餐廚垃圾發酵產乳酸菌種的篩選、鑒定及應用

余培斌，吳殿輝，蔡國林，陸健

1(糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

餐廚垃圾是城市生活垃圾的重要組成部分，是指家庭、學校、機關、公共食堂以及餐飲行業的食物廢料、餐飲剩余物、食品加工廢料等各類混合物[1]。隨著人民生活水平日益提高，餐廚垃圾數量也在不斷增加，一般可以達到生活垃圾總量的30%～50%，每年還在以8%～10%的速度增長[2]。如何簡單高效地處理餐廚垃圾，實現餐廚垃圾的減量化、資源化和無害化已經成為目前需要迫切解決的難題[3]。從化學組成上看，餐廚垃圾主要為淀粉、纖維素、蛋白質、脂肪和少量無機鹽等幾大常見類別[4]。餐廚垃圾憑借高有機物、高含水率、營養豐富等特點，成為寶貴的可再生資源，蘊含著較大的回收和再利用價值[5-7]。微生物處理技術由于其具有高效環保的優勢，在餐廚垃圾資源化利用方面越來越受到人們的重視[8-10]。

乳酸作為一種重要的有機酸，廣泛應用于食品、化工等領域，聚乳酸類可生物降解塑料的開發使包裝材料的白色污染問題得到減輕[11]。目前，乳酸的工業生產方法主要有化學合成法和微生物發酵法[12]?；瘜W合成法生產成本高、環境污染嚴重且較難合成單一構型的乳酸，微生物發酵法生產乳酸不僅可以克服上述弊端，還具有發酵條件溫和、過程清潔、效率高等優點[13]。因此微生物發酵產乳酸的研究越來越受到關注[14]。其中，利用充足且低成本的發酵原料(如餐廚垃圾等有機廢棄物)厭氧發酵產乳酸既能獲得品質較高的乳酸，又可以在實現有機廢物自身減量的同時達到變廢為寶的目的，因此逐漸成為餐廚垃圾資源化利用研究中的一個重要方向[15-17]。

本研究從自然發酵完全腐熟的餐廚垃圾有機肥料中，篩選出適合餐廚垃圾發酵產乳酸的土著乳酸菌，并對其進行菌種鑒定和耐受性研究，豐富餐廚垃圾乳酸發酵理論，以期為餐廚垃圾回收再利用提供更多的信息，為篩選適合國內餐廚垃圾發酵乳酸的菌劑提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品

樣品來源：取自江南大學食堂，經過預處理的餐廚垃圾分別堆放于不同土壤環境中至完全腐熟，采集樣品于4 ℃冰箱保存備用。

枯草芽孢桿菌YB1，本實驗室篩選保藏菌種；大腸桿菌，本實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑

K2HPO4、乙酸鈉、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、檸檬酸氫二銨、葡萄糖、吐溫-80、NaOH、溴甲酚紫、牛肉浸膏、酵母膏、KH2PO4,均為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；NaCl工作基準試劑，優級純，天津市化學試劑三廠；瓊脂粉、蛋白胨，均為化學純，阿拉丁試劑廠。

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 7.4～7.6。

MRS液體培養基(g/L)：K2HPO410.0，乙酸鈉5.0，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.25，檸檬酸氫二銨2.0，葡萄糖5.0，蛋白胨10.0，吐溫-80 1.0，牛肉膏10.0，酵母膏5.0，pH 6.4。

MRS固體培養基：在MRS液體培養基中加2%瓊脂，1.6%溴甲酚紫1.5 mL。

餐廚垃圾發酵培養基：餐廚垃圾經過分揀后打碎成泥狀，取濕基200 g，水500 mL，混合均勻，加入輔料麩皮，調節C/N比25∶1～30∶1，同時加入1%(質量分數)CaCO3，不滅菌。

