無機元素的指紋圖譜分析在透明質酸鈉來源鑒別中的應用

劉航瑞 陳玉娟 臧洋 陸艷麗 周希蕊 黃思玲 李紅梅 郭學平* 馮流星*

1（中國計量科學研究院，北京100029）

2（北京化工大學，北京 100029)

3（華熙生物科技股份有限公司，濟南 250101)

透明質酸（Hyaluronic acid，HA）是一種高分子材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，廣泛應用于生物醫學材料[1-2]、美容護膚[3-4]、藥物傳遞[5]和組織工程[6-7]等領域。透明質酸鈉（Sodium hyaluronate，SH）是透明質酸的鈉鹽，具有更好的水溶性和穩定性，更易于加工和應用于化妝品中。HA 的制造方法包括化學合成、酶促反應合成、動物組織提取和生物發酵等?；瘜W合成HA 存在的主要問題是化學交聯劑的污染[8]，酶促反應的缺點是這些酶缺乏絕對的底物特異性[9]，而動物組織提取則存在純化困難和交叉病毒感染等風險[10]。目前，在HA 產品的生產工藝中，更多采用鏈球屬菌的生物發酵模式，原料選擇、發酵和提純等環節均可能引入不同類型的元素[11]，導致不同廠家生產的SH 質量參差不齊，并且不同廠家及不同工藝的HA 產品具有顯著的元素指紋特征。

近年來，無機元素指紋圖譜分析技術已被廣泛應用于食品[12-14]、藥品[15-17]和化妝品[18-20]等領域的質量控制，通過對樣品中的無機元素含量進行分析，可以為樣品建立一個獨特的指紋圖譜，從而實現對樣品的快速鑒別和質量評估。目前，在化妝品的質量控制中側重于測量少數有害元素（如Pb、Hg 和As 等），以保證產品的安全性，但不能提供足夠的信息對產品來源進行分類和鑒別，而無機元素指紋圖譜分析技術具有快速、準確、可靠、高靈敏度和高分辨率等特點，能夠為樣品的質量控制提供重要信息[14,21-23]。

本研究選取市場占有率較高的6 個廠家共計13 個批次的SH 產品，建立了SH 產品無機成分的分析方法。對于含量相對較高的Na 元素，采用電感耦合等離子體發射光譜（ICP-OES）進行外標法測量，Cl 元素采用離子色譜（IC）以外標法測量。對于含量較低的其它無機元素，采用電感耦合等離子體質譜（ICPMS）對樣品進行全定量分析。將70 種元素的定量數據進行指紋圖譜分析，并選取含量較高的23 種元素繪制SH 指紋圖譜；采用主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）等統計學方法分析各樣品間的相似性和差異性，并通過變量重要性投影（VIP）找出造成差異的關鍵元素；通過系統聚類分析（HCA）將樣品按照其無機成份相似度進行分類，并繪制出聚類樹狀圖。通過元素指紋圖譜分析可清楚了解各批次之間的異同，為產品優化和改進提供依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7700x series 電感耦合等離子體質譜儀（美國Agilent 公司）；iCAP 7000 series 電感耦合等離子體發射光譜儀和Thermo-ICS-5000+型離子色譜儀（美國ThemoFisher Scientific 公司）；KDF S80 馬弗爐（日本SANSYO 公司）；ETHOS D 消解儀（意大利Milestone 公司）。

濃HNO3和H2O2（BV-Ⅲ級，北京化學試劑所）；ICP-MS 調諧液（10 μg/L Ce、Co、Li、Tl 和Y，美國Agilent 公司）；鈉單元素溶液標準物質（GBW（E）080260）、水中氯根成分分析標準物質（GBW（E）080269）和多元素混合標準溶液（GBW（E）082431、GBW（E）082429 和GBW（E）082430）（中國計量科學研究院）。

13 批SH 樣品（編號H1～H13）分別來自6 個生產廠家：公司1（H1～H5），公司2（H6～H8），公司3（H9），公司4（H10～H11），公司5（H12），公司6（H13）。樣品均為白色粉末。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1 微波消解

稱取0.1 g 樣品于消解罐中，依次加入7 mL 重蒸HNO3和1 mL H2O2，按照表1 中消解程序進行微波消解，消解后的樣品呈透明清透的微黃色。將消解后的樣品轉移至離心管中，加水稀釋至33 g，采用ICPMS 測量無機元素，每個樣品測量3 次；由于樣品中Na 元素含量較高，需再稀釋40 倍用于ICP-OES 測量Na 元素，每個樣品重復測量3 次。

