核糖體小亞基V4和V9區引物擴增大亞灣真核浮游生物的比較研究

郭雨沛, 黃良民, 鐘瑜, 陳靖夫, 譚燁輝, 陳綿潤, 邱大俊,*

核糖體小亞基V4和V9區引物擴增大亞灣真核浮游生物的比較研究

郭雨沛1,2, 黃良民1,2, 鐘瑜1, 陳靖夫1,2, 譚燁輝1,2, 陳綿潤3, 邱大俊1,2,*

1. 中國科學院南海海洋研究所, 中科院熱帶生物資源與生態重點實驗室, 廣州 510301 2. 中國科學院大學, 北京 101408 3. 國家海洋局南海規劃與環境研究院，廣州 510300

對大亞灣水體的環境DNA分別進行18S rDNA的V4和V9區的引物擴增, 通過高通量測序技術進行測序, 并比較分析二者浮游真核生物基因多樣性和相對豐度。18S rDNA V4區引物擴增共檢測出浮游動物56 綱, 101 目, 浮游植物52 綱, 69 目; 18S rDNA V9區引物擴增共檢測出浮游動物47 綱, 81目, 浮游植物56 綱, 101 目。兩對引物對浮游真核生物擴增都具有較高覆蓋度, 在綱級別上二者的結果相近: 顎足綱(Maxillopoda)是浮游動物優勢類群; 甲藻綱(Dinophyceae)、圓篩藻綱(Coscinodiscophyceae)、小豆藻綱(Mamiellophyceae)是浮游植物優勢類群, 其中甲藻綱多樣性與豐度的結果相近, 而18S rDNA V9區引物擴增得到的圓篩藻綱豐度高于18S rDNA V4區引物。分析結果表明, 18S rDNA V4區引物擴增的浮游動物多樣性比18S rDNA V9區引物高, 而18S rDNA V9區引物擴增的浮游植物多樣性比18S rDNA V4區引物高。同時, 通過高通量測序技術首次確定大亞灣海區大量存在著寄生型甲藻(Syndiniales), 小豆藻目(Mamiellales)。

高通量測序; 真核浮游生物; 基因多樣性; 浮游植物; 浮游動物; 大亞灣

0 前言

真核浮游生物是海洋生態系統的重要組成部分, 具有種類多樣性高, 分布廣等特征[1—2]。浮游植物和浮游動物是真核浮游生物的主要類群。浮游植物是海洋初級生產力的最主要的貢獻者, 為維持生態系統的物質循環和能量傳遞提供了重要的基礎[1]。浮游動物大多為初級消費者, 在物質循環、能量傳遞過程中起著重要的作用[3—4]。

近年來, 高通量測量技術大量應用到海洋真核浮游生物基因多樣性的研究, 通過擴增環境樣品中核糖體小亞基基因進行浮游生物多樣性分析[5—8]?；贗llumina測樣平臺測序長度的限制, 分別選取核糖體小亞基不同的區域擴增測序[9], 其中堿基變異率較高的V4區和V9區應用最廣, 這兩個區域分別有一對引物最常使用[8—10], 但目前已開展不同引物擴增近海海域真核生物的比較研究甚少。目前已報道使用高通量測序研究真核浮游生物基因多樣性的海域主要包括太平洋、大西洋(地中海、紅海)、兩極等諸多海域[8,11,12], 研究大多選取18S rDNA V4區和V9區引物。各海域真核生物呈現多樣性高與高豐度等特征, 其中囊泡蟲類(Alveolata)占比最多, 一般其序列的豐度占真核生物總豐度的25—40%[12—14], 有些研究區域高達50%, 如R. Piredda在地中海海域使用18S rDNA V4區引物研究中發現囊泡蟲類占比高達56%, 其次為不等鞭毛藻類(Stramenopiles)為20%—25%[15]; 而Comeau等人使用18S rDNA V4區引物發現北冰洋附近海域的不等鞭毛藻占比較低, 在某些年份甚至低于5%[16]。常見的海洋囊泡蟲類有頂復門(Apicomplexa)、纖毛蟲(Ciliophora)以及甲藻門(Dinoflagellata)等。其中, 甲藻門占比最高, Wu等在太平洋西北沿岸海域研究顯示其在微微型真核浮游生物中占比可接近60%[17]。Vargas等在Tara全球海洋考察中研究多個海域使用18S rDNA V4區引物和V9區引物發現, 大洋區域的甲藻門豐度占微微型真核浮游生物比例高于近岸海域。甲藻門的群落結構在不同海域分布有所差異, 近岸海域寄生型甲藻約占甲藻綱的一半, 而開闊大洋區域中寄生型甲藻比例有所提高[18]。Lin等人使用18S rDNA V4區引物在研究近岸、大陸架和外海中發現硅藻占比穩定, 約為40%[19]。韓郁燁等使用18S rDNA V4區引物在研究北歐海中發現, 微微型真核浮游生物群落的主要類群為囊泡蟲類(54.61%),主要由甲藻綱(18.42%)和海洋囊泡蟲新類群I(23.01%)組成;后鞭毛類占21.55%,其中真菌在各站中都有較高的相對豐度,為18.86%[20]。李冉等人通過18S rDNA V9區引物研究南海海域發現微型浮游植物主要以硅藻為主, 微微型浮游植物主要以綠藻為主[21]。但兩對引物在近海與海灣中對于浮游動物與浮游植物的擴增結果有何差異的認識還不夠系統深入, 因此有必要對此開展進一步研究。