1.1.4 主要儀器

電熱恒溫鼓風干燥箱、DFP-9082型電熱恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；全鋼通風柜，無錫市普瑞達實驗裝備有限公司；FE20型pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；W201-D恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司；UVmini-1240紫外分光光度計，日本島津有限公司；XSP-8C生物顯微鏡，上海精密儀器儀表有限公司；TC-5000PCR 儀，英國Techne公司；Pico 17型離心機，Thermo Scientific公司；雙人凈化工作臺，蘇州凈化集團安泰公司；高壓蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；精度磅秤，上海耀華稱重系統有限公司；超聲波破碎儀，美國Sonics公司；漩渦振蕩儀，Sigma公司；M-100型生物傳感器分析儀，深圳市西爾曼科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的初篩與分離純化

菌種富集：稱取堆肥樣品20 g，加入已滅菌的裝有適量玻璃珠的MRS液體培養基(250 mL三角瓶，180 mL培養液)，37 ℃搖床培養24 h以上。

菌種初篩：取富集培養的菌液0.1 mL加入到已滅菌的裝有0.9 mL無菌水的試管中，漩渦混勻，依次梯度稀釋得10-1～10-6的菌液。取10-4、10-5、10-63個梯度各0.2 mL稀釋菌液涂布于MRS固體培養基上，共做3個平行，37 ℃真空培養箱中培養48 h以上觀察。

菌種分離純化：挑選能夠在MRS培養基上生長，并使培養基由紫色變為黃色的單菌落，對菌落進行編號，然后接種到新鮮MRS培養基上劃線培養。反復進行同樣的操作2～3次，直至分離出的單菌落形態穩定一致。

菌種保藏：將獲得的單菌落轉接于MRS斜面培養基上，待菌落在斜面生長良好后將其置于4 ℃冰箱保藏。同時轉接2組，一組用于后續實驗的開展。

1.2.2 菌株形態學觀察及生理生化鑒定

平板菌落觀察：將分離的菌種分別接種到MRS固體培養基平板上，37 ℃厭氧培養48 h后觀察菌落的大小、顏色、形態等特征。

顯微形態觀察：依據革蘭氏染色原理，顯微觀察菌體染色情況及菌體形態。將通過實驗獲取的革蘭氏陽性菌(G+)暫定為乳酸菌并進一步實驗研究。

1.2.3 菌株的生理生化鑒定

參照文獻[18-20]考察疑似乳酸菌菌株的生理生化特征。通過過氧化氫酶實驗、運動性實驗、明膠液化實驗、H2S產生實驗、糖發酵實驗等，對菌種進行進一步鑒定。

1.2.4 菌種耐受性試驗

取活化后菌種懸液按5%(體積分數，下同)接種量接種于NaCl質量分數4%～9%及pH 3～8的MRS液體培養基中，在37 ℃厭氧條件下培養24 h后取樣。在波長600 nm處測定培養液的OD值，不接菌的培養液OD值為空白對照，比較觀察菌種生長狀況判斷菌種對鹽度和酸堿度耐受性。取活化菌懸液按照5%接種于MRS液體培養基中，分別置于不同溫度(35～60 ℃)真空培養箱內培養24 h后取樣。同樣通過比較600 nm處培養液OD值判斷菌種對溫度的耐受性。

1.2.5 分子生物學鑒定

采用細菌16S rDNA提取與擴增專用試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。擴增引物為細菌通用引物，正向引物5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’，反向引物5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’。PCR反應體系為50 μL反應體系：4 μL裂解上清液，25 μL PCR Premix Taq，正向引物與反向引物各0.5 μL，20 μL超純水。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min，(94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min)×30個循環，72 ℃終延伸5 min。擴增產物送樣至上海生工生物工程有限公司測序。

獲得序列經NCBI網站BLAST并利用DNAMAN 4.0、MEGA 5.1軟件進行多重序列比較后構建系統發育樹，Bootstrap值設定為1 000。

1.2.6 乳酸含量測定

采用酶電極法，利用生物傳感分析儀M-100測定。

1.2.7 菌種抑菌性試驗

采用管碟法測定篩選菌種對枯草芽孢桿菌YB1和大腸桿菌的抑菌性。將篩選菌株接種于10 mL MRS培養液中，37 ℃厭氧培養24 h待用。將指示菌接種至LB液體培養基中37 ℃振蕩培養24 h，取100 μL稀釋100倍的培養液涂布于LB固體培養基平板，在超凈臺上將滅好菌的牛津杯按在已涂布指示菌的平板上，向各牛津杯中分別注入100 μL篩選菌株培養液，觀察牛津杯周圍抑菌圈情況。

