基于EST-SSR分子標記的廣西海倫兜蘭遺傳多樣性研究*

朱舒靖,鄒 蓉,柴勝豐,唐健民,唐鳳鸞,陳泰國,3,韋 霄**

(1.廣西師范大學生命科學學院,廣西桂林 541006;2.廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所,廣西桂林 541006;3.桂林醫學院藥學院,廣西桂林 541000)

蘭科(Orchidaceae)兜蘭屬(Paphiopedilum)的所有植物已被列入《瀕危野生動植物物種國際貿易公約》(CITES)附錄Ⅰ和我國2021年版的《國家重點保護野生植物名錄》,同時也是《中華人民共和國野生植物保護條例》的重點保護對象,備受國際的關注與保護[1]。海倫兜蘭(Paphiopedilumhelenae)是蘭科兜蘭屬植物,為多年生常綠草本植物,葉色深綠,花色金黃,觀賞價值非常高,是雜交育種不可多得的種質資源材料,其經濟價值和科研價值極高[2]。海倫兜蘭于1996年首次被報道,發現于越南北部高平省;而我國于2005年在廣西西部發現有分布,并于2007年正式報道,其種群數量非常少,首次報道時僅發現35株。海倫兜蘭為地生蘭花,主要生長在石灰巖地區,分布地海拔較高,常常分布在近山頂處常綠闊葉林的懸崖石縫土壤中[3]。

自然種群之間和內部的遺傳變異對物種的長期生存尤為重要,尤其是瀕危物種。了解瀕危物種的遺傳多樣性與變異,有助于揭示其進化機制和瀕危原因,對其保護和管理至關重要[4,5]。因此,對海倫兜蘭的遺傳多樣性與變異進行系統的研究,可為其種質資源、良種選育和保護策略等提供有效參考,避免海倫兜蘭植物種質資源瀕臨滅絕。簡單重復序列(SSR)或微衛星DNA是由1-6個單元核苷酸組成的重復的DNA序列,普遍存在于原核生物和真核生物的基因組中[6]。SSR標記技術具有多等位基因、共顯性、信息量大、相對豐度高、成本低和試驗重復性好等特點,在植物遺傳分析方面具有廣泛的應用前景[7]。目前,有眾多研究者通過SSR分子標記對蘭科植物的遺傳多樣性進行了研究,如春蘭品種與其園藝關系[8]、變異品種鑒定[9]、大花蕙蘭(Cymbidiumhybrid)遺傳多樣性[10]、中國蘭花的親緣關系與遺傳多樣性[11]等,而關于海倫兜蘭遺傳多樣性與遺傳結構的研究尚未見報道。因此,本研究采用EST-SSR分子標記技術對海倫兜蘭遺傳多樣性與遺傳結構進行評估,并提出相應的保護策略,以期為該種質資源的有效保護與利用提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

海倫兜蘭采自廣西邦亮長臂猿國家級自然保護區的靖西市(JX)、靖西市四角山(SJS)居群,廣西弄崗國家級自然保護區的三聯站(SLZ)、民強站(MQZ)居群以及廣西崇左市龍州縣下凍鎮春秀村(LZ)居群(表1),每個居群采集7-22個植株(每個植株間距離在2 m以上),每個植物選擇2片健康無病蟲害的葉片。將采集植株的新鮮葉片用變色硅膠干燥,共71份樣本。樣品由廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所韋霄研究員鑒定為海倫兜蘭(Paphiopedilumhelenae)。

表1 海倫兜蘭5個居群的詳細信息

1.2 DNA提取和EST-SSR分型

使用改良十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[12]提取樣品的DNA,并利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行質檢。本研究選取Xu等[13]利用亨利兜蘭(P.henryanum)開發的34對引物進行引物篩選,其中大部分引物在兜蘭屬的7個物種中均具有良好的擴增效果[13]。選取16個樣本進行引物篩選驗證,最終篩選出10對擴增成功的、峰形良好的引物開展遺傳多樣性分析(表2)。PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳擴增采用20 μL反應體系:1 μL模板DNA(30 ng/μL),10 μL 2×TaqPCR Marter Mix,正、反引物各0.5 μL (10 μmol/L),8 μL ddH2O補齊至20 μL。PCR擴增程序:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,51-58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環;最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存[14]。使用GeneMapper v4.1軟件在ABI 3730 xl DNA分析儀(Applied Biosystems,美國)上讀取SSR基因型。