大亞灣位于南海北部, 毗鄰珠江河口, 受河口低鹽水與外海高鹽水共同影響。水體交換能力較弱, 受自然環境和人類活動的影響, 生態環境復雜多樣, 是我國海洋生物多樣性最高的區域之一[22—23]。大亞灣海域浮游生物使用傳統的分類方法共鑒定出浮游植物8 門156 種[24—25], 浮游動物8 門275 種[26], 物種組成和豐度分布有明顯的季節性和區域性差異: 夏季浮游生物多樣性略高, 灣內多樣性高于灣外[27—28]。目前, 大亞灣基于分子測序技術進行物種多樣性的研究較少。Jiang等人使用rbcL區引物發現大亞灣浮游植物優勢種為硅藻[29]。然而, 大亞灣海區還未系統開展高通量測序技術分析真核浮游生物基因的多樣性及其群落結構及其不同引物的比較研究。

本文進行大亞灣水體環境DNA的18S rDNA V4和V9區引物擴增, 通過高通量測序技術進行測序, 分析大亞灣浮游真核生物的基因多樣性及相對豐度, 并對兩種引物擴增真核浮游生物的結果進行比較分析, 明確大亞灣真核浮游生物群落的組成, 評估兩對引物在擴增海灣區域真核浮游動物與浮游植物的差異性和適用性。本文可為我國海灣與近海浮游真核生物基因多樣性的研究提供方法參考與科學依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2013年4月, 選取大亞灣常規調查站位S1、S9以及S10進行采集水樣(圖1)。使用5 L Niskin瓶采集表層水樣, 水樣通過3 μm濾膜過濾后, 再通過0.2 μm濾膜進行過濾, 分別收集3 μm和0.2 μm濾膜放入不同的1.5 mL離心管, 加入DNA lysis保護液進行常溫保存[29]?；氐綄嶒炇液? 轉入-20 ℃冰箱中保存。

圖1 大亞灣調查站位分布

Figure 1 Distribution of survey stations in Daya Bay

1.2 DNA提取與PCR擴增和測序

裂解緩沖液保存的樣品加入蛋白酶K并置于55 ℃水浴24小時, 使用CTAB法提取DNA, DNA溶液保存在-20 ℃冰箱中[30]。

真核浮游生物的擴增分別選取目前最為常用的18S rDNA V4區和V9區的兩對引物, 分別為V4F和V4R、V9F和V9R[8,16]。以1 μl提取的DNA作為模版, 采用25 μl反應體系(SuperStar Plus PCR MIX, Genestar)進行擴增。PCR退火溫度分別為46 ℃(V4)和48 ℃(V9)。PCR擴增產物進行切膠純化回收, 采用Illumina Novaseq技術測序平臺(PE250)進行測序。

1.3 數據處理與分析

下機數據進行拼接、質控、過濾獲得有效序列。通過降噪(Divisive Amplicon Denoising Algorithm)得到不含擴增與測序錯誤、不含嵌合體的生物學序列, 序列去重(Dereplication, 相當于以100%相似度聚類)獲得單堿基精度的代表序列, 利用ASVs (Amplicon Sequence Variants)的概念將代表序列構建成的OTU(Operational Taxonomic Units)[27]?；贠TU數量通過 Vegan 包計算分析每個樣品的稀釋曲線[28]。分別篩選出每個樣品浮游植物的 OTU 數據, 并與NCBI 數據庫進行比對注釋, 分析每個樣品不同分類水平的OTU豐度與真核生物的群落結構組成(參數閾值: e value-5)。繪制不同分類水平真核生物群落結構組成圖; 當物種數較多時, 選取序列條數大于全部樣品測序總量0.01%的物種進行繪制。