1.2.8 餐廚垃圾發酵產乳酸試驗

取200 mL的餐廚垃圾發酵培養基置于250 mL錐形瓶中，先接入枯草芽孢桿菌YB1，后接入篩選得到的乳酸菌混合菌劑，接種量均為5%，于45 ℃恒溫培養，每隔6 h測定乳酸的含量。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離和篩選

從不同環境中腐熟的餐廚垃圾有機肥中取得堆肥樣品共計15份。經過MRS培養基平板劃線，共獲得34株能在MRS平板上生長，使培養基變成黃色并產生形態各異的菌株。

通過菌落形態和細胞形態觀察，排除相似及疑似菌株后共獲得6株形態各異的菌株，分別編號為B1、M2、M3、M4、M5和M6。將這6株菌在MRS培養基平板上進行三區劃線，待長出單菌落后，觀察菌落形態，如圖1所示。

a-B1;b-M2;c-M3;d-M4;e-M5;f-M6圖1 篩選菌株的菌落形態Fig.1 Colony morphology of the screened strains

將篩選到的6株菌株進行革蘭氏染色后，在光學顯微鏡(10×100)油鏡下觀察細胞形態特征及染色情況，菌株顯微形態見圖2。

由圖2可知，6株菌均為革蘭氏陽性菌，能在MRS培養基上生長并使培養基變色。M2和M4為球形或近似球形，B1、M3和M5為短桿狀，M6為長桿狀。經過與乳酸菌常見形態比對發現6株菌符合其基本屬性，初步確定為疑似乳酸菌并作進一步實驗研究。

a-B1;b-M2;c-M3;d-M4;e-M5;f-M6圖2 篩選菌株的顯微形態Fig.2 Microscopic morphology of the screened strains

2.2 菌株的生理生化特征

對6株疑似乳酸菌進行接觸酶實驗、運動性實驗、明膠液化實驗等，各菌株生理生化實驗結果見表1。

表1 篩選菌株生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the screened strains

將表中結果與《乳酸細菌分離鑒定及試驗方法》[21]和《伯杰氏手冊》對照，確定篩選所得6株疑似乳酸菌均符合乳酸菌生理生化特征，具備分子鑒定前提條件，初步將其劃分列入乳酸菌。

2.3 菌株的耐受性

餐廚垃圾在自然發酵過程中，培養基中心溫度能較長時間保持在50 ℃以上，在這種溫度環境中一般的微生物很難生長。同時發酵過程中，隨著微生物的不斷作用，培養基中酸堿度變化加大，會影響菌種的活性。其次餐廚垃圾的高含鹽率也是我國餐廚垃圾區別于其他國家的主要特征。已有研究表明，中國不同地區的不同飲食習慣導致餐廚垃圾中含鹽率有很大的差異[22]。鹽對微生物具有Na+毒性，未經馴化的微生物在Na+質量濃度為500～2 000 mg/L時即受輕度抑制[23]。且對于一般微生物而言，高鹽度會直接抑制其厭氧發酵過程，從而影響有機酸的生成[24]。因此篩選具有高溫耐受性、酸堿耐受性和高鹽耐受性的微生物十分重要。