表2 SSR 引物信息 Table 2 SSR primer information

1.3 數據分析

1.3.1 遺傳多樣性與遺傳分化

使用GeneAlEx v6.5.1[15]軟件計算所有位點和每個居群的觀測等位基因(Na)、有效等位基因(Ne)、香農信息指數(I)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、基因流(Nm)、居群間遺傳分化系數(Fst)和多態位點百分比(PPB),利用PowerMarker[16]軟件計算所有位點的多態性信息含量(PIC)。

1.3.2 遺傳結構分析

采用3種方法分析群體間的遺傳結構:(1)使用主坐標分析(PCoA)中的主坐標成分來說明個體間的遺傳距離;(2)利用GeneAlEx v6.5.1軟件進行分子方差分析(AMOVA),研究居群間和居群內的總遺傳變異;(3)使用Structure[17]對全部個體進行貝葉斯聚類分析,設置K=1-20,Burn-in周期為10 000,MCMC (Markov Chain Monte Carlo)設為100 000,每個K值運行10次,并利用在線工具Structure Harvester計算出最佳ΔK值,即為最佳群體分層情況,根據最佳K值作圖。

1.3.3 系統發育分析

利用PowerMarker軟件計算兩兩樣品之間的Nei′s遺傳距離,基于Nei′s遺傳距離矩陣,采用MAGA v6[18]的非加權組平均法(UPGMA)構建所有個體的系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 EST-SSR標記多態性

利用10對引物對海倫兜蘭進行多態性分析,結果見表3。由表3可知,71份樣品共檢測到31.8個觀測等位基因,觀測等位基因數為1.600 (DL034)-5.600 (DL020),平均每個位點存在3.180個等位基因;有效等位基因數為1.177(DL034)-4.101(DL020),平均值為2.191;香農信息指數為0.208 (DL034)-1.510 (DL020),平均值為0.801;觀察雜合度為0.153 (DL034)-0.771(DL032),平均值為0.490;期望雜合度為0.124(DL034)-0.740 (DL020),平均值為0.451;EST-SSR基因多態性信息含量為0.154 (DL034)-0.817 (DL020),平均值為0.444。綜上,本研究使用的EST-SSR引物大部分多態性良好,可用于后續試驗進行遺傳信息分析,其中引物DL034多態性顯著低于其他引物。

表3 10對引物多態性分析

2.2 遺傳多樣性分析

海倫兜蘭5個居群的遺傳多樣性信息結果見表4。由表4可知,觀測等位基因數為2.900 (JX、MQZ)-3.600 (SLZ),平均值為3.180。有效等位基因數為2.020 (SLZ)-2.316 (JX),平均值為2.191。香農信息指數為0.749(MQZ)-0.861(JX),平均值為0.801。觀測雜合度為0.404 (SLZ)-0.603 (LZ),平均值為0.490。期望雜合度為0.403 (SJS)-0.503 (JX),平均值為0.451。多態位點百分比為90%-100%,平均值為92%。綜上,海倫兜蘭的遺傳多樣性較豐富,其中靖西市(JX,I=0.861、He=0.503、PPB=90%)和龍州縣下凍鎮春秀村(LZ,I=0.855、He=0.501、PPB=100%)居群的遺傳多樣性較高,廣西邦亮長臂猿國家級自然保護區的靖西市四角山(SJS,I=0.773、He=0.403、PPB=90%)居群的遺傳多樣性相對較低。

