制備液相色譜結合液相色譜-氣相色譜聯用技術高靈敏檢測化妝品中的芳烴礦物油

李婷 李冰寧 劉玲玲 楊夢奇 武彥文

（北京市科學技術研究院分析測試研究所（北京市理化分析測試中心），北京 100094）

礦物油來源于石油和合成油，涉及C10～C50范圍的數以萬計不同結構的碳氫化合物，分為烷烴礦物油（Mineral oil saturated hydrocarbons，MOSH）和芳烴礦物油（Mineral oil aromatic hydrocarbons，MOAH）兩類[1]。MOSH 和MOAH 的毒性差異很大，其中，MOSH 的生物轉化率較低，容易蓄積在動物和人體的脂肪組織、淋巴結、脾臟和肝臟中[1-2]。歐洲食品安全局的風險評估報告指出，MOSH 對人類不構成健康風險[3]；而MOAH 特別是三環以上的MOAH 具有潛在的致癌和遺傳毒性，應予以高度重視[3-4]。

礦物油是化妝品的重要原料，廣泛用于各類護膚品特別是口唇護理產品中，可通過皮膚和口腔進入人體造成危害[5]。2018 年，歐盟要求唇部護理產品中的礦物油必須符合藥品要求，使用不含MOAH 的高度精煉礦物油[6]。然而，在市售化妝品中卻屢次檢出MOAH。2019 年，Zoccali 等[7]檢測了意大利生產的9 個化妝品樣品，其中4 個樣品中檢出MOAH，含量高達386～5869 mg/kg；2020 年，Koch 等[8]發現2 個凡士林原料中含有MOAH，其中三環以上的MOAH 含量高達110 mg/kg。

實際上，分析化妝品中的MOAH 非常困難，原因是礦物油中高比例的MOSH 嚴重干擾MOAH 的分析。目前，礦物油分析方法普遍采用液相色譜-氣相色譜聯用（LC-GC）技術。然而，LC-GC 的接口限定LC 只能采用250 mm×2.1 mm 的硅膠柱[9]，對MOSH 的處理量僅為20 μg，過多的MOSH 將拖尾進入MOAH 餾分，產生假陽性結果[10]。鑒于此，Zoccali 等[7]采用LC-全二維氣相色譜-氫火焰離子化檢測器/質譜（LC-GC×GC-FID/MS）檢測化妝品中的礦物油，將MOAH 的定量限（LOQ）降至11.8 mg/L。然而，該方法過于復雜，難以用于常規檢測。Koch 等[8]采用斷開LC-GC 接口的策略，將LC 組件單獨循環5 輪以制備更多的MOAH 餾分，然后合并、濃縮，注入LC-GC 進行分析，但該方法同樣操作繁瑣，應用困難。García-Cicourel 等[11]考察了GC-真空紫外檢測法（VUV）和超臨界流體色譜（SFC）-FID/VUV[12]法，以提高MOAH 分析的靈敏度，但都僅用于化妝品原料分析，未用于市售化妝品的檢測。

本研究基于制備液相色譜（Prep-LC）結合LC-GC 建立了化妝品中MOAH 的高靈敏檢測方法，通過在樣品前處理過程增加Prep-LC 制備環節，降低了分析方法的定量限。本方法可用于化妝品中微量MOAH的日常檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器與設備

液相色譜-氣相色譜聯用儀（LC-GC）：LC 20A 液相色譜儀（日本Shimadzu 公司），配備二元泵、紫外檢測器（波長230 nm）和Allure Si 色譜柱（250 mm×2.1 mm，5 μm，60 ?，美國Restek 公司）；GC 2010 plus 氣相色譜儀（日本Shimadzu 公司），配備氫火焰離子化檢測器（FID）、預柱（10 m×0.53 mm，美國Restek 公司）和分析柱（15 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Restek 公司）；LC-GC 接口（德國Axel Semrau 公司）和PAL 自動進樣器（瑞士CTC 公司）。

Brave pl700 制備液相色譜儀（Prep-LC，常州磐諾公司）：配備二元泵和紫外檢測器（波長280 nm），使用Si60 色譜柱（250 mm × 10 mm，5 μm，大連依利特公司）。