表1 透明質酸鈉（SH）樣品的微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedure for sodium hyaluronate (SH) samples

1.2.2 馬弗爐灰化

將0.1 g 樣品置于馬弗爐中加熱干燥灰化，程序如表2 所示。首先，在加熱干燥灰化前，加入適量KOH，盡可能保存Cl–。第一步為干燥樣品，第二步和第三步為碳化樣品，第四步為灰化樣品?；一?，加入適量稀HNO3以調節pH=7。最后，加入適量超純水將樣品稀釋至適當濃度，并稱量溶液質量，采用IC測量Cl 元素，每個樣品測量3 次。

表2 SH樣品使用馬弗爐灰化程序Table 2 Muffle furnace ashing procedure for SH samples

1.3 儀器條件和分析方法

1.3.1 ICP-OES儀器條件

射頻功率為1150 W，泵速為50 r/min，輔助氣流速為0.5 L/min，霧化器氣體流速為0.5 L/min，冷卻氣流速為12 L/min，無輔助氣體。將鈉單元素溶液標準物質（GBW（E）080260）分別稀釋至1.0、2.0、5.0 和10.0 μg/g，采用ICP-OES 測量，繪制標準工作曲線，相關系數應大于0.9999。

1.3.2 IC儀器條件

采用自動抑制外加水模式的抑制器和電導檢測器進行檢測。色譜柱為Dionex IonPac AS19 陰離子柱，柱箱溫度為30 ℃；抑制電流為50 mA；樣品進樣量為25 μL；流速為1 mL/min。淋洗程序采用24 mmol/L KOH 溶液等度洗脫，運行時長為10 min。采用水中氯根成分分析標準物質（GBW（E）080269）作為樣品中Cl?的定量標準。

1.3.3 ICP-MS儀器條件

使用調諧液（1 μg/L）調諧，使ICP-MS 儀器滿足靈敏度、雙電荷、氧化物和分辨率等工作指標的要求，再進行樣品中70 種元素的全定量分析。射頻功率1500 W；等離子體流速15 L/min；載氣流速（Ar）1.01 L/min；采樣錐深度8.0 mm，積分時間為0.1 s；碰撞模式為NoGas 模式。將多元素混合標準溶液GBW（E）082431、GBW（E）082429 和GBW（E）082430 混合后稀釋至合適濃度，建立每種元素的標準曲線，相關系數均需大于0.999。

1.3.4 熱圖分析處理和指紋圖譜繪制

熱圖分析是一種可視化數據方法，采用不同種類、不同深淺的顏色呈現矩陣數據中每種元素的值，進而發現數據之間的關系。將13 批SH 中70 種元素全定量數據取平均值后導入Origin 程序，使用Z值均一化減少數據差異，提高數據的可比性，然后繪制熱圖。從70 種元素全定量分析結果中挑選含量較高、有代表性的22 種元素（Li、B、Mg、Al、Si、P、K、Ca、Sc、Ti、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Br、Se、Rb 和Sr）繪制指紋圖譜，由于不同元素之間含量相差多個數量級，因此，將Mg、Si、P、K 和Ca 含量縮小100 倍，將Mn 和Sr 含量縮小10 倍。

1.3.5 數據多元統計分析處理

數據處理軟件為Microsoft Excel、Origin 2021 和MetaboAnalyst。

PCA 是一種將高維數據降維的方法，高維數據通過線性變換投影到一個新的低維空間中，減少變量，降低維數并同時盡可能地保留數據的信息。PCA 分析不依托數據的分組信息，是一種無監督的分析方法。PLS-DA 是一種有監督的統計方法，結合偏最小二乘回歸和判別分析的思想，尋找對分組有顯著影響的變量。OPLS-DA 通過正交化進一步放大變量的影響，能更好地解釋樣本分類，但是OPLS-DA 可能過度擬合數據，導致預測性能下降。

將13 批SH 樣品的70 種元素全定量分析的3 次平行數據導入到MetaboAnalyst，使用Z 值均一化后進行PCA 和PLS-DA。PCA 采用協方差矩陣；PLS-DA 依托的分組信息為生產廠家，分為1～6 組；對PLS-DA 分不開的組再單獨進行OPLS-DA 分析。