2 結果和分析

大亞灣3 個站位水樣通過18S rDNA V4區引物擴增得到486437 條序列, 單個樣品擴增得到的序列條數為77719—84902 條序列, 共獲得1519 條 OTU(表1)。18S rDNA V9 區引物擴增共得到446614 條序列, 單個樣品擴增得到序列條數為63341—80664, 共獲得1821 條OTU(表1)。18S rDNA V4區和V9區得到的OTU的稀釋曲線均在測序sequence達到5 萬條后逐漸平緩, 覆蓋率達到99%, V4區和V9區引物擴增得到的序列能夠覆蓋并呈現出樣品中真核浮游生物多樣性(圖2)。

2.1 兩種引物擴增結果的比較

兩對引物擴增得到的結果存在著明顯的差異(圖3)。18S rDNA V4區引物擴增出浮游生物6 類, 隸屬于43 門, 94 綱, 184 目(表1)。18S rDNA V9區引物擴增出7 類 , 隸屬于40 門, 85 綱, 171 目(表1)。在本研究中, V4區和V9區引物分別沒有擴增得到古蟲類和變形蟲類(表2)。

18S rDNA V4區引物檢測出浮游動物34 門, 56 綱, 101 目, 其中顎足綱占絕對優勢, 同時檢測到較高豐度的纖毛蟲(圖4e—h)。18S rDNA V9區鑒別出浮游動物31 門, 47 綱, 81 目, 其中顎足綱同樣豐度最高, 但未檢測到纖毛蟲(圖4e-h)。18S rDNA V4區引物擴增檢測出浮游植物9 門, 52 綱, 69 目, V9區鑒別出9 門, 52 綱, 75 目(圖5e-h)。18S rDNA V4區引物擴增結果檢測得到甲藻門主要由寄生型甲藻、溝膝藻目和裸甲藻目組成, 其中寄生型甲藻占比最高; 硅藻門主要由海鏈藻目組成。18S rDNA V9區引物擴增結果檢測得到甲藻門中膝溝藻目豐度最高, 硅藻門主要圓篩藻目組成, 綠藻門中小豆藻目占比最高(圖5e-h)。兩對引物對豐度較小的物種檢測出的結果差距較大。

表1 大亞灣6個樣品的序列與OTUs數量

圖2 樣品稀釋曲線

Figure 2 Rarefaction curve of each sample

注: a. 三個站位小型和微型浮游生物V4區擴增得到OTUs數量Veen圖; b. 三個站位微微型浮游生物V4區擴增得到OTUs數量Venn圖; c. 三個站位小型和微型浮游生物V9區擴增結果得到OTUs數量Veen圖; d. 三個站位微微型浮游生物V9區擴增得到OTUs數量Veen圖。

Figure 3 Venn diagram of OTUs abundance using V4 and V9 primers amplification at three stations samples in Daya Bay

2.2 大亞灣真核浮游生物基因多樣性

6 個樣品共檢測到真核浮游生物49 門, 107 綱, 415 目; 包括后鞭毛生物(Opisthokonta, 包括動物和真菌)、囊泡蟲類、不等鞭毛藻、變形蟲(Amoebozoa)、有孔蟲(Rhizaria)、古蟲(原Excata, 現Discoba)、綠色植物(Viridiplantae)等(表1)。18S rDNA V4 區引物共檢測到小型和微型浮游生物(≥3 ) 有效序列611 條, 18S rDNA V9區引物共檢測到有效序列1156 條, 鑒定出大亞灣小型和微型浮游生物6 類(沒有檢測到變形蟲)(表2), 40 門, 81 綱, 168 目(表2); 其中占比最高的類群是后鞭毛生物, 其次為囊泡蟲類和不等鞭毛蟲; 優勢門類為節肢動物門(Opisthokonta: Arthropoda), 甲藻門(Alveolata: Dinoflagellata), 硅藻門(Stramenopiles: Bacillariophyta) (表2)。18S rDNA V4區引物共檢測到微微型浮游生物(0.2-3 μm)的有效序列1277 條, 18S rDNA V9 區引物共檢測到有效序列1345 條, 檢測出7 類微微型浮游生物, 49 門, 106 綱, 227 目; 其中占比最高的類別為囊泡蟲類, 其次為不等鞭毛蟲、浮游植物和未定地位的種類。優勢門類依次為甲藻門, 節肢動物門, 綠藻門(Viridiplantae: Chlorophyta)。微微型浮游生物樣品中未分類的OTU占比達到7%(圖4a—d, 圖5a—d)。