2.3.1 溫度耐受性

將6株乳酸菌分別接種于MRS液體培養基中，置于不同溫度下厭氧培養24 h，紫外分光光度計測量600 nm處吸光值。各菌株及空白對照吸光值如圖3所示。

圖3 不同溫度下乳酸菌生長情況Fig.3 Growth of lactic acid bacteria at different temperatures

由圖3可知，6株乳酸菌在35～50 ℃下生長旺盛，對溫度有良好的適應性。溫度≥55 ℃時生長能力明顯減弱，其中M4、M5和M6在45 ℃均表現出最強的生長能力。一定范圍內，菌株的生長能力隨溫度的升高而變強，達到最適生長溫度后生長能力隨著溫度的升高而降低。一般情況下乳酸菌的最適生長溫度為30～35 ℃，本實驗中乳酸菌M4、M5和M6生長情況不適用于此規律。推測原因可能是本實驗獲得的乳酸菌菌株均篩選于餐廚垃圾堆肥后的有機肥樣品，餐廚垃圾在堆肥過程中，肥堆中心溫度長期穩定在40～50 ℃。本實驗中乳酸菌經高溫環境長期馴化，對高溫的適應能力增強。

2.3.2 鹽度耐受性

將6株乳酸菌分別接種到不同鹽度(NaCl質量分數4%～9%)的MRS液體中，37 ℃厭氧培養24 h，紫外分光光度計測量600 nm處吸光值。各菌株及空白對照吸光值如圖4所示。

圖4 不同鹽度下乳酸菌生長情況Fig.4 Growth of lactic acid bacteria at different salt concentrations

篩選得到的6株菌對培養基中的NaCl均有一定耐受性，NaCl質量分數<7%時各菌株均有一定生長表現?？傮w而言，篩選得到的6株菌生長情況隨著鹽濃度的增大而不斷減弱，特別是NaCl質量分數>7%以后，菌株生長嚴重受限。菌株之間相互比較發現：B1、M2和M3對鹽度的耐受性總體較差，M4、M5和M6總體耐受性較強。當超過7%時，M4、M5和M6還能表現出一定的生長能力。

2.3.3 酸堿度耐受性

將6株乳酸菌分別接種到不同pH的MRS液體培養基中，37 ℃厭氧培養24 h，紫外分光光度計測量600 nm處吸光值。各菌株及空白對照吸光值如圖5所示。

圖5 不同酸堿度下乳酸菌生長情況Fig.5 Growth of lactic acid bacteria at different pH levels

由圖5可知，pH的變化對乳酸菌的生長影響較大。6株乳酸菌pH在3～8范圍內都能生長，在pH為4～5時生長能力最強。此后生長能力隨pH的增加而呈現緩慢下降趨勢，其中B1和M2下降明顯，當pH值增加至8時，其生長受到極大限制。M4下降較為平穩，M3、M5和M6則均勻緩慢下降，這4株菌在堿性條件下依然能夠生長。且M4和M6在pH為8時生長情況也表現較好。綜上所述，本次篩選的菌株不僅能在偏堿性條件下生長，且具有較好的耐酸性能，實際生產中具有一定的實用性。

2.4 分子生物學鑒定

綜合考慮各菌株的溫度耐受性、酸堿耐受性及含鹽量耐受性，取M4、M5和M6作為潛力菌株，用于后續餐廚垃圾發酵產乳酸試驗，使用試劑盒擴增3株菌的16S rDNA序列片段，并送上海生工公司測序，將各菌株的堿基序列輸入NCBI，應用BLAST程序，將所得序列與數據庫中存在的細菌16S rDNA序列進行相似性比對，取其與結果顯示相似度最近的菌，結果統計見表2。

由表2可知，3株菌的序列比對相似性都達到了99%，綜合生理生化實驗結果，可以確定M4、M5和M6為乳酸菌。其中，M4為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)，M5為干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)，M6為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

2.5 篩選乳酸菌株的抑菌性

實驗以枯草芽孢桿菌YB1和大腸桿菌為指示菌進行抑菌實驗?？莶菅挎邨U菌YB1為本實驗室從餐廚垃圾自然堆肥后完全腐熟的有機肥樣品中篩選得到，具有耐鹽、耐高溫特性，并且產淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶能力較強，具體特征見文獻[25]。在平板上，其中3個牛津杯內分別添加篩選得到的乳酸菌株M4、M5和M6，另一個為添加相應抗生素的對照組，實驗結果如圖6所示。

a-枯草芽孢桿菌YB1；b-大腸桿菌圖6 篩選乳酸菌對指示菌的抑菌效果Fig.6 Screening of lactic acid bacteria for bacterial inhibition against indicator bacteria注：KAN-卡那霉素；AMP-氨芐西林

