神經內分泌腫瘤相關生物指標應用的研究進展

羅海靜 綜述,趙穎海 審校

(廣東醫科大學病理系,廣東 湛江 524023)

神經內分泌腫瘤(NENs)是一類起源于肽能神經元和神經內分泌細胞,具有神經內分泌分化并表達神經內分泌標志物的少見異質性腫瘤。NENs在人體分布極為廣泛,可發生于純內分泌器官(垂體前葉、甲狀旁腺、甲狀腺和腎上腺)、純神經結構(脊柱旁交感神經鏈、副交感神經節)和具有彌漫性神經內分泌細胞系統的全身多器官(如皮膚、上呼吸道、肺、乳腺、消化、泌尿和生殖器官系統)[1-2]。本文針對NENs的流行現狀、最新世界衛生組織(WHO)分類,以及重要的生物標志物等研究熱點進行綜述,旨在為NENs的臨床規范化診療及預后預測提供新進展和新思路。

1 NENs的流行現狀

近40年來全球各地區NENs的發病率呈持續上升趨勢[3]。DASARI 等[4]于2017年發表在JAMA上的一篇開創性文章中指出,NENs的發病率已從1973年的每10萬人中的1.09上升到2012年的每10萬人中的6.98,在近40年內增幅達540%。NENs其中以肺及消化系統NENs最為常見,據SEER數據庫(美國癌癥統計流行病學數據庫,監測、流行病學和最終結果數據庫)顯示,胃腸胰腺部位NENs的發病率高達3.56/10萬人。不少國內外的研究報告指出消化系統NENs在不同器官部位的發生率呈現明顯差異,一項關于中國胃腸胰腺NENs的回顧性流行病學研究[5],基于中國23家單位在2001-2010年的統計發現,消化系統NENs最常見的發病部位是胰腺(31.5%)和直腸(29.6%),其次是胃賁門(11.6%)和胃體(15.4%)。小腸和結腸NENs在所有患者中所占的比例相對較小。

2 NENs的WHO分類現狀

2022年WHO內分泌和NENs分類,以在特定解剖部位的遺傳學證據及臨床、流行病學、組織學和預后方面的差異作為支持,將上皮NENs分為高分化NENs和低分化神經內分泌癌(NECs)[6]。

不同解剖部位的NENs有不同的分類框架。以消化系統和肺為例證,胃腸胰腺NENs基于核分裂象數和(或)Ki-67增殖指數評估的增殖的分級系統嚴格劃分為G1、G2、G3級,而NECs通常擁有更高的有絲分裂數和(或)Ki-67標記指數,并根據腫瘤細胞形態分類為小細胞NECs、大細胞NECs[7]。在肺NENs中,根據有絲分裂數和(或)Ki-67標記指數和(或)是否存在壞死,分化良好的肺NENs進一步被分級為G1和G2(目前定義為“典型類癌”和“非典型類癌”),低分化的肺NECs分為肺小細胞神經內分泌癌(SCNEC)和肺大細胞神經內分泌癌(LCNEC)[6]。

混合神經內分泌-非神經內分泌腫瘤(miNEN)的組織學方面是異質的,并且根據神經內分泌和非神經內分泌成分的各種可能組合而有所不同[8]。神經內分泌成分的分化程度差異比較大,可以高分化,也可以低分化,其中低分化的神經內分泌成分由NEC(SCNEC或LCNEC亞型)表示;非神經內分泌成分的形態特征因部位而異,通常反映在相關原發部位的癌中觀察到的特征,其中腺癌和鱗狀細胞癌是最常見的亞型。

3 應用免疫組織化學指導精準診斷、預測預后、個體化治療方面的作用

由于NEN的高度異質性,且預后依賴于腫瘤等級,NENs的精準診斷變得愈加重要,同時需要更多的生物標志物來改善患者的預后分類和管理。對于病理工作者,可以使用NSE、Syn、CgA、CD56、胰島素瘤相關蛋白1(INSM1)、生長抑素受體(SSTRs)等免疫組織化學檢測來明確神經內分泌分化;p53、視網膜母細胞瘤蛋白1(Rb1)、死亡結構域相關蛋白(DAXX)、α地中海貧血伴智力低下綜合征X連鎖(ATRX)等免疫組織化學檢測對分化良好的NENs-G3或分化差的NECs有重要鑒別意義。此外,結合使用生物標志物和成像方法可以協助診斷、評估治療的適當性和對治療的反應[1]。