表2 大亞灣真核浮游生物大類豐度情況

2.2.1 大亞灣浮游動物基因多樣性

三個站位共檢測到小型和微型浮游動物24 門, 54 綱, 91 目。節肢動物門占絕對優勢, 占比79.1%。其次為脊索動物門(Chordata), 占比6%。優勢類群包括哲水蚤目(Calanoida)、劍水蚤目(Cyclopoida), 這兩目占到全部種類的73%, 簾蛤目(Veneroida)等緊隨其后(圖4)。浮游動物豐度的優勢種占據絕對地位。微微型浮游動物32門, 62綱, 92目。在浮游動物中節肢動物門仍然占優勢, 但相對3 μm樣品而言, 占比下降, 僅為28%。其次為環節動物門(Annelida)和纖毛門(Ciliophora)分別占14%和7%。優勢類群包括葉須蟲目(Phyllodocida)、環節哲水蚤目(Calanoida)、劍水蚤目(Cyclopoida), 這三目占比均勻, 占全部種類的45%, 與浮游植物類似, 一些無法準確鑒定的種類占到全部浮游動物的15%。

2.2.2 大亞灣浮游植物基因多樣性

大亞灣小型和微型浮游植物10門, 23綱, 67目。甲藻門、硅藻門在浮游植物中占絕對優勢, 甲藻門占比63%, 硅藻門30%。優勢類群包括溝膝藻目(Gonyaulacales)、裸甲藻目(Gymnodiniales)、海鏈藻目(Thalassiosirales), 這三目占到全部種類的50%, 多甲藻目(Peridiniales)和硅藻目(Bacillariales)緊隨其后, 相對豐度占比超過1%的均是甲藻門和硅藻門中的類別(圖5)。

大亞灣微微型浮游植物9門, 27綱, 91目。甲藻門、綠藻門在浮游植物中占絕對優勢, 甲藻門占比60%, 硅藻門17%, 其次為隱藻門(Cryptophyta)和硅藻門。優勢類群包括寄生性甲藻目(Syndiniales)與小豆藻目(Mamiellales)這兩目占到全部種類的43%, 另外, 未確定分類地位的類群中甲藻綱和綠藻綱占比也較高, 占浮游植物總序列的26%。

3 討論

3.1 高通量測序測定真核浮游生物多樣性的優缺點分析

基于Illumima MiSeq二代高通量測序平臺的高通量測序技術, 較低的費用就能獲得幾十萬到幾百萬條DNA分子序列, 檢測出樣品中不同的物種類群以及基因豐度比值[33,34]。本研究采用兩組引物對大亞灣樣品進行高通量測序分析, 鑒定樣品的物種多樣性。2013年4月大亞灣海域浮游植物中甲藻綱占比最高, 其次為圓篩藻綱或小豆藻綱, 浮游動物中則是顎足綱占比最高。高通量測序的結果與傳統鏡檢對大亞灣調查結果不同, 大亞灣海區傳統調查鏡檢發現在不同的季節, 各物種豐度有所變化, 但浮游植物最高豐度的類群都是硅藻門的圓篩藻綱, 其中以骨條藻占絕對優勢, 其次為甲藻綱, 其中原甲藻目占比最高[35—38]。而浮游動物則以軟體動物為主, 其次為節肢動物類。環境樣品高通量測序得到真核浮游生物的相對豐度和物種多樣性與常規鏡檢調查結果有所差異是正?，F象[18]?；蚨鄻有耘c形態多樣性是兩個不同的比較層級。即使是單個細胞中, 核糖體基因也可能存在多個拷貝, 不同種群生物之間的基因拷貝數差異很大。在一些物種中這種基因拷貝數差異可以高達3 個數量級, 因此基因擴增表達出的結果與不同物種的細胞豐度存在巨大差異[39,40]。同時這種多拷貝與生物體大小并無關系, 一些單細胞的甲藻和纖毛蟲生物也被證實包含多個核糖體基因拷貝[41—42]。綠藻綱在高通量測序結果中占比比鏡檢數據高, 而傳統鏡檢僅統計細胞較大綠藻的種類[35—38], 其原因是傳統鏡檢方法很難對小體積高豐度的綠藻進行鑒定與計數。調查中微微型樣品中綠藻的豐度遠遠高于微型樣品, 這些小體積的綠藻無法通過鏡檢鑒定。研究中發現高通量測序得到的基因多樣性高于常規鏡檢得到的物種數量, 常規鏡檢中很少觀測到Chromerida、Mediophyceae等種類。高通量測序需要的采樣體積需求量更少, 覆蓋面更廣, 獲取的研究結果更為全面。其次, 由于物種基因多拷貝以及基因突變的存在, 目標基因片段存在多態性, 這也會造成基因多樣性高估。以硅藻為例, 單個細胞的多態性可以達到0.5%—2%, 這種多態性也會高估其多樣性[9,43]。V4區和V9區基因擴增均檢測到樣品中有大量的未命名序列, 這說明大亞灣存在許多小粒徑的未鑒定藻類。浮游動物以及游泳動物遷移過程中, 停留在水體中的糞便與脫落的體表碎片同樣會被高通量測序的檢測到, 相對于傳統的鑒定方法, 其更加靈敏。

