基于LC-MS/MS和比較基因組學技術解析海洋源解淀粉芽孢桿菌CMT-9產抗菌脂肽的分子機理

花梅芳，李東迅，鄧旗*，孫力軍*，鐘賽意，廖建萌

1(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術研究中心，廣東省海洋生物制品工程實驗室，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江，524088) 2(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心(大連工業大學)，遼寧 大連，116034) 3(湛江市食品藥品檢驗所，廣東 湛江，524022)

抗菌脂肽是芽孢桿菌中的非核糖體多肽合成酶催化合成的小分子脂肽，主要包括表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和芬薺素(fengycin)3大家族化合物[1-2]?？咕目咕V廣，對大多數細菌和真菌都有抑制作用，且具有綠色、高效、低毒、無污染等優點[3-5]。因此，在食品、醫藥、農業等領域具有廣泛的發展前景[6-9]。

芽孢桿菌種類繁多，枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌等均能產生抗菌脂肽[10-12]。不同芽孢桿菌的脂肽譜有所差異，主要與其合成酶及關鍵基因的數量和結構相關[13-14]。DENG等[15]對B.velezensisCMT-6進行高通量測序發現，合成酶基因srfA、ituA、fenA的完整性分別是菌株合成脂肽(surfactin、iturin和fengycin)的前提條件，而核心基因發生的InDels和SNP情況是造成脂肽種類和產量差異的主要原因。此外，脂肽是由前體物質氨基酸殘基和脂肪酸鏈組成的大環內酯類物質[16-17]，但目前關于前體物質合成途徑中功能基因和代謝通路中關鍵基因的表達情況及其對脂肽譜的影響鮮有報道。

本課題組從海洋紅樹林生境中篩選到一株芽孢桿菌B.amyloliquefaciensCMT-9，該菌株具有生長速度快、營養需求簡單且抗逆性強、抗菌譜廣泛等特點，展現出良好的應用潛力。為探明海洋源CMT-9產脂肽的組分及其分子機理，本研究擬以高效液相色譜串聯質譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技術鑒定CMT-9的發酵液組分，采用全基因組測序技術探明CMT-9基因組中合成脂肽的代謝通路和關鍵基因，同時通過比較基因組學分析其與不同種屬的陸地源芽孢桿菌B.velezensisCMT-6(可合成surfactin、iturin和fengycin)、B.velezensisFZB42(可合成surfactin、fengycin)、B.amyloliquefaciensDSM7T(可合成surfactin、iturin)和B.subtilis168(無脂肽合成能力)之間的脂肽譜差異性，為解析CMT-9產脂肽的調控機制和指導其實際生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

BacillusamyloliquefaciensCMT-9，廣東海洋大學食品科技學院水產品綠色控制實驗室保藏。

1.1.2 培養基

改良Landy培養基(g/L)：葡萄糖20.0，L-谷氨酸氫鈉5.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，KH2PO4·3H2O 1.0，FeSO4·7H2O 0.001 5，MnSO·5H2O 0.05，CuSO4·5H2O 0.001 6，pH 7.0。

LB培養基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 5.0，pH 7.0。

1.2 儀器與設備

HHS恒溫水浴鍋、SPX-250B-Z生化培養箱，上海博迅實業有限公司；PHS-3E型pH計，上海雷磁儀器有限公司；DC-12H氮吹儀，上海安譜科學儀器有限公司；Invitrogen Qubit 4熒光定量儀，美國賽默飛世爾公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 脂肽發酵條件

挑取菌株CMT-9在50 mL LB培養基中37 ℃、150 r/min培養14 h進行活化復壯。按體積分數為5%的接種量加入100 mL改良Landy培養基中，30 ℃、160 r/min發酵培養36 h。

1.3.2 脂肽組分檢測

將發酵液置于4 ℃，8 000 r/min離心30 min，獲得上清液。加入甲酸調節pH至2.0，靜置沉淀8 h。8 000 r/min、4 ℃離心20 min，向沉淀物加入少量的無菌水，用氨水調pH至7.0，甲醇萃取2～6 h，然后10 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液。同樣步驟萃取2次，合并上清液并經旋轉蒸發儀濃縮至近干，加入無菌水稀釋，用無菌0.22 μm濾膜過濾。采用LC-MS/MS技術測定發酵液主要成分，參照DENG等[18]進行參數設置。

1.3.3 RNA提取和檢測

采用DNeasy plantMini kit試劑盒提取CMT-9的基因組RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測技術和熒光定量儀檢測樣品基因組RNA的完整性、總量和濃度。

