廣西崇左叉葉蘇鐵野生和遷地保護種群的遺傳多樣性比較分析*

鄧麗麗,唐健民,鄒 蓉,楊一山,陳泰國,2,韋 霄**

(1.廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所,廣西桂林 541006;2.桂林醫學院藥學院,廣西桂林 541199)

蘇鐵類植物是現存種子植物中最原始的類群,是地球上古老的孑遺植物[1-3]。蘇鐵屬(Cycas)植物目前已發現120種[2],我國共有蘇鐵屬植物25種[4],均被列為國家一級重點保護野生植物,其中8種為瀕危物種[5]。廣西作為蘇鐵植物的主要分布區之一,區內大多數蘇鐵屬物種都被列入極小種群野生植物(PSESP)[6,7]。叉葉蘇鐵[Cycasbifida(Dyer) K.D.Hill]主要分布于中國廣西以及越南北部,葉呈叉狀二回羽狀深裂[8,9]。叉葉蘇鐵被用作蘇鐵科植物的現代地理分布、系統演化的研究對象,對研究中國與東南亞熱帶植物的區系地理、古植物和古氣候以及與動物的協同進化具有重要的價值[10]。此外,現代蘇鐵類植物的稀有性和高觀賞性,使其成為收藏家非常追捧的植物[8]。

物種的遺傳多樣性取決于基因突變、基因流動、遺傳漂變及自然選擇等引起的核苷酸序列變異[11,12],物種基因組間存在的差異對物種的進化和保護具有重要意義[13]。目前,多種分子標記方法被用于群體遺傳多樣性分析,如Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD)標記[14]、Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR)標記[15]、Sequence-Related Amplified Polymorphism (SRAP)標記[16]和Genic Expressed Sequence Tag-Simple Sequence Repeat (EST-SSR)標記[17]等。與其他分子標記相比,Simple Sequence Repeat (SSR)標記是一種共顯性標記類型,能準確估計遺傳多樣性。SSR標記因其具有數量大、分布廣泛均勻、靈活性高、多態性豐富、成本低、易推廣以及重復性好等優勢而得到廣泛應用[18,19]。SSR標記被廣泛應用于植物遺傳多樣性分析,使用SSR標記方法對叉葉蘇鐵遺傳多樣性進行分析,能準確地估計叉葉蘇鐵DNA水平上真實的遺傳變異,從而揭示叉葉蘇鐵的遺傳多樣性和遺傳變異,為叉葉蘇鐵的資源保護和選育提供參考[20,21]。

目前,業界僅有關于叉葉蘇鐵的形態[22]、分類[23]、種群結構[24]等方面的少量研究。龔奕青[25]對廣西龍州和憑祥的3個叉葉蘇鐵種群開展了遺傳分化和譜系地理研究,而廣西崇左市作為叉葉蘇鐵的主要分布區,對該區域內叉葉蘇鐵種群的遺傳多樣性研究還未開展。叉葉蘇鐵野生種群少,人為盜采嚴重,野生生境遭受破壞,該物種的遺傳多樣性遭受嚴重威脅,急需對其遺傳多樣性進行保護。遷地保護是保護野生物種種群延續的有效方法[26],桂林植物園已對崇左市左州鎮排乳屯叉葉蘇鐵進行了遷地保護。但是,遷地保護種群的建立根本上是人為建立的小型獨立種群,存在采樣不全、重復引進、資源不清或種植條件差等問題,因此遷地保護的瀕危植物同樣面臨遺傳多樣性下降或滅絕的危險[27]。綜上所述,本研究采用SSR標記方法,選擇廣西崇左規模較大的叉葉蘇鐵野生種群和桂林植物園的遷地保護種群為研究對象,探究叉葉蘇鐵野生種群和遷地保護種群的遺傳多樣性豐富度和遺傳結構,為廣西崇左叉葉蘇鐵的遺傳多樣性保護提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

2022年對廣西崇左市4個叉葉蘇鐵野生種群和1個遷地保護種群進行采樣(表1),其中YCLL、MB和MALL 3個種群為位于保護區外的野外種群,PR種群為白頭葉猴保護區內的野生種群,ZWS種群為桂林植物園的遷地保護種群。5個種群共采集叉葉蘇鐵樣品109份,采集時選擇完整無病蟲害的叉葉蘇鐵葉片,放置于裝有變色硅膠的密封袋中干燥保存,對每份樣品做好標簽,并對采樣點進行GPS定位。植物樣品由廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所韋霄研究員鑒定為叉葉蘇鐵[Cyas bifida (Dyer) K.D.Hill]。