近年來,各種靶向藥物不斷涌現,個體化治療也不斷出現,如腫瘤表達SSTR2A,患者應用生長抑素類似物(SSAs)長效奧曲肽或蘭瑞肽可獲益;甲基鳥嘌呤甲基轉移酶(MGMT)的免疫組織化學表達或啟動子甲基化狀態能預測腫瘤對替莫唑胺腫瘤的敏感性。因此,未來納入基因組和表觀遺傳生物標志物的前瞻性研究是有必要的,并具有個體化治療和監測策略的轉化潛力。

3.1INSM1 INSM1是一種常見的鋅指轉錄因子,具有獨特的組織特異性表達模式,其表達僅限于正常的胚胎神經內分泌組織,包括發育中的前腦、后腦、嗅覺上皮、視網膜、小腦、胰腺、胸腺、甲狀腺、腎上腺和胃腸道的內分泌細胞,在正常成人組織和大多數非NENs中不表達。編碼蛋白識別特定的DNA靶序列,并下調與神經內分泌細胞分化相關的多個靶基因的表達,對神經內分泌系統的發育起重要調控作用,在早期胰腺內分泌、交感腎上腺譜系及泛神經源前體發育中起著關鍵作用。此外,INSM1通過激活Shh、PI3K/AKT、MEK/ERK1/2、ADK、p53、cyclin D1、β-catenin、LSD1和N-myc發揮額外的核活性,助長了NENs的發生[9]。

NENs細胞通常對神經內分泌分化標志物具有彌漫性和強烈的免疫反應。INSM1在NENs中高水平再表達,已經作為一種新型的NENs免疫標志物進入研究專家的視野。近年來的研究表明,商品化的抗-INSM1單抗能夠在多種組織起源的NENs中表達,其敏感性和特異性優于現有的神經內分泌標志物[10-11]。在大多數NENs中,特別是在小細胞肺癌(SCLC)中,已證明INSM1比其他神經內分泌標志物更敏感,更具有特異性[12]。因此,INSM1可以作為NENs鑒別診斷中有意義的輔助手段。

由于INSM1嚴格的組織特異性,并在NENs中高表達,其調節區域被認為是靶向治療設計的潛在候選對象[13]。盡管人們普遍認為,在試圖實現有效的腫瘤抑制時,直接靶向轉錄因子相對困難,但最近的研究表明,在INSM1表達的背景下靶向INSM1相關信號通路的新型策略是有效的[14]。此外,將針對NENs的自殺基因或報道基因與INSM1啟動子融合可用于NENs的有效診斷和治療[9]?；趯NSM1作為NENs特異性生物標志物及其下游信號通路的理解,INSM1可能成為未來設計新型癌癥治療策略的一大領域。

近年來,有研究發現肺外神經內分泌癌(EPNEC)具有獨特的神經內分泌譜系特異性轉錄譜,且INSM1的基因表達降低與侵襲性疾病的特征和較短的總生存期相關[15]。低INSM1基因表達在EPNEC中是一種新的潛在不利預后標志物,INSM1在高級別NEC中的潛在預后作用值得在更大的獨立系列中進行驗證。

3.2SSTRs SSTRs屬于G蛋白偶聯受體(GPCR)家族,由5種不同亞型的G蛋白偶聯跨膜受體(SSTR1～5)組成,并作為生長抑素的靶受體發揮生理功能。因此,SSTRs在介導生長抑素的生物學活性和功能方面起關鍵作用。

SSTRs有很多亞型,其中SSTR2已經成為診斷和治療NENs的重要靶點[16-17]。另外,由于SSAs和放射性核素的快速發展,基于SSTRs的生長抑素受體成像和肽受體放射性核素治療(PRRT)改變了NENs的傳統診斷和管理范式。有研究發現,68Ga-DOTATATE-PET/CT可準確診斷肺類癌,但原發部位和轉移灶SSTRs表達程度有差異,提示腫瘤高度的異質性[18]。此外,68Ga-DOTATATE-PET/CT在表達SSTRs的胃腸胰腺NENs患者的定位、分期和管理上有重要作用[19]。

