谷子抽穗期突變體jt1242-14b的遺傳分析和定位

王春芳，祁東梅，史慎奎，張溫典，智慧，刁現民

(1.河北民族師范學院 生物與食品科學學院，河北 承德 067000；2.中國農業科學院 作物科學研究所，北京 100081)

谷子(Setariaitalica)，古稱稷或粟，是一年生草本作物，原產于中國，是中國重要的糧食作物之一，在旱作農業可持續發展中具有不可替代的作用[1].谷子耐旱節水性強，被認為是應對未來干旱環境和氣候變暖的戰略儲備作物.谷子作為二倍體自花授粉作物，基因組較小，操作方便，繁殖周期短，遺傳相對簡單，現已具備了較高質量的參考基因組序列[2]，且谷子SSR遺傳連鎖圖譜的發表[3]，為谷子的遺傳分析奠定了良好基礎.

近年來，谷子農藝性狀遺傳的基礎研究進展迅速，實現了多種遺傳連鎖圖譜的構建和高質量基因組序列的公布[4-5].谷子的抽穗期也很受關注，國內外多家單位利用RIL群體分析等方法，對谷子部分抽穗期相關的QTLs進行了定位發掘[6-7].谷子其他性狀的控制基因克隆也已取得了一定的進展，這為谷子遺傳的發展提供了良好的理論和實踐支持.目前，水稻中，抽穗期基因Hd7m[8]、EHD8[9]、DTH6[10]陸續被定位和克??；小麥中，抽穗期基因TaHdM605[11]也已完成定位、克隆和功能分析；高粱中，已經完成了多個抽穗期基因QTL的分析[12]；谷子中，已完成雄性不育基因SiMS1的定位[13]、棍棒穗性狀的鑒定[14]、Si-SP1小穗突變基因的功能分析[15]、穗部突變體sidts1的鑒定[16]以及谷子穗發育調控基因SiAUX1和LP1的圖位克隆與功能分析[17]，但是關于谷子早抽穗基因的研究報道很少.

本研究利用化學誘變劑甲基磺酸乙酯(ethyl methyl suffocate，EMS)誘變谷子參考基因組品種豫谷1號，篩選獲得能夠穩定遺傳的細稈早抽穗突變體并將其命名為jt1242-14b，用jt1242-14b與SSR41雜交得到F1，F1代植株自交獲得F2，構建F2遺傳分析群體，利用BSA[18]圖位克隆與SSR分子標記技術，對該群體進行突變基因的初定位.本研究為早抽穗基因的挖掘、分子育種及功能基因分析提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究中所用谷子品種豫谷1號和SSR41均來自北京中國農業科學院作物科學研究所.豫谷1號為目前已經測序完成有參考基因組的品種，而在構建基因定位群體中，SSR41被認為是與之匹配的理想基因型.SSR41與豫谷1號具有相似的植株高度和營養生長階段的表型，這使得雜交后代突變體的表型更容易被觀察和鑒定，并且SSR41在抽穗期和花期與豫谷1號幾乎相同，因此二者可同時播種.

通過化學誘變劑EMS誘變豫谷1號，在其后代中觀察得到細稈早抽穗突變體，雜合植株將其命名為jt1242-14b，jt1242-14b自交穩定遺傳后與SSR41雜交，得到F1代雜合植株，F1代自交得到914株F2群體，F2群體篩選性狀為細稈早抽穗的個體，將其作為基因定位群體，單株收集其成熟期葉片作為實驗材料.用于基因定位的植株群體和農藝性狀調查的植株均種植于北京中國農業科學院.

1.2 突變體農藝性狀調查

在谷子抽穗期和成熟期，分別對豫谷1號和jt1242-14b進行農藝性狀的調查，主要觀察記錄葉期、株高、莖粗、莖長、旗葉長、旗葉寬、莖節數、穗長、穗粗以及碼數，并對相應的農藝性狀進行統計及方差分析.

1.3 葉片總DNA的提取及PCR擴增

對F2遺傳群體中的隱性單株進行編號，取葉片進行DNA的提取.本實驗采用CTAB法[19]提取樣品DNA，然后進行PCR擴增.PCR體系為20 μL，包括2×PCR緩沖液10 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 1.6 μL，10 mmol/L的上下游引物2 μL，1 U DNA聚合酶，基因組DNA約50 ng，dd H2O補齊至20 μL.反應程序為95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 2 min，16 ℃ 2 min.

1.4 父母本中分子標記多態性的篩選

參照實驗室已有的[15]能夠覆蓋谷子全基因組的260對SSR標記引物，首先以父本SSR41、母本jt1242-14b、F2突變體單株DNA混池、F1雜合植株的DNA模板進行PCR擴增，PCR產物用聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色技術檢測條帶分離情況.當父本和母本的條帶單一、清晰，并且存在多態性時，該SSR標記引物可用于后續初定位實驗；若父本和母本的條帶不存在多態性，則該SSR標記引物不可用.記錄并統計可用于篩選父母本多態性的分子標記.