表1 叉葉蘇鐵種群的采樣信息

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和檢測

使用改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法對叉葉蘇鐵葉片進行DNA提取,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度,并用Nanodrop 2000微量分光光度計(賽默飛世爾科技公司)檢測DNA濃度和質量,將合格的DNA樣品保存于-20 ℃冰箱用于后續實驗。

1.2.2 引物篩選

本研究從全基因組序列中篩選得到96對引物,一共篩選出6對擴增成功、峰形良好的引物(表2)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京合成部合成。

表2 SSR引物信息

1.2.3 PCR擴增及測序

在Veriti 384 PCR儀上進行PCR擴增反應,反應體系(10 μL):DNA(～20 ng)1.0 μL,2×Taq PCR Master Mix 5.0 μL,ddH2O 3.0 μL,濃度10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL。PCR擴增反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,62-52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,10個循環,每個循環下降1 ℃;95 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,25個循環;72 ℃末端延伸20 min,4 ℃保存。PCR產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,參照ABI 3730xl上機操作流程進行熒光毛細管電泳測序。

1.3 數據分析

1.3.1 原始數據導出

使用GeneMarker分析軟件進行基因型數據的讀取,并導出Excel基因型原始數據和PDF分型峰圖文件。

1.3.2 遺傳多樣性及遺傳分化

使用軟件GenAlEx version 6.501計算SSR位點以及群體的各項遺傳多樣性指標,包括觀測等位基因數(Number of Observed Alleles,Na)、有效等位基因數(Number of Effective Alleles,Ne)、Shannon信息指數(Shannon′s Information Index,I)、觀測雜合度(Observed Heterozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected Heterozygosity,He)、遺傳分化系數(Genetic Differentiation Coefficient,Fst)、固定系數(Fixed index,F)和基因流(Gene Flow,Nm),使用Powermarker v3.25計算所有位點多態性信息指數(Polymorphism Information Content,PIC)。

1.3.3 遺傳結構及分子方差分析

利用Structure 2.3.4對109個叉葉蘇鐵樣本進行群體結構分析,設置K=1-20,Burn-in周期為10 000,MCMC (Markov Chain Monte Carlo)設為100 000,每個K值運行20次,并利用在線工具Structure Harvester算出最佳DeltaK值(即為最佳群體分層情況)。根據最佳K值結果作圖,使用Clummp和Distruct軟件制圖。使用GenAlEx version 6.501進行分子方差分析(AMOVA)。

1.3.4 聚類分析和主坐標分析

利用Powermarker v3.25軟件計算各群體間的遺傳距離,利用非加權組平均法(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means,UPGMA)進行聚類分析,并繪制環狀聚類圖和樹狀聚類圖,使用GenAlEx version 6.501進行主坐標分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)。

2 結果與分析

2.1 SSR引物多態性分析

由SSR引物多態性分析結果(表3)可知,6對引物在109個樣本中共檢測出24個等位基因,其中,最小觀測等位基因數為3.000,最大觀測等位基因數為6.000,平均每個位點觀測等位基因數為4.000。有效等位基因數總數為12.461,平均每個位點有效等位基因數為2.077。Shannon信息指數為0.286(GZST013)-1.186(GZST088),平均值為0.846。觀測雜合度最大為0.679(GZST019),最小為0.000(GZST002),平均值為0.355。期望雜合度最小為0.130(GZST013),最大為0.642(GZST088),平均值為0.482。多態性信息指數為0.124(GZST013)-0.591(GZST088),平均值為0.418。6對引物中除GZST013不存在顯著性差異,其余5對引物均存在顯著性差異。綜合來看,引物GZST088的多態性較好。

表3 SSR引物的多態性

2.2 叉葉蘇鐵群體遺傳多樣性分析

2.2.1 群體間的遺傳多樣性分析

對叉葉蘇鐵群體的遺傳多樣性進行分析(表4),4個野生種群中,MALL的觀測等位基因數最高(3.333),PR的觀測等位基因數最低(2.500),平均值為2.875。YCLL的有效等位基因數最高(1.855),PR最低(1.662),平均值為1.796。Shannon信息指數平均值為0.637,MALL的最高(0.711)。觀測雜合度最高是MB(0.402),最低是PR(0.269),平均值為0.363。PR的期望雜合度最低(0.324),MALL最高(0.394),平均值為0.373。綜合來看,PR的各項指標數值在4個野生種群中最低,遺傳多樣性水平最低。遷地保護種群(ZWS)的Shannon信息指數和期望雜合度值高于4個野生種群的平均值,但Shannon信息指數略低于MALL,而期望雜合度值略低于MALL和YCLL野生種群。