GCMS-QP2020 氣相色譜-質譜聯用儀（日本Shimadzu 公司）：配備DB-5HT 石英毛細管柱（15 m×0.25 mm，0.1 μm，美國Agilent 公司）。

A91PLUS 全二維氣相色譜-飛行時間質譜儀（GC×GC-TOFMS，常州磐諾公司）：一維柱為DB-17HT色譜柱（20 m × 0.25 mm，0.15 μm，美國Agilent 公司），二維柱為DB-1MS 色譜柱（1.5 m × 0.25 mm，0.10 μm，美國Agilent 公司）；DV 調制柱（1.3 m×0.25 mm，美國Agilent 公司）；SSM1800 調制解調器（上海雪景公司）和EI-TOFMS 0620 飛行時間質譜儀（廣州禾信公司）。

Biofuge primo R 低溫高速離心機（美國Fisher 公司）；SHZ-B 水浴恒溫振蕩器（上海博迅醫療生物公司）；R-100 旋轉蒸發儀（瑞士步琦公司）；TUS-200P 振蕩型恒溫金屬?。ㄉ虾Ｒ缓憧茖W公司）。

1.1.2 試劑與標準品

正己烷、二氯甲烷、無水乙醇和甲苯（色譜純，美國Fisher 公司）；無水Na2SO4（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。硅膠（0.063～0.200 mm，德國Merck 公司），使用前在400 ℃下活化16 h，冷卻后置于干燥器中，7 d 內使用。

礦物油產品：白油（幾乎不含MOAH，美國Sigma-Aldrich 公司）；No.45 潤滑油（含83.5% MOSH 和9.5%MOAH，中國石油潤滑油公司）；K009 潤滑油（含74.0% MOSH 和11.0% MOAH，德國聯邦材料研究和測試研究所）。上述礦物油均用于Prep-LC 的分離性能考察。

標準品：正十一烷（n-C11）和戊基苯（5B），分別用于考察MOSH 和MOAH 是否存在揮發損失；環己基環己烷（Cycy）、2-甲基萘（2-MN）和1,3,5-三叔丁基苯（TBB），MOSH 和MOAH 的定量內標物（可根據實際情況選擇2-MN 或TBB）；正十三烷（n-C13）和1-甲基萘（1-MN），考察Cycy 和2-MN 是否存在損失或共流出現象；5α-膽甾烷（Cho）、1,4-二（2-乙基己基）苯（DEHB）和苝（Per），用于標記Prep-LC 分離MOSH餾分段的末端、MOAH 的首端和末端；菲（Phe），考察Prep-LC 制備過程是否存在三環以上MOAH 的損失。以上標準品均購自美國Sigma-Aldrich 公司。

配制MOSH/MOAH 混合標準溶液（150～600 μg/mL，溶劑為甲苯，n-C13的濃度為150 μg/mL，n-C11、Cycy、5B、1-MN、2-MN 和TBB 的濃度均為300 μg/mL，DEHB、Phe、Cho 和Per 的濃度均為600 μg/mL），用于LC-GC 分析性能考察和MOAH 測定以及Prep-LC 洗脫條件的優化。

市售的口唇護理與化妝品實際樣品共15 個，包括唇膏、口紅、唇蜜和凡士林，均購于電商平臺。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品提取

準確稱取0.2 g（精確至0.001 g）樣品于玻璃離心管中，加入20 μL MOSH/MOAH 混合標準溶液和5 mL 無水乙醇，超聲或振蕩；加入10 mL 正己烷，以400 r/min 振蕩30 min；加入15 mL 去離子水，充分混勻后靜置30 min，離心，取上層正己烷相；加入10 mL 正己烷重復提取，合并提取液，減壓濃縮至約1 mL，過硅膠柱凈化，定容至5 mL，備用。

1.2.2 Prep-LC制備MOAH

進樣體積為2.5 mL，流速為3.0 mL/min；以正己烷-二氯甲烷混合溶劑進行梯度洗脫：0～3 min，100%～70%正己烷，保持4 min；7～10 min，由70%正己烷轉換為100%二氯甲烷，維持20 min 以再生色譜柱；30～35 min，由100%二氯甲烷轉換到100%正己烷，保持20 min 以平衡系統。收集8～15 min 內流出的MOAH 餾分，濃縮至約0.5 mL，備用。