1.5 用SSR標記進行基因初定位

采用基因分離分組分析法(BSA)對目的基因進行初定位[20].首先選取F2群體中30株突變體單株葉片的DNA構建混池，然后以SSR41(顯性父本)、jt1242-14b(隱性母本)、F2突變體單株DNA混池以及F1雜合植株的DNA為模板，用上一步已篩選出的父母本間有多態性的SSR分子標記，再進行PCR擴增，篩選與目的基因緊密連鎖的SSR分子標記.當篩選的SSR分子標記在混池樣品中只擴增出母本條帶，父本帶明顯變弱近乎消失時，說明該標記與目的基因緊密連鎖，此時可以確定控制突變性狀的目的基因所在的染色體的大概位置，該SSR分子標記再用于后續基因的精細定位.

1.6 突變基因的精細定位

用上一步篩選出的與突變基因緊密連鎖的SSR分子標記，進一步分析F2群體中的突變體單株，即利用PCR技術結合該標記對父本、母本、F2突變體單株DNA混池、F1雜合植株和F2中隱性單株進行基因擴增，聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色檢測擴增產物，分析條帶中的單株交換株趨勢，統計結果并記錄數據.

2 結果與分析

2.1 jt1242-14b突變體形態特征及主要農藝性狀統計

對豫谷1號和jt1242-14b在苗期進行表型觀察：二者在苗期表型無明顯差異,F2植株中正常型與突變型分別是679株和235株，用理論分離比3∶1進行卡方檢驗(χ2=0.004,P>0.05)，結果顯示正常型和突變型的比例(2.89∶1)符合3∶1的數量分離比例，說明該突變性狀受隱性單基因控制.在抽穗期進行表型觀察：豫谷1號抽穗時間為當年8月3號，而jt1242-14b的抽穗時間為同年7月11號，jt1242-14b抽穗時間較豫谷1號提早24天，差異極顯著(圖1a-b)；與豫谷1號相比，jt1242-14b植株高度降低，約為豫谷1號的51.58%，莖節節數變少，莖稈變細、變長(圖2a-d)；jt1242-14b旗葉的長度和寬度都明顯變短(圖2e-f).對穗部性狀進行觀察：豫谷1號穗長約為22.1 cm，而jt1242-14b的穗長約為6.9 cm，jt1242-14b穗長約為豫谷1號的31.22%；豫谷1號穗粗約為27.0 mm，jt1242-14b穗粗約為8.0 mm，jt1242-14b的穗粗約為豫谷1號的29.63%(圖2g-h)；此外，jt1242-14b的穗碼緊實，穗碼數量變少，約為豫谷1號碼數的51.22%(圖2i).對兩者的農藝性狀進行t檢驗，突變體與豫谷1號間的性狀差異均已達到顯著水平(圖2).

圖1 豫谷1號和突變體jt1242-14b抽穗期表型比較

a.株高; b.莖粗; c.莖長; d.節數; e.旗葉長; f.旗葉寬; g.穗長; h.穗粗; i.碼數

2.2 父母本間多態性標記的篩選結果

為了篩選出可用于基因定位的SSR分子標記，利用實驗室中可覆蓋谷子全基因組的260對SSR分子標記引物，首先以父本SSR41、母本jt1242-14b、F2突變體單株DNA混池、F1雜合植株的DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物用聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測父本SSR41與母本jt1242-14b之間的條帶是否存在多態性.對父母本條帶之間存在多態性的SSR分子標記進行統計，共篩選出SSR分子標記81對，這些標記遍布9條染色體，在各染色體上的分布數量分別是7、14、7、6、3、15、5、9、15.

2.3 突變基因定位分析

首先，用篩選出來的81個父、母本間多態性好的SSR分子標記分析突變基因位于哪條染色體，以F2代群體中60株隱性單株的DNA為模板，進行PCR擴增.電泳檢測結果中，依據母本擴增帶強、父本擴增帶很弱或幾乎沒有的標準，篩選出2個與目標基因連鎖的分子標記，分別是In4746(圖3a)和In9-11(圖3b).結合BSA法進行分析，得到目標基因位于第9染色體上.然后，應用Primer 3軟件，在In4746和In9-11標記附近又設計了12個分子標記，繼續進行F2代群體中60株隱性單株的PCR檢測，結果顯示,In9-154(圖3c)、In9-102(圖3d)和In9-87(圖3e)也是與目標基因緊密連鎖的分子標記.最終統計結果如表1所示：在標記In4746檢測中，交換株數量最少，在其上下游隨著物理距離的加大，分子標記檢測出的交換株數量逐漸增多，說明jt1242-14b的突變基因距離In4746標記最近.