表4 叉葉蘇鐵群體間的遺傳多樣性

2.2.2 群體的遺傳分化

對5個叉葉蘇鐵種群的遺傳變異進行AMOVA(圖1),結果表明叉葉蘇鐵種群間的遺傳變異占25%,個體間的遺傳變異占7%,而大多數的遺傳變異來源于個體內(68%)。

圖1 叉葉蘇鐵群體間分子方差分析

對叉葉蘇鐵種群間的基因流和遺傳分化系數(表5)進行分析,5個種群中YCLL與MB間的基因流最大(26.635)且遺傳分化系數最小(0.009),PR與MB間的基因流最小(0.952)且彼此間的遺傳分化系數最大(0.208),ZWS與4個野生種群間的遺傳分化系數和基因流分別為0.119-0.200和0.998-1.855。

表5 叉葉蘇鐵群體間的基因流(上三角)和遺傳分化系數(下三角)

2.2.3 叉葉蘇鐵群體遺傳結構分析

對叉葉蘇鐵5個種群進行遺傳結構分析,根據最大似然原則,當K=2時,DeltaK最大(圖2)。對野生種群和遷地保護種群共109份叉葉蘇鐵樣品進行Structure分析(圖3),本研究中的109份叉葉蘇鐵樣品按地理位置大致分為2種基因型,其中MALL、YCLL和MB 3個野生種群基因型相近,分為一類,而ZWS與PR更為接近,二者可分為一類。

圖2 最佳類群數(K)與推斷值(Delta K)的變化趨勢

圖3 叉葉蘇鐵的Structure分析(K=2)

2.2.4 叉葉蘇鐵的聚類分析和主坐標分析

對109份叉葉蘇鐵樣品進行UPGMA聚類分析[圖4(a)],109份樣品主要分為兩大類(類1和類2),類1包含了ZWS和PR的所有樣品,在類1中,多數樣品按地區分類,但各有2個和1個樣品穿插在彼此的分組中;類2包含MALL、YCLL和MB 3個野外種群的所有樣品,在類2中,3個種群的樣品相互穿插,也說明了這3個種群遺傳距離更近,存在較高的基因交流現象。

圖4 叉葉蘇鐵的UPGMA聚類結果

對5個叉葉蘇鐵種群進行UPGMA聚類分析[圖4(b)],結果顯示5個種群可分為2個亞群,其中一個亞群包括ZWS和PR,這2個種群的遺傳距離較近;另一個亞群包括MALL、YCLL和MB 3個野外種群,在這個亞群中,YCLL和MB種群的遺傳距離最近。

對叉葉蘇鐵的109份樣品進行PCoA(圖5),其中坐標代表個體的位點遺傳變異在不同維度的差異程度。由圖5可知第一主坐標貢獻率為27.42%,第二主坐標貢獻率為17.92%,累積貢獻率達到45.34%,可代表原始數據的主要信息。圖5中5個種群的109個樣本個體可以明顯分為2個組,其中MALL、YCLL和MB 3個野外種群的樣品距離更近,聚為一組;而ZWS和PR距離更近,為另一個組。

圖5 109個叉葉蘇鐵樣本的主坐標分析

3 討論

3.1 叉葉蘇鐵遺傳多樣性

本研究使用6對引物對叉葉蘇鐵遺傳多樣性進行了分析,6對引物中,僅GZST013位點的多態性信息指數(0.124)是低度多態性位點(PIC≤0.25),其余5個位點均為中、高度多態性。遺傳多樣性能體現物種的進化潛力以及環境適應能力,物種的遺傳多樣性水平越高,適應環境變化的能力越強,反之越弱[28]。本研究叉葉蘇鐵野生種群遺傳多樣性分析結果顯示,Shannon信息指數平均值為0.637,期望雜合度的平均值為0.373,低于龔奕青[25]的研究結果(I=1.213,He=0.446);與其他同屬植物相比,叉葉蘇鐵期望雜合度平均值高于四川蘇鐵(C.szechuanensis,He=0.247)[29]和攀枝花蘇鐵(C.panzhihuaensis,He=0.328)[30],低于德保蘇鐵(C.debaoensis,He=0.484)[31]、多歧蘇鐵(C.multipinnata,He=0.497)[32]和臺灣蘇鐵(C.taiwaniana,He=0.703)[33]?？傮w來看,崇左市叉葉蘇鐵遺傳多樣性水平較低,4個野生種群中的MALL和YCLL 2個種群的遺傳多樣性較高,但PR的遺傳多樣性較低,由于種群間的遺傳多樣性不平衡,部分較低的遺傳多樣性會使得整體的遺傳多樣性水平降低。