注: 小型和微型浮游動物分別在門(a)、綱(e)、目(i)級別群落OTUs豐度圖; 小型和微型浮游動物分別在門(b)、綱(f)、目(j)級別群落組成相對豐度圖; 微微型浮游動物分別在門(c)、綱(g)、目(k)級別群落OTUs組成圖; 微微型浮游動物分別在門(d)、綱(h)、目(i)級別群落組成相對豐度圖。

Figure 4 Compared V4 and V9 marker absolute abundance and relative abundance of zooplankton at different taxonomic levels of three stations in Daya bay

注: 兩種引物得到小型和微型浮游植物分別在門(a)、綱(e)、目(i)級別群落組成圖; 兩種引物得到小型和微型浮游植物分別在門(b)、綱(f)、目(j)級別群落組成相對豐度圖; 兩種引物得到微微型浮游植物分別在門(c)、綱(g)、目(k)級別群落組成圖; 兩種引物得到微微型浮游植物分別在門(d)、綱(h)、目(i)級別群落組成相對豐度圖。

Figure 5 Compared V4 and V9 marker absolute abundance and relative abundance of phytoplankton at different taxonomic levels of three stations in Daya bay

大亞灣樣品18S rDNA V4區與V9區引物擴增結果顯示, 微型樣品中浮游植物以甲藻、硅藻為主, 微微型樣品以寄生性甲藻為主。北歐海區使用18S rDNA V4區引物研究微微型浮游植物中也發現寄生性甲藻為優勢類群[20]。與rbcL引物主要針對自養藻類進行擴增[29], 而18S rDNA V4區和V9區引物能夠擴增出異養的生物, 包括寄生性甲藻。

3.2 V4區引物與V9區引物擴增結果的比較

18S 區域變異相對保守, 是常見的真核浮游生物的目標區域[44], 目前使用較多的是18S rDNA V1—3, V4和V9區引物, V1—3(500bp左右)區域引物的目標條帶相對保守, 只能鑒定到綱或門水平[43]。過去18S rDNA V4區和V9區引物的擴增的結果較少進行直接的對比分析。長片段序列在鑒定中結果更準確, 短片段序列在目以下的級別分類中, 不同的種屬的序列特征常相同, 無法明確其在種屬水平上的分類地位[18]。實驗中18S rDNA V4區目標片段450bp, 用來比對的長度約為380bp, 而18S rDNA V9區引物目標片段250bp, 用來比對的長度約為170bp, 18S rDNA V9區引物由于擴增片段長度問題, 在較低級別上難以區分。本研究中使用的兩對引物在鑒定物種的結果顯示18S rDNA V9區比V4區引物分辨力更弱。

通過研究發現, 兩對引物在浮游植物和浮游動物鑒定能力上有所區別, 18S rDNA V4引物擴增結果對浮游動物的覆蓋度高于18S rDNA V9引物, 而18S rDNA V9區引物擴增結果能夠更全面地覆蓋浮游植物, 兩對引物關于浮游植物鑒定的差距遠低于浮游動物。張莉等在黃海區域中進行比較研究也發現基于18S r DNA V9擴增獲得的浮游植物的多樣性數目較于18S rDNA V4擴增獲得的高[45]。以輪藻門為例, 兩對引物的檢測結果不僅在豐度上差異巨大, 多樣性也難以覆蓋。整體說來, 針對甲藻門和綠藻門浮游植物, 18S rDNA V9區的覆蓋度高于18S rDNA V4區, 而兩對引物對硅藻門以及其他藻類的的鑒定可以相互補充。兩對引物都檢測出大量未命名的甲藻門和綠藻門藻類, 其中18S rDNA V4區引物檢測出的未命名藻類高于18S rDNA V9區引物的結果。18S rDNA V4與18S rDNA V9區變異程度不同, 兩對引物在物種多樣性以及豐度鑒定中存在著一定差異, 因此覆蓋度也所差別[18]。18S rDNA V9區的短片段在低級別鑒定中無法區別序列相似物種導致低級別18S rDNA V9區多樣性有所降低。除目標片段序列變異度的差異外, 18S rDNA V4 區引物三維立體結構更復雜[46], 在擴增以及測序過程中帶來更多的少堿基變異產物, 因此在低分類水平上反而體現出物種多樣性。這種由于結構復雜導致的突變同樣可以解釋18S rDNA V4區引物擴增產物在各物種中都存在比18S rDNA V9區引物更多的未命名物種藻類的現象。本次研究中發現18S rDNA V9區引物擴增出的硅藻類整體豐度較高, 但無法擴增纖毛蟲類的生物。Stock等人指出18S rDNA V4 區引物能夠擴增出一些特定的物種序列, 可能是因為18S rDNA V9 區引物更易擴增出其他物種, 削弱了其對一些物種的擴增[8], 凸顯出18S rDNA V4區引物對一些種類的擴增能力。