a-e.標記In4746、In9-11、In9-154、In9-102、In9-87在部分突變體植株中的分離帶型.♂.SSR41；♀.jt1242-14b；H.F2突變體單株DNA混池；F1.jt1242-14b×SSR41的F1

表1 利用分子標記檢測重組交換事件

2.4 候選基因及測序的分析

為篩查突變的目的基因，首先對9號染色體上4 447 kb的候選區間內所含的基因進行分析，發現該區域內包含谷子PHYB基因，且有文獻報道PHYB基因的突變體有早抽穗的表型[19].因此，本文首先對該基因進行測序，測序結果顯示，突變體的基因組序列與豫谷1號相比，在該基因的第5個外顯子上發生了一個堿基缺失(圖4)，使得該基因在錯誤編碼了4個氨基酸后提前終止，因此初步確定突變的目的基因是PHYB基因.

T1242.豫谷1號DNA序列;70814765.突變體1號;70814766.突變體2號

3 討論

本研究中谷子早抽穗突變體是通過豫谷1號經EMS誘變而來，為單基因隱性遺傳.本研究通過BSA基因定位法，將谷子細稈早抽穗基因定位在第9染色體上分子標記In4746、In9-11之間的4 447 kb物理距離之內.經測序分析，該突變基因是由PHYB突變而來.作為光敏色素的PHYB基因，在感知晝夜長短和光的強弱后，通過產生晝夜節律及激發信號轉導途徑來控制植物開花進程[21]，因此，該基因與谷子的抽穗期密切相關.

目前，很多水稻、小麥抽穗期基因[8-11]先后被定位和克隆.高粱方面，已完成對抽穗期部分基因的QTL分析[12].相關研究表明，不同植物中均存在與抽穗相關的同源基因[4]，特別是禾本科植物的抽穗期基因同源性很高，水稻、玉米、高粱中關于光敏色素對花期的調控報道顯示，長日照條件下PHYB基因抑制開花[21-23]，而PHYA和PHYC共同促進開花[24]，在對谷子抽穗期研究上，光敏色素基因PHYA、PHYB和PHYC受光周期調控[25]以及穗發育調控基因的圖位克隆與功能分析[16]已有報道，但對于早抽穗基因的分子機理和調控途徑還不清晰.雖然擬南芥和水稻中的開花誘導模型可以為谷子抽穗期分子機制研究提供重要的線索，但并不能完全解釋禾本科模式作物谷子抽穗開花誘導的機理.

谷子抽穗期長短與地方品種的系統發育分化有關，但光周期如何調控谷子抽穗開花，目前研究的還比較少，多數研究集中于表型分析及基因定位，本研究中篩選獲得的谷子突變體jt1242-14b，具有穩定遺傳特性.同豫谷1號相比，該突變體稈部明顯變細，葉變窄、變短，抽穗期明顯提前.遺傳分析表明，該突變體受隱性單基因控制，通過構建914株F2遺傳分析群體進行定位分析和測序比對，基本明確該突變基因由PHYB突變而來，這與其他物種中PHYB在長日照下抑制開花的表型一致[21,23-24]，這可為今后植物的光周期調控提供理論依據.

賈小平等[26-27]分析了春谷、夏谷的光溫反應特性，結果表明光溫條件對春谷和夏谷的影響是全方位的，并發現了2個與光周期敏感的SSR分子標記.通過研究谷子SiCCT基因和SiHd3a基因的表達特點，推測SiCCT基因通過參與光周期和溫度互作調控機制來調節谷子抽穗期；并發現長日照條件下谷子SiHd3a基因與水稻Hd3a基因表達存在差異，產生這種差異的原因可能是谷子SiHd3a基因在長日照條件下對谷子開花調控并不發揮作用，谷子中可能存在著另一個成花素基因專門負責長日照條件下促進抽穗開花.在本研究中，利用群體中提供的F2隱性突變中的60個單株，采用BSA法及SSR分子標記技術等，將突變基因(細稈早抽穗基因)定位在第9染色體上標記In4746和In9-11之間.考慮到群體交換律低等原因，實驗設計中可增加定位群體，分析交換株趨勢.另外，本研究經過測序，將突變體基因確定為PHYB，但還需要探究該基因的缺失突變體表型，以進行基因功能驗證，進一步完善本研究.

4 結論

通過EMS誘變豫谷1號，篩選獲得了谷子早抽穗突變體jt1242-14b.突變體表現為抽穗期提前，莖稈變細，葉片變窄、變短.遺傳分析表明，該突變性狀受隱性單基因控制.利用BSA基因定位法，將該基因定位在第9染色體上分子標記In4746和In9-11之間的4 447 kb內.經測序驗證，該突變基因很可能為PHYB.