大量研究結果表明遷地保護可作為保護野生物種居群延續的有效方法[26]。本研究中PR位于廣西崇左白頭葉猴國家級自然保護區中,該種群的叉葉蘇鐵植株及其生境均已受到保護。由于遷地保護種群ZWS引種于野生種群PR,Structure分析結果也顯示,ZWS與PR遺傳距離非常近。在遷地保護種群和野生種群的比較中,ZWS期望雜合度值高于4個野生種群的平均值,但略低于MALL和YCLL野生種群;Shannon信息指數也高于4個野生種群的平均值但略低于野生種群MALL,說明桂林植物園對叉葉蘇鐵進行遷地保護在一定程度上能有效地保護其遺傳多樣性。但還需要繼續開展其遷地保護的種質資源的收集,特別加強對遺傳多樣性較高的MALL和YCLL種群資源的引種工作,以加強遷地保護種群的遺傳多樣性水平,這對保護崇左市叉葉蘇鐵具有重要的指導意義。

3.2 叉葉蘇鐵遺傳結構和遺傳分化

叉葉蘇鐵種群間的Fst平均值為0.134,ZWS與PR的遺傳分化水平達到中度(0.119),與另外3個野生種群間的Fst為0.165-0.200,達到高度分化水平[34],這可能是因為引種保護地與4個野生種群地理距離較遠,基因交流頻率低而形成了一定程度的遺傳分化。MALL、MB和YCLL 3個野生種群間的Fst為0.009-0.042,種群間分化較小,但這3個種群與PR間的Fst為0.194-0.208,均大于0.15,達到高度分化水平[34],導致這個現象的原因可能是MALL、MB和YCLL 3個野生種群間地理距離相對較近,存在基因交流的概率更大,從而使得這3個野生種群的遺傳分化小,遺傳距離更近。從Structure分析(圖3)來看,4個野生種群之間均存在相同的祖先,可能是經過長時間的進化加上人為砍伐和破壞導致了叉葉蘇鐵生境片段化,從而分化形成了2個分支,由于ZWS引種于PR,兩者的遺傳距離非常近,所以這兩個種群的遺傳結構極其相似。UPGMA結果(圖4)也顯示ZWS和PR間的遺傳距離非常近,兩者最先匯聚成一支。PCoA分析結果(圖5)也支持以上結論,即109份叉葉蘇鐵樣品可大致分為2類,ZWS和PR 2個種群可分為一類;而MALL、MB和YCLL 3個野生種群距離更近,為另一類。本研究中叉葉蘇鐵種群間的遺傳變異占25%,種群內的遺傳變異占75%,變異主要來源于種群內,種群水平的遺傳交流較低,發生這種現象的原因可能是:(1)由于叉葉蘇鐵種群數量減小,導致種群內積累的遺傳變異少;(2)叉葉蘇鐵花粉無法遠距離傳播,導致叉葉蘇鐵多為種群內雜交,種群內基因交流更為頻繁[35]。

4 結論

保護瀕危植物的棲息地是延長該物種生命周期及恢復野生種群的主要方法之一,4個野生種群中,MALL的遺傳多樣性表現最高,應作為野生種群的重點保護種群,由于叉葉蘇鐵種群少,建議在位于保護區外的MALL、MB和YCLL 3個野生種群的所在地均建立保護小區,以此更好保護其完整的遺傳多樣性。同時對叉葉蘇鐵種群進行動態監測和小種群生存概率方面的研究工作。此外,還需繼續開展崇左市叉葉蘇鐵遷地保護的種質資源收集工作,特別是加強MALL和YCLL種群資源的引種工作,以加強遷地保護種群的遺傳多樣性水平。叉葉蘇鐵為極小種群植物,其種質資源少,種群數量和個體都很少,需加強叉葉蘇鐵良種篩選、人工授粉、種苗培育、生物學特性、栽培技術方面的研究。最后,應加強叉葉蘇鐵野外回歸引種工作,開展就地回歸和異地回歸試驗,擴大叉葉蘇鐵種群數量,加大其遺傳交流,從而有效提高叉葉蘇鐵遺傳多樣性。