1.3.6 HCA處理和指紋圖譜繪制

HCA 是一種無監督的數據分析方法，通過測量樣本之間的距離（相似性）將其分為不同的群組，可以直觀地從樹狀圖中看出樣本之間的相似程度。將上述熱圖使用的Z值均一化后的數據，采用平均聚類方法和Euclidean 平方距離類型進行HCA 處理。

2 結果與討論

2.1 SH樣品主要元素的測定結果

13 批SH 樣品中的Na 元素和Cl 元素檢測結果見表3。SH 中Na 元素含量大于400 mg/g，其中，H6～H9 樣品中Na 元素含量較低（＜450 mg/g），其它樣品的Na 元素含量較高；Cl 元素含量在不同廠家樣品中的差異較明顯，其中，公司4 的H10 的含量超過3000 μg/g，公司6 的H12 的含量超過7000 μg/g，其余樣品均超過2000 μg/g，含量最高的H12 與含量最低的H11 相差近68 倍。

表3 SH樣品中Na和Cl含量測量結果Table 3 Measurement results of Na and Cl content in SH samples

2.2 統計學分析結果

2.2.1 熱圖與指紋圖譜結果

采用ICP-MS 對樣品中70 種元素進行全定量分析，所得數據再進行熱圖分析，結果見圖1A。通過熱圖可直觀地看出所有樣品中的無機元素含量，紅色代表此樣品中該元素的含量相對其它樣品偏高，藍色則代表偏低。由圖1A 可見，公司1 的H2 樣品中B、P、Ni 和I 等元素含量顯著低于其它樣品，H3、H4樣品中Zn、Ru、Rh、Au 和Pb 含量相似，均高于其它樣品。公司2 的H6～H8 樣品中Ga、I、La、Tb、Ba～Er 等多種元素含量相似，均高于其它樣品。公司6 的H13 樣品中多種無機元素含量顯著高于其它樣品。13 批SH 樣品全定量分析結果中22 種含量較高的元素繪制的指紋圖譜見圖1B，樣品的指紋圖譜峰型總體走勢基本一致，但是Al、Si、P、Ca、Ti 和Cr 等元素含量差異明顯。綜上所述，通過ICP-MS 全定量分析數據的熱圖和指紋圖譜分析可以快速了解樣品中無機元素的相對含量，發現樣品之間的差異性和相似性，為質量控制和生產優化提供有力支持。

圖1 （A）13 批SH 樣品中70 種元素全定量分析結果；（B）13 批SH 樣品中22 種元素指紋圖譜Fig.1 (A)Semi-quantitative results of 70 kinds of elements in 13 batches of SH samples;(B)Fingerprint map of 22 kinds of elements in 13 batches of SH samples

根據我國《化妝品安全技術規范》（2015 年版）[24]要求，化妝品中相關元素限定標準分別為Pb ≤10 mg/kg，Hg ≤1 mg/kg，As ≤2 mg/kg，Cr ≤5 mg/kg。根據測定結果可知，這6 個生產廠家的13 批SH 樣品中相關元素含量均未超過限定標準。但是，有一些分析結果值得注意：公司2 的H6～H8 樣品中鑭系元素（La～Lu）含量均高于其它樣品；公司5 樣品中H12 的Cl 元素含量遠超其它樣品；公司3 的H9樣品和公司6 的H13 樣品中多種元素含量超過其它樣品，并且個別重金屬元素也接近我國標準限定水平。這些元素含量過高的產品可能會對人體造成潛在危害，因此，生產廠家應格外重視生產原材料的安全和生產過程的質量控制。

2.2.2 PCA結果

對數據進行PCA 的結果見圖2A，主成分貢獻率見圖2B。此模型中，主成分PC1 和PC2 分別占比26.3%和20.8%，累計貢獻率47.1%，占比過小，說明這兩種主成分不能完全解釋原始數據中的變化，SH樣品中多種元素含量具有較大的方差，使得主成分解釋力度較弱。由PCA 圖可知，公司2 和公司6 的數據點與其它公司距離較遠，能明顯區分開；但公司1、3、4 和5 的數據點在圖中距離較近，不能完全分開，說明PCA 模型構建效果欠佳，需要使用其它方法進一步分析。