4 結論

本次研究確定了18S rDNA V4區和18S rDNA V9區兩對引物都能擴增出大亞灣浮游真核生物絕大多數類群, 但兩對引物存在一定的差異。18S rDNA V4引物擴增結果中浮游動物的多樣性高于18S rDNA V9引物的結果, 而18S rDNA V9區引物的結果浮游植物多樣性高于18S rDNA V4區引物的結果, 同時明確18S rDNA V4區引物擴增序列的分辨率高于18S rDNA V9區引物擴增序列。明確了2013年4月大亞灣浮游真核生物具有很高的多樣性, 共8 門, 22 綱, 51 目。小型和微型浮游真核生物中哲水蚤目種類的豐度最高, 浮游植物以甲藻門為主, 包括裸甲藻目以及膝溝藻目; 微微型浮游生物中浮游動物主要以葉須蟲目為主, 浮游植物中甲藻為為優勢類群, 確定了大量未定名種類的存在。首次確定了大亞灣海區存在著大量寄生性甲藻目與小豆藻目的藻類。

[1] HOPPENRATH M, M ELBR?CHTER, DREBES G. Marine phytoplankton: selected microphytoplankton species from the North Sea around Helgoland and Sylt[M]. Journal of Phycology, 2010, 46.

[2] POMEROY L R. The ocean’s food web, a changing paradigm[J]. BioScience, 1974, 24(9): 499—504.

[3] 李少菁, 許振祖, 黃加祺, 等. 海洋浮游動物學研究[J]. 廈門大學學報(自然科學版), 2001, 40(2): 574—574.

[4] 劉建康. 高級水生生物學[M]. 北京: 科學出版社, 1999.

[5] SIERACKI C K, SIERACKI M E, YENTSCH C S. An imaging-in-flow system for automated analysis of marine microplankton[J]. Marine Ecology Progress Series, 2017, 168(1): 285—296.

[6] MASSANA R, PEDRóS-ALIó C. Unveiling new microbial eukaryotes in the surface ocean[J]. Current Opinion in Microbiology, 2008, 11(3): 213-218.

[7] LAROCHE J, GEIDER R J, GRAZIANO L M, et al. Induction of specific proteins in eukaryotic algae grown under iron-deficient, phosphorus-deficient, or nitrogen- deficient conditions[J]. Journal of Phycology, 2010, 29(6): 767—777.

[8] STOECK T, BASS D, NEBEL M, et al. Multiple marker parallel tag environmental DNA sequencing reveals a highly complex eukaryotic community in marine anoxic water[J]. Molecular Ecology, 2010, 19: 21—31.

[9] HUGERTH L W, MULLER E, HU Y, et al. Systematic design of 18S rRNA gene primers for determining eukaryotic diversity in microbial consortia[J]. PLoS ONE, 2014, 9(4): e95567.

[10] ZHU F, RAMON M, FABRICE N, et al. Mapping of picoeucaryotes in marine ecosystems with quantitative PCR of the 18S rRNA gene[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2010(1): 79—92.

[11] EGAS C, C HENRíQUEZ-CASTILLO, DELHERBE N, et al. Short timescale dynamics of phytoplankton in Fildes Bay, Antarctica[J]. Antarctic Science, 2017: 217—228.

[12] ZHANG Wenjing, PAN Yongbo, YANG Jun, et al. The diversity and biogeography of abundant and rare intertidal marine microeukaryotes explained by environment and dispersal limitation[J]. Environmental Microbiology, 2018, 20(2): 462—476.

[13] LE GALL F, YOGEV T, BERMAN-FRANK I, et al. Diversity of active marine picoeukaryotes in the Eastern Mediterranean Sea unveiled using photosystem-II psbA transcripts[J]. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology, 2010, 4(8): 1044—1052.

[14] PERNICE M C, LOGARES R, GUILLOU L, et al. General Patterns of Diversity in Major Marine Microeukaryote Lineages[J]. PLoS ONE, 2013, 8(2): e57170

[15] PIREDDA R, TOMASINO M P, D’ERCHIA, A. M, et al. Diversity and temporal patterns ofplanktonic protist assemblages at a Mediterranean LTER site[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2016, 93(1), doi:10.1093/femsec/fiw200.

[16] COMEAU ANDRé M, LI W K W, TREMBLAY JEAN-éRIC, et al. Arctic ocean microbial community structure before and after the 2007 record sea ice minimum[J]. PLoS ONE, 2011, 6(11): e27492.