乳酸菌株M4、M5和M6對大腸桿菌具有一定的抑菌性，而對枯草芽孢桿菌YB1沒有抑菌性，可與枯草芽孢桿菌YB1相互混合制備混合菌劑，用于后續餐廚垃圾發酵產乳酸研究。

2.6 復合菌劑發酵餐廚垃圾產乳酸

枯草芽孢桿菌菌種制備：將枯草芽孢桿菌YB1接種至LB液體培養基(含NaCl 6%)，45 ℃培養48 h的培養液作為接種菌種。

乳酸菌復合菌劑的制備：將篩選獲得的M4、M5和M6這3株潛力菌株在MRS液體培養基中培養(含NaCl 6%)，45 ℃培養48 h的培養液按體積比1∶1∶1混合制作組合菌劑。

在接種枯草芽孢桿菌后，實驗組接種5%乳酸菌混合菌劑，對照組1(空白對照)接種5%滅菌LB培養基空白液，對照組2接種5% MRS液體培養基空白液。實驗結果如圖7所示。

圖7 不同實驗條件下乳酸濃度隨發酵時間變化Fig.7 Variation of lactic acid concentration with fermentation time under different experimental conditions

由圖7可知，發酵開始后6 h，實驗組及2組對照組發酵液中乳酸含量均緩慢上升，3組乳酸含量差別不大。發酵6 h向實驗組接種乳酸菌復合菌劑后，發酵液乳酸含量急劇上升；發酵至48 h時，實驗組發酵液中乳酸含量達到最高值(20.5±0.6) g/L；隨著發酵時間的延長，實驗組發酵液中乳酸含量穩定在最高值附近，略有降低。對照組1中雖然沒有外加產酶的芽孢桿菌及后續乳酸菌，但是餐廚垃圾利用自身的土著菌群也產生了一些乳酸；由于沒有外接菌種，對照組1中乳酸含量上升緩慢，發酵至72 h時，才達到最高值，僅為實驗組在48 h時產乳酸量的61.1%。對照組2中雖然接種了芽孢桿菌，由于沒有接種乳酸菌劑，發酵液中乳酸生成情況與對照組1較接近，但總體含量略微高了一些。對照組2發酵至60 h時，乳酸含量即達到最高值?？傮w而言，餐廚垃圾發酵產乳酸過程中，接種枯草芽孢桿菌和乳酸菌復合菌劑均能影響乳酸產量，且縮短乳酸含量達到最高值的發酵時間。篩選獲得的乳酸菌種用于餐廚垃圾發酵產乳酸具有較大潛力。

3 結論

本研究從餐廚垃圾有機肥樣品中進行乳酸菌菌種篩選，通過MRS固體培養基平板分離純化、菌落形態和細胞形態觀察，共獲得6株形態各異的菌株，分別編號為B1、M2、M3、M4、M5和M6。經生理生化鑒定，所有菌株均為革蘭氏陽性菌，且均符合乳酸菌生理生化特征。

耐受性實驗結果表明，6株菌均具有一定的溫度、鹽度和酸堿度耐受性，但菌株M4、M5和M6的耐受性較高。綜合考慮各菌株的耐受性，確定M4、M5和M6為潛力菌株，用于后續餐廚垃圾發酵產乳酸研究。經過分子生物學鑒定，確定M4、M5和M6分別為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)，干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。抑菌性試驗表明：菌株M4、M5和M6對枯草芽孢桿菌YB1沒有抑菌性，可制備復合菌劑。與枯草芽孢桿菌YB1混合接種用于餐廚垃圾乳酸發酵實驗，結果表明，接種乳酸菌復合菌劑能明顯提高餐廚垃圾發酵產乳酸含量，與空白發酵液相比，能將乳酸產量提高63.6%，同時大大縮短了乳酸達到最高含量時的發酵時間。