1.2.3 GC-MS分析

進樣體積為1 μL，不分流進樣；進樣口溫度為350 ℃；GC 升溫程序為：初始溫度40 ℃，保持4 min，以20 ℃/min 升至340 ℃，保持10 min；載氣為氦氣，流速為1.4 mL/min；傳輸線溫度為320 ℃；MS 采用EI 源，以Scan 模式采集，掃描時間為4.0～28 min，采集范圍m/z30～700，溶劑延遲4 min。

1.2.4 LC-GC分析

進樣體積為50 μL，LC 部分以正己烷-二氯甲烷體系梯度洗脫：0～1.5 min，100%正己烷，1.6～6.2 min，70%正己烷（正向，流速為0.3 mL/min）；6.3～15.2 min，100%二氯甲烷（反向，0.5 mL/min）；15.3～25.2 min，100%正己烷（正向，0.5 mL/min）；25.3～30.0 min，100%正己烷（正向，0.3 mL/min）。其中，2.0～3.5 min 和4.5～6.0 min 分別流出MOSH 和MOAH，經閥（瑞士VIGI 公司）切換，以氫氣為載氣導入GC 系統。GC 配備兩套平行LC-GC 接口，均由預柱、分析柱及其之間通過三通連接的溶劑排空閥（SVE）組成。SVE 在閥切換前0.5 min 開啟，轉移結束0.3 min 后關閉，期間大部分溶劑通過SVE 排出，濃縮的溶質聚集于GC 分析柱入口，此時啟動升溫程序：初始溫度60 ℃，保持6 min 后，以15 ℃/min 升溫至120 ℃，再以25 ℃/min 升溫至370 ℃，保持6 min。FID 溫度為380 ℃，其輔助氣、燃燒氣和助燃氣分別為氮氣、氫氣和空氣，流速分別為30、40 和400 mL/min。

1.2.5 GC×GC-TOFMS分析

進樣體積1 μL，不分流進樣；進樣口溫度為350 ℃；載氣為氦氣，流速1.7 mL/min；GC 升溫程序：初始溫度50 ℃，保持3 min 后，以5 ℃/min 升至335 ℃。TOFMS 條件：電子轟擊離子源，電離電壓–70 eV，離子源溫度250 ℃；接口溫度320 ℃，檢測電壓–1640 V；采集質量范圍m/z50～650；采集速度為每秒101 張譜；溶劑延遲時間3.0 min。

1.3 數據統計與計算

由于MOAH 的LC-GC 譜圖呈鼓包峰，鼓包峰上方的尖峰為干擾物，積分時需扣除，以內標法進行定量分析（內標物可選擇2-MN 或TBB）。數據處理分別采用Lab solution、Canvas、Excel 和Origin 軟件。

2 結果與討論

2.1 樣品提取

礦物油為弱極性物質，最常用提取溶劑為正己烷[10]。然而，化妝品中含有大量油脂、染料和添加劑等極性物質[13]，難溶于正己烷，影響提取效率。本研究先通過乙醇分散并溶解樣品，然后加入正己烷，使礦物油完全溶出。乙醇與正己烷互溶，需加水實現相分離，使乙醇-水位于下層，吸取上層正己烷相即得到礦物油提取液[14]。因此，化妝品中礦物油的提取需優化乙醇、正己烷、水的添加量和提取級數。

溶劑的添加量根據樣品量確定，樣品量由分析方法的定量限（LOQ）決定。目前，國內外還未見化妝品中MOAH 的限量要求。本研究參照文獻[8]的研究結果，將LOQ 值預設為10 mg/kg。根據文獻[10]，進入FID 檢測器的礦物油須達到50～100 ng 才能滿足分析不確定度要求。因此，以LOQ 值為10 mg/kg 計算得到對應的樣品量為0.2 g（見公式（1））。相應地，加入5 mL 乙醇即可分散樣品?？疾炝苏和榈奶砑恿浚?、10 和15 mL）對提取率的影響，結果表明，10 和15 mL 正己烷的提取率相當，因此確定正己烷的體積為10 mL。