近年來,SSAs已被廣泛用于胃腸胰腺NENs的治療。然而,因為結合的受體結合位點更豐富,SSTR2拮抗劑(如JR11)在診治NENs上被報道為較SSTR2激動劑(如奧曲肽)更有效[20]。肽受體PRRT為代表的腫瘤靶向放射治療也成為NENs治療的新熱點[21]。然而,這些療法的基本要求是腫瘤的SSTRs有足夠高的表達。SSTRs的免疫組織化學可以在組織上常規進行,可以為NENs的常規診斷和預測提供快速且具有成本效益的方法。

據報道,依賴人眼或采用數字圖像分析(DIA)評估SSTR2免疫反應性可以作為預測新型PRRT效果的方法[22]。此外,SSTRs功能成像,例如使用68Ga-DOTATOC-PET/CT圖像掃描,經常在分期和隨訪中發現CT或MRI忽略的額外病變,并提供患者是否適合使用未標記或放射性標記的SSAs進行治療的信息[23]。還有研究表明,18F-FDG和68Ga-DOTATATE雙示蹤顯像可以更好地表征腫瘤的異質性,有助于選擇受益于治療的PRRT候選人,并評估預后[24]?？偠灾?結合使用SSTRs和核醫學可以協助診斷、評估治療的適當性和療效。

3.3ATRX/DAXX DAXX是一種高度特異性的組蛋白伴侶蛋白,選擇性引導組蛋白H3.3沉積在臂間和端粒異染色質上[25]。ATRX是SWI/SNF家族中的染色質重塑三磷酸腺苷酶。這2種腫瘤抑制基因編碼的相關蛋白可以形成復合物,并與組蛋白H3.3結合沉積在特定區域,如端粒和著絲粒,并參與凋亡和染色質重塑,對維持體細胞基因組的完整性和穩定性有重要意義。

依賴于核分裂象數和(或)Ki-67增殖指數評估的WHO分級提供了與NENs分期無關的重要預后信息[8]。然而,有絲分裂指數和Ki-67測定都容易受到采樣問題、解釋錯誤的影響,并且可能不能真實反映這些腫瘤的臨床行為。越來越多的證據表明G3 PanNENs和PanNECs是截然不同的腫瘤,在病因、遺傳學、治療和預后上都有所不同,但在缺乏G1或G2成分的情況下兩者在形態上難以區分[26]。因此,對于這種臨界病例,推薦使用DAXX/ATRX 免疫組織化學法來協助區分和評估。在胰腺NENs中,ATRX、DAXX的缺失通常用于支持G3 PanNENs的診斷;反之則診斷為PanNECs[8]。

ATRX和DAXX相互作用形成染色質重塑復合物,它們的丟失導致端粒延長(ALT)和染色體不穩定(CIN)。最近有研究發現,ALT的存在能夠獨立預測較短的無復發生存期,并與直徑小于或等于2.0 cm無功能PanNENs較低的總生存率相關,而當替代ALT或聯合ALT時,ATRX/DAXX免疫標記的丟失也觀察到類似的結果[27]。與此一致的是,印度的一項分析PanNENs中ATRX/DAXX改變的研究表明,ATRX/DAXX表達缺失是發病機制的晚期事件,與侵襲性表型相關[28]?；贒AXX或ATRX基因改變可以直接通過免疫組織化學檢測到,DAXX和ATRX免疫組織化學分析可以替代ALT狀態評估所需勞動強度更高的熒光原位雜交(FISH)技術,納入到PanNENs的預后評估項目中,特別是對于無功能PanNENs[8]。

3.4Rb/p53 Rb、p53蛋白均屬于腫瘤抑制因子,在細胞轉化和腫瘤抑制中具有重要作用。Rb具有獨特的細胞譜系特異性作用,對調節神經內分泌細胞命運至關重要。p53基因分為野生型和突變型2種,其中野生型p53蛋白極不穩定,并具有反式激活功能和廣譜的腫瘤抑制作用。Rb、p53基因的缺失或突變已被證實是許多腫瘤發生的原因之一,兩者相互調節,對SCLC的發生發展起重要作用[29]。

分化良好的NENs通常沒有TP53和Rb1基因突變,包括具有高增殖率的NENs-G3;因此,腫瘤細胞未檢測到p53蛋白的表達,保留Rb蛋白的表達。相比之下,低分化NENs經常在p53和Rb1基因中出現突變,表現為核Rb表達缺失和p53過表達[7-8]。與DAXX和ATRX免疫標記只適用于胰腺NENs不同,使用p53和Rb蛋白作為低分化NENs的標記對所有位點都是有效的。因此,推薦使用Rb、p53免疫組織化學檢測協助鑒別診斷NENs-G3和NECs[8]。