[17] Wu W, Logares R, Huang B, et al. Abundant and rare picoeukaryotic sub-communities present contrasting patterns in the epipelagic waters of marginal seas in the northwestern Pacific3 / 3 Ocean[J]. Environmental Microbiology, 2016, doi:10.1111/1462-2920.13606.

[18] BESCOT N L, PROBERT I, CARMICHAEL M, et al. Eukaryotic plankton diversity in the sunlit ocean[J]. Science, 2015, 348(6237): 1261605.

[19] LIN Yajuan, NICOLAS C, ADRIAN M, et al. Specific eukaryotic plankton are good predictors of net community production in the Western Antarctic Peninsula[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 14845.

[20] 韓郁燁, 郭萃, 段雪萍, 等. 北歐海微微型真核浮游生物的多樣性和群落結構及其與環境因子的關系[J]. 海洋與湖沼, 2019, 50(6): 1263—1270.

[21] 李冉. 熱帶/亞熱帶海區原生生物分子多樣性研究[D]. 廈門: 廈門大學, 2017.

[22] F徐恭昭. 大亞灣環境與資源[M]. 安徽: 安徽科學技術出版社, 1989.

[23] SONG Xingyu, HUANG Liangmin, ZHANG Jianlin, et al. Harmful algal blooms (HABs) in Daya Bay, China: Anstudy of primary production and environmental impacts[J]. Marine Pollution Bulletin, 2009, 58(9): 1310—1318.

[24] YANG Xi, TANG Yehui, LI Kaizhi, et al. Long-term changes in summer phytoplankton communities and their influencing factors in Daya Bay, China (1991–2017)[J]. Marine Pollution Bulletin, 2020(161): 111694

[25] 柯志新, 黃良民, 譚燁輝, 等. 2007年夏季南海北部浮游植物的物種組成及豐度分布[J]. 熱帶海洋學報, 2011(1): 133—145.

[26] 杜飛雁, 王雪輝, 賈曉平, 等. 大亞灣海域浮游動物種類組成和優勢種的季節變化[J]. 水產學報, 2013, 37(8): 1213—1119.

[27] 廖秀麗, 陳丕茂, 馬勝偉, 等. 大亞灣楊梅坑海域投礁前后浮游植物群落結構及其與環境因子的關系[J]. 南方水產科學, 2013, 9(5): 109—119.

[28] 唐森銘, 嚴巖, 陳彬. 春夏季大亞灣核電廠溫排水對海洋浮游植物群落結構的影響[J]. 應用海洋學學報, 2013, 32(3): 373—382.

[29] JIANG Zhaoyu, WANG Youshao, CHENG Hao, et al. Spatial variation of phytoplankton community structure in Daya Bay, China[J]. Ecotoxicology, 2015, 24(7/8): 1450—1458.

[30] QIU Dajun, Huang Liangmin, LIU Sheng, et al. Nuclear, Mitochondrial and plastid gene phylogenies of dinophysis miles (Dinophyceae): evidence of variable types of chloroplasts[J]. PLoS ONE,2011, 6(12): e29398.

[31] BOKULICH N A, SUBRAMANIAN S, FAITH J J, et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing[J]. Nature Methods, 2013, 10(1): 57—59.

[32] CAPORASO J G, LAUBER C L, WALTERS W A, et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms[J]. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology, 2012, 6(8): 1621—1624.

[33] TABERLET P, COISSAC E, POMPANON F, et al. Towards next‐generation biodiversity assessment using DNA metabarcoding[J]. Molecular Ecology, 2012, 21(8): 2045—2050.

[34] VALENTINI A, POMPANON F, TABERLET P. DNA barcoding for ecologists[J]. Trends in Ecology & Evolution, 2009, 24(2): 110—117.

[35] 粟麗, 黃梓榮, 羅艷. 大亞灣夏、冬浮游植物群落結構與環境因子[J]. 海洋科學進展, 2019, 37(2): 284—293.

[36] 姜歆, 柯志新, 向晨暉, 等. 黃良民. 大亞灣夏季和冬季超微型浮游生物的時空分布及環境調控[J]. 生態科學, 2018, 37(2): 1—10.

[37] 姜犁明, 趙明忠, 徐智煥, 等. 2011年秋季和2012年春季大亞灣海域浮游植物的分布及主要影響因素[J]. 海洋學研究, 2013, 31(2): 86—92.

[38] 魏雷. 大亞灣海域浮游植物群落結構調查——以2011—2012年為例[J]. 農業與技術, 2017, 37(16): 243—244.