表4 海倫兜蘭5個野生居群的遺傳多樣性水平

2.3 遺傳結構與分化

分子方差分析結果(表5)表明,海倫兜蘭居群間的遺傳變異僅占7%,而居群內遺傳變異占93%,說明海倫兜蘭的變異主要發生在居群內,居群內遺傳分化程度較高,居群間遺傳分化程度較低。由表6可知,各居群間遺傳分化系數(Fst)為0.022-0.127,遺傳分化程度不高。其中,SJS與LZ、SLZ以及SLZ與LZ居群之間的Fst值均小于0.05,表現出低遺傳分化,表明這些居群之間具有較近的親緣關系;而其他各個地區之間的遺傳分化系數均為0.050-0.150,表現出中等遺傳分化;SJS與JX的遺傳分化系數最高(0.127),表明這兩個居群間親緣關系最遠。海倫兜蘭居群間Nm值為1.718-11.103,平均值為4.916,基因流水平較高。

表5 海倫兜蘭群體的分子方差分析

表6 海倫兜蘭5個居群間遺傳分化系數(Fst,對角線下方)和基因流(Nm,對角線上方)

利用Structure軟件中的貝葉斯聚類方法對海倫兜蘭群體的遺傳結構進行分析,結果如圖1所示。當K=3時,ΔK取得最大值,表明海倫兜蘭5個居群的基因型可分為3種(圖1),但這3種基因型在基因池中分布不均且不能按照基因型分布(圖2)。

圖1 海倫兜蘭各居群群體結構分析的ΔK值分布

圖2 海倫兜蘭群體的遺傳結構

2.4 系統發育關系分析

基于Nei′s遺傳距離矩陣,采用UPGMA對71份海倫兜蘭樣品進行聚類分析(圖3)。結果顯示,2份JX和1份MQZ聚為一支(Ⅰ);剩余的5份JX、11份LZ、11份MQZ、22份SLZ和12份SJS聚為一支(Ⅱ),Ⅱ支又劃分為Ⅱ-1、Ⅱ-2,其中Ⅱ-1包括4份LZ和1份SLZ,Ⅱ-2包括5份JX、8份LZ、11份MQZ、21份SLZ和12份SJS。LZ居群少數樣品與SLZ居群1份樣品親緣關系近,JX居群少數樣品與MQZ居群1份樣品親緣關系較近。主坐標分析結果顯示,第一主坐標和第二主坐標分別占總遺傳變異的15.57%和11.31%(圖4)。綜上可知,UPGMA聚類分析結果與PCoA主坐標分析結果基本一致,即海倫兜蘭明顯劃分為3支,但未按照地理位置明顯劃分。

圖3 海倫兜蘭種質資源遺傳關系的進化樹

圖4 海倫兜蘭群體主坐標分析

3 討論

3.1 遺傳多樣性分析

EST-SSR分子標記技術具有靈活性高、成本低、多態性豐富、重復性好等優勢,利用該技術來分析海倫兜蘭的遺傳多樣性,其結果更能反映DNA水平上真實的遺傳變異,為海倫兜蘭的品種選育與保護提供參考依據[19,20]。遺傳多樣性是物種進化潛力和抵抗外界環境變化的一種體現,物種遺傳多樣性越豐富,其適應外界環境的能力越強,反之則越弱[21]。本研究結果表明,海倫兜蘭的微衛星位點均表現出較高的多態性,PIC平均值為0.444,比野生春蘭(Cymbidiumgoeringii)的多態性(PIC=0.805 0)低[22]。海倫兜蘭的PPB平均值為92%,高于硬葉兜蘭(P.micranthum,PPB=81.25%)[23]、貴州南部的8種野生兜蘭(PPB=80.26%)[24]和貴州北盤江流域6種兜蘭(PPB=84.54%)[25]的多態性平均水平。此外,海倫兜蘭的遺傳多樣性平均水平(He=0.451、I=0.801)低于蕙蘭(C.faberi,He=0.600 0、I=1.049 0)[26],高于帶葉兜蘭(P.hirsutissimum,He=0.420 5、I=0.742 5)[21]、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale,He=0.344、I=0.508)[27],表明海倫兜蘭具有中等遺傳多樣性。