式中，m為樣品質量（g）；mi為最少進入FID 的礦物油質量（100 ng）；C為預設的LOQ 值，即10 mg/kg；V1為LC-GC 上機試液的定容體積（0.5 mL）；V2為Prep-LC 上機試液的定容體積（5.0 mL）；Vin1為LC-GC的進樣體積（50 μL）；Vin2為Prep-LC 的進樣體積（2.5 mL）。

為了與后續分析方法匹配并避免濃縮過程造成揮發損失，需要加水除去提取液中的乙醇[14]。實驗結果表明，在上述由5 mL 乙醇與10 mL 正己烷組成的混合溶液中，加入15 mL 水可實現分層，吸取上層正己烷相即得到礦物油提取液。為了提取完全，再次加入10 mL 新鮮正己烷進行二次提取。結果表明，第一次提取的MOAH 占兩次提取總量的96.6%，即第二次的提取量僅為第一次的3.5%，說明兩次提取可以得到幾乎全部的MOAH。

2.2 Prep-LC制備MOAH

2.2.1 色譜柱的選擇

液相色譜分離的關鍵是色譜柱，色譜柱填料及其粒徑、孔徑和柱規格均對色譜柱的分離性能有影響。礦物油的凈化普遍采用硅膠。通常情況下，用于固相萃?。⊿olid phase extraction，SPE）的硅膠存在粒徑不均一和分離性能差等問題，無法用于分離MOSH 和MOAH[15]；硅膠與銀漬硅膠的混合物可以分離MOSH 和MOAH，但穩定性和重現性較差[16]。相比之下，用于LC 的硅膠呈球形，規格均一、剛性較強、分離效能較好，可實現MOSH 和MOAH 的完全分離[10]。

對于液相色譜柱，如果分離填料完全相同，則色譜柱的分離能力與柱規格呈正比關系。如前所述，LC-GC 的硅膠柱規格為250 mm×2.1 mm，僅可分離20 μg MOSH[10]，遠不能滿足化妝品中微量MOAH的檢測要求。歐盟法規要求化妝品用礦物油中的MOAH 比例應小于3%（m/m）[17]，如果礦物油完全由MOSH 和MOAH 組成，則兩者比例不可低于32/1（97/3）。按照預設的LOQ 值（10 mg/kg），0.2 g 樣品經過提取、凈化和分離，需要注入LC-GC 的MOAH 應為2 μg 以上。因此，需凈化去除64 μg（32× 2 μg）以上的MOSH，即Prep-LC 的色譜柱至少需要擴容至LC-GC 硅膠柱的4 倍。因此，常規的250 mm×4.6 mm色譜柱是本方法的最低要求?？紤]到歐盟法規僅針對化妝品的原料，而成品的干擾情況更復雜、分析要求更高，因此選擇250 mm×10 mm 硅膠柱用于Prep-LC 凈化及制備MOAH。

2.2.2 洗脫程序

流動相對色譜柱分離性能的影響很大。在100%正己烷為流動相的情況下，硅膠對極性物質的吸附能力通常最強；加入少量弱極性溶劑，以正己烷-二氯甲烷（7∶3，V/V）混合溶劑洗脫，可實現MOSH 和MOAH 的分離；100%二氯甲烷將極性物質洗脫下來，用于色譜柱的再生[10]。為了繪制洗脫曲線，本研究以MOSH/MOAH 混合標準溶液為研究對象，以正己烷-二氯甲烷（7∶3，V/V）進行梯度洗脫，每3 mL 收集一次餾分并注入GC-MS 進行分析，以篩選Prep-LC 的洗脫條件。

初始條件為：0～8 min，100%正己烷，用于洗脫MOSH；8.1～10 min，由100%正己烷轉換為100%二氯甲烷，用于洗脫MOAH；10.1～30 min，100%二氯甲烷，用于色譜柱再生；30.1～35 min，由100%二氯甲烷轉換為100%正己烷，并保持到第55 min，用于系統平衡。結果表明，MOSH 餾分于6 min 內全部流出，MOAH 餾分于第9 min 開始流出，即MOSH 和MOAH 流出時間的間隔為2 min，分離效果較好。然而，MOAH 的洗脫時間較長，到第16 min 還未洗脫完全（圖1A）。

