，APR活性沒有明顯的變化；而硫酸鹽轉運基因以及ATPS（ATPS1和ATPS3）表達的上調可能是受到PAPS不足的誘導［34］。在APK過量表達的材料中，硫苷含量并沒有顯著變化（盡管MAM3和SOT17的轉錄水平上調），但是APR活性受誘導，進入初生硫代謝的通量上升［34,37］。APR是硫還原同化途徑的重要調控因子，并受Cys和GSH的反饋抑制，即缺硫會導致APR的活性顯著升高；而當Cys或者GSH濃度高時，APR的活性就會受到抑制，這也體現了硫代謝途徑受需求驅動的特點［16,39］。

MYB是一類轉錄因子，能在轉錄水平上通過調節與其相關的基因的表達來調控硫苷的合成［12］。其中，MYB28，MYB29和MYB76能夠調控脂肪族硫苷的合成，MYB34，MYB51和MYB122能夠調控吲哚族硫苷的合成［12］。研究表明：MYB也可以直接調控ATPS和APR等初生硫代謝基因［39］。MYB的過量表達導致ATPS1和ATPS3的轉錄水平上調，硫初生代謝途徑受誘導，GSH含量上升；而缺失MYB的突變體中，APR的轉錄水平下調［34］。

此外，初生硫代謝與硫苷的合成還受到細胞內氧化還原水平的調節。研究表明：APR受氧化應激的誘導，而APK在還原產物含量高時活性更高。當植物處于脅迫狀態時，活性氧的產生導致APR活性上升，而APK活性受抑制，硫的初生代謝途徑上調［34,37］。因此，當細胞處于氧化狀態時，硫進入初生代謝的通量提高，而當細胞處于還原狀態時，硫更傾向于進入硫苷合成等次生代謝途徑。

4 小結與展望

硫苷是十字花科植物一類富含氮硫的次生代謝物，因硫苷作為十字花科蔬菜風味物質的來源被人們認識已久，而且硫苷及其降解產物因在植物防御以及降低人體癌癥發生率方面的重要生物學功效而受到越來越廣泛的關注。到目前為止，硫苷的生物合成過程及其調控基因在模式植物擬南芥中已經基本闡明。硫苷作為植物體內有機硫的重要儲存形式，其合成過程也伴隨著硫的還原和同化，且硫還原同化途徑產物Cys和GSH是硫苷合成過程中的還原硫供體，PAPS則為硫苷的合成提供了活化硫酸鹽，因此硫苷的合成與硫的還原和同化途徑（初生硫代謝途徑）間有著密切的聯系。但是硫的初生代謝與硫苷的合成受到APK和APR等硫代謝關鍵基因，MYB等硫苷合成轉錄因子以及細胞內的氧化還原水平等多方面的影響，其調控機制錯綜復雜，還存在許多懸而未決的問題，比如硫營養信號轉導、硫與氮等其他營養元素之間的協調、葡萄糖等植物激素之間的信號交流對硫苷合成的生物調控，這都有待于進一步研究，以明確硫的初生代謝與次生代謝途徑間的相互作用。此外，以GSH作為硫苷合成的還原硫供體時，是否還存在羧肽酶的水解作用還不明確，尚需進一步探究；GGP的具體作用機制仍處于推論階段，仍需進一步研究；GSH的動態平衡對硫苷合成的調控作用也是人們關注的問題，也有可能成為新的研究熱點。隨著科學研究的不斷深入，在未來可以利用遺傳學、蛋白組學、代謝組學、基因工程等手段人為操縱硫苷的生物合成，這對提高作物對病蟲害的抗性、作物的抗癌活性以及新品種的選育和改良具有十分重要的意義。

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