1.3.4 基因組測序與基因功能注釋

將合格的RNA樣品送到深圳華大基因研究院進行富集純化、反轉錄文庫的構建及測序。將通過高通量測序獲得的每個樣品的轉錄組文庫轉化為原始測序序列數據，對其進行CASAVA堿基序列鑒定分析。通過軟件HTseq(版本：0.12.4)來處理高通量測序所產生的數據，將這些reads高效、準確地比對到基因上去，使不同基因、不同實驗間估計的基因表達水平具有可比性。用DESeq 2R軟件分析和比較差異表達基因。采用Benjamini & Hochberg方法調整P值，將P<0.05和∣log2fold change∣≥2設置為差異表達基因。利用GO數據庫(http://geneontology.org/)和KEGG數據庫(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)分別對差異表達基因進行分析；利用COG數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog-project/)、CAZy數據庫(http://www.cazy.org/)分別對差異表達基因的代謝途徑、碳水化合物酶類進行注釋。

1.3.5 比較基因組學分析

將B.amyloliquefaciensCMT-9與B.velezensisCMT-6、B.amyloliquefaciensDSM7T、B.velezensisFZB42和B.subtilis168進行比較基因組學分析。

2 結果與分析

2.1 CMT-9發酵產物的LC-MS/MS分析

CMT-9發酵產物的LC-MS/MS離子流圖如圖1所示。

圖1 CMT-9發酵產物的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of CMT-9 fermentation products

CMT-9菌株發酵產物的主要質荷比為995、1 008、1 022、1 058、1 044、1 057、1 071、1 036、1 432，共9種組分。這些組分的質荷比與文獻報道的在相同發酵工藝和純化條件下檢測到的surfactin(m/z為995、1 008、1 022、1 036、1 058、1 044)和iturin(m/z為1 057、1 071)的分子質量相一致[18]。由此初步判定CMT-9菌株所產生的抗菌物質為surfactin和iturin[18]。此外，鄧旗等[19]研究發現fengycin A的質荷比在1 431～1 492，由此推測質荷比為1 432的組分可能是fengycin A的一種。

2.2 CMT-9差異表達基因的功能富集分析

由圖2可得，將菌株CMT-9的基因序列與GO數據庫進行比對共注釋到9 763個基因，其中與分子功能相關的基因數量為4 617個，主要富集在催化活性(catalytical activity)，轉運能力(transport activity)；與細胞組成相關的基因數量為2 189個，主要富集在高分子聚乳酸(macromolecular complex)；與生物過程相關的基因數量為2 957個，主要富集在代謝過程(metabolic process)，細胞過程(cellular process)，生物調節(biological regulation)。

圖2 CMT-9差異基因的GO功能分類與富集Fig.2 GO functional classification and enrichment of CMT-9 differential genes

由圖3可得，KEGG分析表明CMT-9發酵培養后的差異基因在代謝(metabolism)、環境信息過程(environmental information processing)和基因信息過程(genetic information processing)通路顯著富集，其中最豐富的路徑為代謝過程中的碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)，它們的差異基因個數分別為506和411。

圖3 CMT-9差異基因的KEGG通路分類與富集Fig.3 KEGG pathway classification and enrichment of CMT-9 differential genes

由圖4可得，通過COG功能分析發現差異基因主要富集在一般功能預測(general function prediction only)、氨基酸運輸與代謝(amino acid transport and metabolism)、碳水化合物運輸與代謝(carbohydrate transport and metabolism)。其中，參與氨基酸運輸與代謝(amino acid transport and metabolism)的基因個數為333個；參與碳水化合物運輸與代謝(carbohydrate transport and metabolism)的基因個數為230個；參與次級代謝物的生物合成、轉運和分解代謝(secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)的基因個數為97個。

圖4 CMT-9差異基因的COG功能分類與富集Fig.4 COG functional classification and enrichment of CMT-9 differential genes

2.3 CMT-9碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes,CAZymes)分析

碳水化合物活性酶主要由5類催化酶和一類非催化模塊組成，催化酶包括糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)、多糖裂解酶(polysaccharidelyases, PLs)、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases, CEs)、糖基轉移酶(glycosyltransferases, GTs)以及輔助氧化還原酶(auxiliary activities, AAs)，非催化模塊即碳水化合物結合模塊(carbohydrate-binding modules, CBMs)[20]。由圖5可得，菌株CMT-9中含有138個碳水化合物活性酶，其中尤以GH最多，數量為46個，所占比例為33.33%；其次是GT，數量為36，所占比例為26.09%，CBM、CE、AA、PL的數量分別為31、17、5、3，所占比例分別為22.46%、12.32%、3.62%、2.17%。

圖5 CMT-9碳水化合物活性酶(CAZymes)的分布情況Fig.5 Distribution of CMT-9 CAZymes

2.4 基因組組分分析

由表1可知，CMT-9的基因組大小為3 928 149 bp，G+C含量為46.39%，蛋白質編碼序列長度為4 080，tRNA的數量為83，rRNA的數量為9。CMT-9的基因組大小、G+C含量與CMT-6、FZB42和DSM7T的相似度較高；蛋白質編碼序列長度與CMT-6相似度較高；tRNA的數量與CMT-6、FZB42和168的相似度較高。因此，CMT-9與4株菌株的基因組組分的相似度從高到低依次為CMT-6、FZB42、DSM7T、168。