圖2 （A）來自6 家公司的SH 中70 種元素含量的PCA 圖，不同顏色代表來自不同公司（下同）；（B）前5 個主成分因子的貢獻率（PC1～PC5），橫坐標表示主成分順序Fig.2 (A) Principal component analysis (PCA) score plots of 70 kinds of elements in SH from 6 companies,different colors represent from different companies (the same below);(B) The contribution rate of the first 5 principal component factors (PC1?PC5),the abscissa represents the principal component order

2.2.3 PLS-DA和OPLS-DA結果

對全定量分析數據進行PLS-DA 的結果見圖3A，圖3B 為VIP 得分圖，公司3～公司6 的樣品都得到了較好分離，公司4 和公司5 的樣品有少許重疊可以忽略，但是公司1 和公司2 的樣品還有較大區域重疊，較難分類，需要進一步進行OPLS-DA 放大兩者的差異。由圖3B 可見，多種元素（Li、Ca、Nb、P、Mg、Sr、Zr、Al、Pd 和As 等26 種元素）對樣品分類非常重要（VIP ＞1），熱圖分析也表明這些元素在不同樣品之間顏色變化明顯（圖1A），含量差異較大。PLS-DA 的交叉驗證準確率為84.6%，可以較好地評估和鑒別公司3～公司6 生產的SH 的廠家來源。

圖3 來自6 家公司的SH 中70 種元素含量的（A）PLS-DA 圖和（B）PLS-DA 的VIP 得分圖；來自公司1和公司2 的SH 中70 種元素含量的（C）OPLS-DA 圖和（D）OPLS-DA 的VIP 得分圖Fig.3 (A) PLS-DA score plots of 70 kinds of elements of SH from six companies and (B) corresponding VIP plot of PLS-DA;(C) OPLS-DA score plots of 70 kinds of elements in SH from companies 1 and 2,and (D)corresponding VIP plot of OPLS-DA

對公司1 和公司2 的樣品使用OPLS-DA 方法進一步分類，以探究對這兩組樣品分類起重要作用的元素。將公司1 和公司2 的數據單獨進行Z值均一化后再進行OPLS-DA 分析，結果如圖3C 所示，VIP得分圖見圖3D?？梢姽? 和公司2 的樣品得到很好分離，其中，Ho、Y、Eu、Dy、U、La 和Er 等元素對這兩個樣品分類起到重要作用（VIP ＞1）。OPLS-DA 的交叉驗證準確率為97.8%，表明這些變量包含足夠的信息用于區分這兩種樣品的來源。綜上，采用PLS-DA 和OPLS-DA 方法對全定量分析數據進行分析可以鑒別SH 的廠家來源，并確定影響樣品分類的重要變量。

2.2.4 HCA結果

HCA 結果如圖4 所示，橫坐標代表距離，節點越向右代表樣品關系越遠，在距離100 處，可將13 批樣品分為6 組：H1～H5、H10～H11、H12、H9、H6～H8 和H13，恰好對應6 家公司，表明同一公司的SH 產品具有較高的相似程度，不同公司生產的SH 具有較大的差異。在距離150 處，公司1 的H1～H5、公司3的H9、公司4 的H10～H11 和公司5 的H12 可以歸為一類；公司2 的H6～H8 為一類；公司6 的H13 為一類，這與PCA 中公司1、3、4、5 的位置相互重疊，而公司2、6 分離較好的結論一致。

圖4 聚類分析樹狀圖Fig.4 Cluster analysis dendrogram

3 結論

探討了無機元素指紋圖譜分析技術在SH 鑒別和質量評估中的應用。采用ICP-MS 等方法對13 個不同廠家不同批次的SH 樣品中的Na 元素和Cl 元素進行定量分析，對70 種無機元素含量進行了全定量分析，并采用熱圖、指紋圖譜、PCA、PLS-DA、OPLS-DA 和HCA 建立了SH 中的無機元素指紋圖譜。結果表明，不同廠家生產的SH 樣品中的無機元素含量和種類存在明顯差異，通過無機元素指紋圖譜可對SH 進行準確鑒別，在SH 的來源鑒別、質量控制、生產管理和監管等方面具有重要意義。本研究涉及的樣品數量較少，對市場上銷售的SH 產品的代表性不足，未來需要增加樣品數量和種類，并考慮更多維度的指紋圖譜特征，以提高方法對SH 產品的鑒別和評價能力。