[39] GONG Jun, DONG Jun, LIU Xihan, et al. Extremely high copy numbers and polymorphisms of the rDNA operon estimated from single cell analysis of oligotrich and peritrich ciliates[J]. Protist, 2013, 164(3): 369—379.

[40] P LóPEZ-GARCíA, F RODRíGUEZ-VALERA, C PEDRóS-ALIó, et al. Unexpected diversity of small eukaryotes in deep-sea Antarctic plankton[J]. Nature, 2001, 409(6820): 603—607.

[41] PAWLOWSKI J, JOSé FAHRNI, BOWSER S S. Phylogenetic analysis and genetic diversity of[J]. Journal of Foraminiferal Research, 2008, 32(2): 173—176.

[42] DIEZ B, PEDROS-ALIO C, MASSANA R. Study of genetic diversity of eukaryotic picoplankton in different oceanic regions by small-subunit rRNA gene cloning and sequencing[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2001, 67(7), doi:10.1023/A:1022289509702.

[43] ALVERSON A, KOLNICK L. Intragenomic nucleotide polymorphism among small subunit (18S) rDNA paralogs in the diatom genus Skeletonema (Bacillariophyta)[J]. Journal of Phycology, 2010, 41(6): 1248—1257.

[44] BIK H M, PORAZINSKA D L, CREER S, et al. Sequencing our way towards understanding global eukaryotic biodiversity[J]. Trends in Ecology & Evolution, 2012, 27(4): 233—243.

[45] 張莉, 張遠, 林佳寧, 等. 基于多個擴增子的DNA metabarcoding技術探究黃海微型真核浮游植物多樣性[J]. 環境科學, 2019, 40(9): 206—214.

[46] WUYTS J. Comparative analysis of more than 3000 sequences reveals the existence of two pseudoknots in area V4 of eukaryotic small subunit ribosomal RNA[J]. Nucleic Acids Research, 2000, 28(23): 4698—708.

Comparison of eukaryotic plankton compositions using 18S rRNA gene V4 and V9 primers amplification in Daya Bay

GUO Yupei1,2, HUANG Liangmin1,2, ZHONG Yu1, CHEN Jingfu1,2, TAN Yehui1,2, CHEN Mianrun3,Qiu Dajun1,2,*

1. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of OceanologyChinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101408, China 3. South China Sea Institute of Planning and Environmental Research, SOA, Guangzhou 510300, China

We compared the genetic diversity and relative abundance of eukaryotic plankton in Daya Bay using two genetic markers(18S rRNA V4 and V9 regions) to amplify the eDNA and high-throughput sequencing technology. 56 classes, 101 orders of zooplankton and 52 classes, 69 orders of phytoplankton were detected using 18S rDNA V4 markers. And 47 classes, 81 orders of zooplankton and 56 classes, 101 orders of phytoplankton were detected using 18S rDNA V9 markers. Both 18S rDNA V4 and V9 regions resultsperformed well to coverage communities and provided similar eukaryotic plankton distribution patterns at class taxonomic level. Maxillopoda is the dominant group of zooplankton, while Dinophyceae, Coscinodiscophyceae and Mamiellophyceae are the dominant groups of phytoplankton. Especially, two genetic markers amplification results present the similar diversity and relative abundance of Dinophyceae at order taxonomic level. The results of 18S rDNA V9region presented higher abundance of Coscinodiscophyceae than that of V4. The results showed that the diversity of zooplankton amplification by 18S rDNA V4 primers was higher than that of 18S rDNA V9 primers, while that of phytoplankton amplification by 18S rDNA V9 primers was higher than that of 18S rDNA V4 primers. In this study, we first report high abundance parasitic Syndiniales and Mamiellales in Daya Bay.

High-throughput sequencing; eukaryotic plankton; gene diversity; phytoplankton; zooplankton; Daya Bay

郭雨沛, 黃良民, 鐘瑜, 等. 核糖體小亞基V4和V9區引物擴增大亞灣真核浮游生物的比較研究[J]. 生態科學, 2023, 42(1): 242–251.

GUO Yupei, HUANG Liangmin, ZHONG Yu, et al. Comparison of eukaryotic plankton compositions using 18S rRNA gene V4 and V9 primers amplification in Daya Bay[J]. Ecological Science, 2023, 42(1): 242–251.

10.14108/j.cnki.1008-8873.2023.01.028

Q178.53;Q7

A

1008-8873(2023)01-242-10

2021-05-01;

2021-07-21

國家自然科學基金(42276165, 41776154); 廣州海洋實驗室2019年度人才團隊引進項目(GML2019ZD0405)

郭雨沛(1995—), 女, 碩士, 從事浮游植物研究, E-mail: guoyp95@scsio.ac.cn

邱大俊, 男, 博士, 研究員, E-mail: djqiu@scsio.ac.cn