圖1 不同的梯度洗脫條件下MOSH 和MOAH 的流出時間和間隔Fig.1 Elution time and gaps of MOSH and MOAH under different gradient elution conditions

為了縮短MOAH 的流出時間，調整洗脫程序為：0～3 min，100%～30%正己烷，保持7 min，用于洗脫MOSH 和MOAH；10 min 后進入上述再生與平衡程序。結果表明，MOSH 餾分洗脫時間前移了1 min，5 min 內全部流出；MOAH 的開始流出時間也提前至第7 min，到第10 min 全部流出，即MOAH的流出時間為3 min（圖1B）。然而，MOSH 和MOAH 的間隔縮短為1 min，較短的間隔時間容易在實際應用中產生交叉干擾。

為了加大間隔時間，調整程序為：0～3 min，由100%正己烷轉換為70%正己烷，保持4 min，以洗脫MOSH；7.1 min～10 min，由70%正己烷轉換為100%二氯甲烷，保持20 min，用于洗脫MOAH 及再生色譜柱；隨后進入上述溶劑轉換與平衡程序。結果表明，MOSH 于5 min 內全部流出，MOAH 于第9 min開始流出，到第14 min 結束（圖1C），即MOAH 的流出時間為第9～14 min。為了保證回收率，實際操作時前后各增加1 min，即收集第8～15 min 的流出液。此條件下MOSH 和MOAH 間隔3 min，分離效果良好，因此后續實驗采用此條件為Prep-LC 的分離條件。

2.2.3 分離性能考察

考察了去除MOSH 的效果與制備MOAH 的回收率。分別以MOSH 和MOAH 混合標準溶液、No.45和K009 潤滑油為研究對象，采用1.2.2 節的Prep-LC 分離條件制備MOAH，濃縮后分別注入LC-GC 和GC×GC-TOFMS 進行分析。結果表明，LC-GC 譜圖中未出現n-C11、n-C13、Cycy 和Cho 等代表MOSH 餾分的化合物，也未檢出潤滑油中的MOSH，說明采用Prep-LC 制備的MOAH 餾分較純凈，不存在MOSH 殘留。類似地，各樣品的MOAH 餾分的GC×GC-TOFMS 譜圖也未出現MOSH 的峰（電子版文后支持信息圖S1），說明采用Prep-LC 可以有效去除MOSH。

通過比較Prep-LC 制備前后的MOAH 含量計算回收率。結果表明（表1），代表MOAH 餾分的7 種化合物即DEHB、5B、1-MN、2-MN、TBB、Per 和Phe 的回收率為92.7%～104.0%，潤滑油No.45 和K009中MOAH 的回收率則均高于98%。其中，5B 的回收率（92.7%）偏低，可能是在濃縮和進樣過程發生了揮發損失；Per（4 個苯環）的回收率（92.8%）也偏低，但Phe（3 個苯環）卻未受影響，說明Prep-LC 的硅膠柱對高環數稠環芳烴的吸附作用較強，造成洗脫不完全。礦物油中的MOAH 主要由高度烷基化的三環以下芳烴組成，因此Prep-LC 處理對MOAH 影響較小。

表1 制備液相色譜（Prep-LC）凈化MOAH的回收率Table 1 Recovery of the MOAH through preparative liquid chromatography (Prep-LC) purification

2.2.4 凈化容量考察

為了考察Prep-LC 對MOSH 的分離容量，以白油為研究對象，逐步增大其進樣量，然后收集MOAH餾分并以LC-GC 考察MOSH 殘留情況。結果表明，當白油的進樣量增至2.4 mg 時，LC-GC 均未檢出MOSH；白油的進樣量繼續加至3.0 mg 時，其MOAH 餾分的LC-GC 譜圖中出現MOSH 鼓包峰，說明MOSH 發生拖尾進入MOAH 餾分，因此確定Prep-LC 最多可以去除2.4 mg MOSH。