植物的遺傳多樣性通常取決于其繁育系統和生活型,稀有和特有物種的遺傳多樣性水平低于廣布物種,一般而言,分布廣、種子由動物傳播的多年生草本植物具有較高的遺傳多樣性[28,29]。海倫兜蘭為地生型草本植物,分布范圍有限,種群數量極少[2],本研究結果顯示海倫兜蘭具有中等遺傳多樣性。SJS和SLZ居群遺傳多樣性相對較低,可能是由于棲息地遭受破壞、長期保持小群體規模和群體破碎化導致遺傳多樣性喪失[1,3,30]。楊舒婷等[31]研究發現,海拔越高,物種的遺傳多樣性也越高。海倫兜蘭對生境的要求極高,分布地區海拔較高,尤其是JX居群位于海拔790 m,人為干擾相對困難,因此保留較高的遺傳多樣性。

3.2 遺傳結構和遺傳分化

從遺傳結構上來看,海倫兜蘭遺傳變異僅有7%來自居群間,絕大部分遺傳變異發生在居群內,這與徐言等[21]研究發現的兜蘭屬植物遺傳變異主要發生在居群內的研究結果一致。海倫兜蘭具有中等的遺傳多樣性,群體間遺傳變異較低,可能與海倫兜蘭具有艷麗的花色而實施欺騙性授粉策略以及具有沙塵狀的種子等特征有關,這些特征增加了群體內的基因交流頻率[32]。董麗敏等[33]研究表明,Fst值為0.00-0.05的群體,各亞群間分化可忽略不計;Fst值為0.05-0.15時,則被視為中度分化;Fst值為0.15-0.25時,則被認為是高度分化。本研究發現,海倫兜蘭遺傳分化處于中等水平(Fst=0.071),低于六盤北野生兜蘭屬植物(Gst=0.536 9)[25]。此外,基因流是影響種群遺傳分化的重要因素之一[34]。海倫兜蘭的基因流較高(Nm=4.916),較高的基因流可以阻止由遺傳漂變引起的種群遺傳分化。種群間的基因流動一般受到種子和花粉傳播的限制[35]。蘭花的典型特征是種群遺傳分化低,這通常歸因于蘭花多為塵埃狀種子,雖然大多數蘭花種子通常落在母株附近,但它可以依賴風進行長距離傳播[36]。

3.3 系統發育關系

本研究中UPGMA聚類樹、Structure和PCoA的分析結果基本一致,海倫兜蘭可分為3支,但并未嚴格按照地理位置劃分,這與秦惠珍等[37]對白花兜蘭(P.emersonii)的研究結果一致,說明海倫兜蘭5個居群之間遺傳分化較小,親緣關系較近。JX居群與MQZ居群在地理位置上較SJS遠,但JX居群與MQZ居群的部分個體優先聚集在一起;同理LZ部分個體優先與SLZ居群部分個體聚集在一起,而不是與同一個保護區內距離較近的MZQ居群聚集在一起。出現這一結果的原因可能是由于各居群間基因交流頻繁或是受到人為活動的影響,如海倫兜蘭在公開后被非法大量采集,導致海倫兜蘭植株在不同地區之間遷移。

4 結論

本研究結果表明,海倫兜蘭的遺傳多樣性(He=0.451,I=0.801)處于中等水平;JX和LZ這兩個居群的遺傳多樣性較高,應作為重點保護單元進行保護;絕大多數遺傳變異存在于居群內,僅有7%的遺傳變異存在于居群間,居群內的遺傳變異大于居群間的變異。目前,除龍州縣下凍鎮春秀村的LZ居群外,其他居群(JX、SJS、SLZ和MQZ)均在保護區內。因此,對LZ居群,林業部門應盡快建立保護小區;而對JX、SJS、SLZ和MQZ居群應加強保護區建設,加大管護和巡護力度,避免生境破壞和人為采挖。此外,海倫兜蘭分布區狹窄,種群個體數量極少,抗干擾能力弱,為保護其遺傳多樣性,有必要開展人工授粉,促進種群的有性繁殖,防止物種退化,建議從居群間選擇有代表性植株的子代進行遷地保護,最大限度地保護其種群的遺傳多樣性。