表1 基因組組分比較Table 1 Genome component comparison

2.5 共線性分析

2個物種之間的共線性關系可以作為衡量物種之間進化距離的尺度，進而判斷其親緣關系[21]。由圖6可知，CMT-9與CMT-6、FZB42均表現出高度的共線性；與DSM7T的共線性較差，在1～1.75 Mb片段出現較明顯的缺失和易位；與168的共線性最差，存在顯著的插入、易位、倒位和等基因重排現象，在1.3～1.4、1.85～1.95和2.65～2.8 Mb片段最為明顯。

a-CMT-6；b-FZB42;c-DSM7T；d-168圖6 全基因組二維共線性比較Fig.6 Two-dimensional collinearity comparison of genomes

2.6 同源性分析

將CMT-9的Reads比對到4株芽孢桿菌的基因組序列上，其中與CMT-6的覆蓋率最高，覆蓋區域總長度為3 724 736 bp，占CMT-6基因組的94.81%；其次是FZB42，覆蓋區域總長度為3 918 589 bp，占FZB42基因組的90.68%；而CMT-9與DSM7T、168的覆蓋率較低，覆蓋區域總長度分別為2 036 571、104 859 bp，各占其基因組的51.17%和2.49%(表2)。

表2 測序長度和覆蓋度比較Table 2 Comparison of sequencing length and coincidence

同時，將菌株CMT-9與CMT-6、168、DSM7T、FZB42基因組的蛋白序列進行比較，構建基因組間的Core-Pan基因集。將5株菌株的基因進行同源性分析，5株菌株的共有基因為2 675個，CMT-9與CMT-6的共有基因數量最多(3 545個)，與FZB42、DSM7T、168的共有基因數量分別為3 166、3 090、2 882(圖7)。

圖7 基因組的Core-Pan基因數目維恩圖Fig.7 Venn diagram of the number of Core-Pan genes in the genome

3 結論

本研究采用LC-MS/MS方法檢測菌株CMT-9的發酵產物組分，發現其質荷比與張寧等[22]的研究中的surfactin和iturin相一致，說明CMT-9可以發酵產生抗菌脂肽。同時還檢測到一個質荷比為1 432的組分，該值在fengycin質荷比(1 431～1 492)范圍內，因此推測其可能為fengycin[23]，但具體結構仍需進一步的探索和驗證。

全基因組測序技術可從基因層面挖掘活性菌株次級代謝產物的合成潛力。本研究對菌株CMT-9進行全基因組測序和通路分析，發現其差異表達基因主要富集在碳水化合物代謝、氨基酸代謝通路。碳水化合物代謝過程中產生的丙酮酸會影響乙酰CoA的合成，乙酰CoA可進一步合成脂肪酸[24-25]。因此，這2條通路可為脂肽的合成提供脂肪酸和氨基酸等重要前體物質，前體物質的含量是菌株高效合成脂肽的關鍵。WU等[26]研究發現添加復合氨基酸可顯著提高解淀粉芽胞桿菌Ba-BPD1的iturin產量。LU等[27]研究碳水化合物對解淀粉芽胞桿菌合成抗菌脂肽的影響，發現果糖通過提升氨基酸的濃度，進而增加抗菌脂肽相關合成酶基因的表達，最終提高抗菌脂肽的產量。因此，脂肽前體物質合成通路中基因的數量和表達水平與脂肽產量呈正相關性。

前期研究發現，菌株CMT-6具備合成surfactin、iturin和fengycin 3大類脂肽的合成酶基因，且數量較多，可合成高水平的抗菌脂肽[15]。根據已公布的CMT-6菌株的全基因組序列，通過比較基因組學發現CMT-9與CMT-6菌株的基因組大小、G+C含量、蛋白質編碼序列和tRNA數量均表現高度的一致性。此外，在共線性分析中，發現菌株CMT-9與CMT-6具有高度共線性，與FZB42、DSM7T和168相比存在不同程度的差異，甚至出現線性缺失現象。同源性分析中CMT-9與CMT-6菌株的同源性較FZB42、DSM7T、168最高，達到94.81%。因此，芽孢桿菌基因組組分、共線性和同源性決定了其脂肽譜的相似度。

本研究采用LC-MS/MS技術發現CMT-9的發酵液中含有surfactin、iturin和fengycin 3種脂肽組分，進一步的全基因組測序和比較基因組學分析發現，前體物質合成基因數量與脂肽產量密切相關，基因組組分、共線性和同源性的差異是脂肽譜多樣化的重要原因。研究結果為脂肽產生菌的篩選及脂肽定向合成工程菌株的改造提供理論依據。