色譜柱的凈化容量與其規格密切相關。LC-GC 的色譜柱為250 mm×2.1 mm，可分離20 μg MOSH；將柱規格增大為250 mm × 10 mm，理論上可凈化約450 μg MOSH。然而，本研究中Prep-LC 最多可去除2.4 mg MOSH，是該理論值的5 倍以上，說明增大色譜柱對提升凈化容量有疊加效應，類似的結論在文獻[18]中也得到證實。但是，為了保證凈化效果，實際應用時通常需要設定“安全范圍（Safety margin）”，因此建議MOSH 的凈化容量不超過2.0 mg。

2.3 方法學考察

本研究采用LC-GC 檢測，所用FID 檢測器的線性范圍較寬，但LC-GC 接口技術限制了LC 的容量，使得進入GC 的礦物油遠未達到FID 的上限。因此，礦物油分析的方法學考察一般不涉及線性范圍[10]。

由于MOAH 由數以萬計不同結構的芳烴化合物組成，其分析譜圖呈較寬沸程的鼓包峰形狀，并且不同來源MOAH 的沸程范圍差別很大。為了滿足分析不確定度要求，通常進入FID 的MOAH 應達到50～100 ng[10]。本研究以此為依據，預設定量限為10 mg/kg 并計算出稱樣量為0.2 g（計算方法見公式（1））。為了考察本方法的實際定量限，按照1.2 節實驗方法對空白樣品進行了分析。結果表明，LOQ即空白樣品響應信號的標準偏差10 倍對應的濃度為4.5 mg/kg，考慮到實際樣品的干擾物差異和MOAH譜圖的碳數差異，確定本方法的LOQ 值為10 mg/kg。

采用標準添加法考察回收率。由于目前尚無MOAH 的標準品，本研究以K009 潤滑油中的MOAH作為標準添加物。在空白樣品中添加不同濃度的MOAH，添加濃度分別為LOQ 的1、2、5 倍，即10、20 和50 mg/kg。結果表明，加標回收率為82.0%～100.8%，相對標準偏差（RSD）為3.6%～7.3%（表2）。由于目前國內外還沒有化妝品中微量礦物油的分析標準，本研究參考歐洲聯合研究中心（Joint Research Center，JRC）[19]關于食品與食品接觸材料中礦物油分析的方法指南，其中要求回收率為80%～110%，RSD ＜10%。因此，本研究建立的方法可以滿足實際樣品中礦物油分析的要求。

表2 口紅樣品中MOAH的加標回收率和相對標準偏差Table 2 Recoveries and RSDs of MOAH in a lipstick sample

2.4 實際應用

采用本方法對市售15 個口唇護理與化妝品樣品中的MOAH 含量進行了檢測，結果表明，其中4 個檢出MOAH，含量為204～1460 mg/kg（圖2），此值與在意大利和德國的調查結果類似[7-8]?？疾炝岁栃詷悠穼腗OSH 譜圖，發現兩類礦物油的碳數范圍相同，根據JRC 方法指南，可確定其為礦物油污染物[19]。此外，4 個陽性樣本的MOAH 譜圖的碳數范圍和形狀差別較大，說明其來源于不同的礦物油產品。不同于其它3 個樣本，圖2C 中出現2 個鼓包峰，說明其MOAH 可能來自2 種不同的礦物油。另外，盡管這些陽性樣本的碳數范圍不同，但其最大碳數均超過C50，說明這些化妝品的污染可能來源于高沸點的潤滑油或潤滑脂原料[10]。

圖2 4 個化妝品陽性樣本的MOAH 譜圖Fig.2 MOAH chromatograms of 4 positive cosmetic samples

3 結論

化妝品中微量MOAH 的分析難點在于與其共存的MOSH 干擾嚴重。本研究采用Prep-LC 成功實現了高達2 mg 的MOSH 與MOAH 的精準分離，結合LC-GC 聯用技術建立了化妝品中MOAH 的高靈敏度檢測方法。本方法的LOQ 低至10 mg/kg，可用于常規檢測。采用本方法檢測發現市售的部分口唇護理品中含有MOAH，其來源可能是精煉程度較低的潤滑油或潤滑脂原料。

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