NENs的最新分類已將NENs-G3定義為與低分化NECs不同的實體[8]。另外,既往很多研究都發現NENs-G3、LCNEC和SCNEC患者對EP(足葉乙苷、順鉑)化療的預后和反應不同,2個Ki-67增殖指數均大于55%但組織學特征不同的腫瘤對鉑基化療的反應存在差異,這些都提示PanNENs-G3患者的治療選擇和分層仍有待完善。

一項日本關于胰腺NENs-G3的多中心、回顧性研究發現,2種不同類別NENs-G3和NECs-G3對鉑類化療(EP)的反應存在顯著差異,且Rb缺失與胰腺NENs-G3患者對鉑類藥物的治療反應相關[30]。另一項關于大細胞NECs分子亞型預測化療結果的回顧性研究進一步明確Rb1突變狀態和Rb1/p16蛋白表達是化療反應的預測標志物,可能有助于指導晚期LCNEC疾病的治療決策[31]。因此,通過下一代測序(NGS)進行的Rb和p53基因突變分析可以在使用的擴展癌癥基因組中進行,Rb和p53的免疫組織化學可以取代昂貴的基因檢測,有效地用于篩選,為病理學家提供有用的診斷提示,并為臨床醫生提供治療指導方向。

3.5MGMT MGMT是一種高效的DNA直接修復酶,能修復DNA序列中的O6-甲基鳥嘌呤損傷,是人類細胞中迄今發現的唯一一種修復該損傷的甲基轉移酶。MGMT對基因組的穩定性至關重要,如果MGMT異常,不能發揮正常的作用或作用不足,將導致DNA中G∶C配對轉換為A∶T配對,就會導致癌基因的激活和抑癌基因失活,進一步發展引起腫瘤。

不可切除的NENs通常對標準治療方法反應不佳。在一些臨床試驗中,替莫唑胺在晚期或轉移性、侵襲性和低分化NENs的治療中獲得了令人鼓舞的結果[25]。2022年版中國抗癌協會NENs診治指南中指出,對Ki-67增殖指數低于55%的G3級NENs患者,推薦替莫唑胺為主的化療方案,而對Ki-67增殖指數大于或等于55%的G3級NENs,可參考NECs的化療方案[1]。由于NENs的高度生物異質性,建立預測替莫唑胺治療反應的生物標志物對于避免不必要的治療至關重要。

替莫唑胺是一種烷化劑,能使DNA鳥嘌呤O6位發生烷基化而產生抗腫瘤活性,從而導致DNA錯配和腫瘤細胞死亡。在膠質母細胞瘤中,對替莫唑胺反應的預測是基于MGMT基因甲基化狀態的評估,因為MGMT高表達會抵消烷化劑的治療效果,從而導致化療耐藥[32]。因此,可以嘗試通過檢測MGMT狀態來評估替莫唑胺的活性和療效。有不少研究發現,甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)可能是一種用于評估MGMT基因甲基化很有前景的技術,進而預測NENs中對替莫唑胺的反應,這需要更多的前瞻性臨床試驗來進行驗證[33]。

一項通過免疫組織化學檢測MGMT和錯配修復系統(MMR)蛋白在一系列PanNENs中的表達實驗研究發現,MGMT低表達PanNENs多見于病理分級高、Ki-67指數高和無功能腫瘤,這提示MGMT的表達降低與胰腺NENs進展的高風險相關;同時,該研究還觀察到,PanNENs低表達MGMT的患者比PanNENs高表達MGMT的患者無復發生存期更短[34]。因此,未來MGMT的表達可能被認為是了解PanNENs生物學行為的一種標記。

4 小 結

目前可用于NENs診斷與鑒別診斷、指導治療及預后評估的生物標志物豐富多樣,包括INSM1、SSTRs、ATRX、DAXX、Rb、p53、MGMT等,不同器官部位NENs的分子表達譜具有重要的臨床研究價值,要將對NENs分子認識的快速進展轉化為診斷、預后或預測標記,仍有許多工作要做。值得注意的是,在不久的將來,隨著分子檢測手段的發展,關鍵分子在組織樣本中的免疫組織化學應用將為NENs診斷中的細胞生物學和治療問題的評估提供有價值且有經濟收益的信息。