非洲豬瘟疫苗研究進展

時云朵，孫 豪，曹恬雪，鄭燦財

（1.四川省水產學校，成都 611730；2.雅安市農業農村局，四川 雅安 625000；3.資陽市雁江區農業農村局，四川 資陽 641399；4.四川省農業規劃建設服務中心，成都 610041）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種豬的傳染病，于1921 年首次在肯尼亞被發現[1]，因其臨床癥狀與傳統豬瘟高度相似，且發現于非洲而被命名為非洲豬瘟。目前，全球ASF疫情復雜嚴峻，多國發生ASF 疫情，自2018 年8 月以來，我國先后發生多起ASF疫情，嚴重威脅生豬產業發展。為全力做好疫情防控，世界多國開展了ASF疫苗研究，我國也緊急開展了疫苗、免疫機制等科技攻關，對ASFV的基因組和免疫機制等方面的研究取得了較大進展，為ASF的疫苗研究奠定基礎。本文概述了ASF疫苗研制面臨的挑戰和研究進展，為ASF疫苗開發提供參考。

1 非洲豬瘟疫苗研制面臨的挑戰

1.1 非洲豬瘟病毒的形態與結構

ASFV呈20面體對稱，直徑為175～215 nm，由外囊膜、衣殼、內囊膜、核殼和類核組成。外囊膜的形態與細胞質膜的“單位膜”特征相似，通過宿主細胞膜獲得外囊膜[2]。衣殼有17 280 個蛋白質，1 個主衣殼蛋白p72 與4 個次衣殼蛋白（M1249L、p17、p49 和H240R）構成5 個不對稱子和3 個對稱子結構；次衣殼蛋白形成一個復雜的網絡，通過將鄰近的衣殼體連接在一起來穩定衣殼，形成衣殼的骨架[3]。內囊膜呈單層脂質膜樣，源于宿主細胞內質網，含有蛋白p12、p17、p54 和pE248R 等[4]。核殼是一層厚約30 nm的蛋白層，圍繞著類核，主要由蛋白pS273R 和聚蛋白pp220 及pp62 的加工產物構成；蛋白pp220被加工為蛋白p150、p37、p34和p14 等，pp62 可衍生為蛋白p35 和p15 等，組成核殼的6 種主要成分，占病毒粒子總質量的32%[4]。上述結構細節揭示了ASFV 結構穩定性和組裝的基礎，為ASF疫苗研發開辟了途徑。

1.2 非洲豬瘟病毒具龐大基因組

ASFV 屬非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，是唯一雙鏈閉合線性DNA 蟲媒病毒[5]。1995 年首次完成ASFV 的全基因組測序[6]，其基因組的末端是發卡環結構，緊鄰末端的是由串聯重復序列和多基因家族構成的可變區，中間部分則是比較穩定的基因區[7]?？勺儏^基因拷貝數的變化是造成不同地區ASFV 分離株基因組大小存在差異的主要因素[8]，根據p72基因末端核苷酸的差異分析，現已鑒定出24種ASFV基因型，其中基因1型、2型和8型毒力最強，我國首次發現的ASFV毒株（SY18株）屬于基因2 型[9]。ASFV 的DNA 分子長度為170～193 kb，含150～167 個開放閱讀框，編碼150～200 種蛋白質[10]，編碼蛋白中已知功能的數量相對較少，制約了ASFV的疫苗研究。

1.3 非洲豬瘟病毒的免疫逃逸機制

ASFV 能在自然宿主軟蜱和野豬體內復制，弱毒株能引起豬的持續性感染，而絕大部分滅活疫苗無保護作用，即使添加新型免疫佐劑也不能提高滅活疫苗的保護力，提示ASFV具有逃避宿主防御系統的有效機制。ASFV 基因組不具有感染性，主要在巨噬細胞的胞漿內進行復制，是一個高度受調控的過程[11]。ASFV 編碼許多調節宿主細胞對病毒感染應答的蛋白，其主要策略是調節感染巨噬細胞的信號傳導途徑，從而干擾大量免疫調節基因的表達。如在ASFV 感染早期表達的A238L能夠抑制宿主細胞NF-κB和NFAT信號通路[10]，從而調節宿主基因表達；而在感染晚期表達的凋亡抑制蛋白pA224L 能夠激活NF-κB 信號通路，通過抑制細胞凋亡，促進ASFV 感染細胞的存活，最終利于病毒自身的繁殖與擴散。同時，ASFV感染過程中表達的pDP71L能促進翻譯起始因子eIF2a磷酸化，使宿主細胞持續合成蛋白質，抑制自噬體的形成，并抑制細胞凋亡，從而促進病毒在細胞內的大量復制[10]。目前，對ASFV的研究仍存在較大空白，特別是免疫逃逸機制。持續深入研究ASFV編碼蛋白鑒定和蛋白功能，有助于了解ASFV編碼蛋白與宿主細胞間的相互作用機制，為研發ASF疫苗提供理論基礎。

2 非洲豬瘟疫苗類型

2.1 滅活疫苗

滅活疫苗是采用物理或化學方式消除病原微生物的致病性，保留免疫原性而獲得的疫苗。因制作滅活疫苗的技術成熟，最早被用在ASF疫苗的研制上，但不能提供有效的保護性。即使S.Blome 等[12]將當時最先進的免疫佐劑（Polygen、Emulsigen-D）加入ASFV滅活制劑后免疫仔豬，雖免疫豬均產生了特異抗體，但未觀察到免疫保護作用，還輕微加速了臨床過程。但開發新型的免疫佐劑，仍是制作有效ASFV疫苗的新嘗試。

2.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是預防ASF 的潛力最大的疫苗。目前，主要有天然弱毒株疫苗、傳代培養弱毒株疫苗、基因缺失弱毒株疫苗。與滅活疫苗相比，弱毒疫苗能夠誘導強烈持久的細胞、體液免疫應答，同源保護率高，對免疫動物能提供較高水平的保護，但存在毒力返強的可能，臨床副作用嚴重，生物安全隱患較大。

2.2.1 天然弱毒株疫苗

目前，ASFV 的天然弱毒株有ASFV/NH/P68、OUR/T88/3、Lvl7/WB/Riel。研究表明，ASFV/NH/P68 能促進T 淋巴細胞與NK 細胞的活性，免疫接種后的豬能抵御ASFV/L60 毒株的攻擊[13]，但部分接種豬出現肺炎、流產等多重感染[14]。經OUR/T88/3 免疫接種后的豬能抵御OUR/T88/1、Benin 97/1和genotype X Uganda毒株的攻擊。隨著CD8+T淋巴細胞的消耗，免疫效果減退[15-16]，表明該疫苗的保護性存在CD8+T 淋巴細胞依賴性，且有異源保護的可能，但免疫的豬會出現發熱、關節腫脹等臨床癥狀。Lvl7/WB/Riel 減毒株經口服免疫野豬后能抵御Arm07 強毒株的攻擊，保護率達到92%，但該疫苗生產困難，且可產生高熱、肺炎、運動障礙等副作用。因此，生物安全風險限制了天然弱毒株作為防控疫苗的實際使用價值與可行性。

2.2.2 傳代培養弱毒株疫苗

ASFV可在豬源細胞系如Vero與CV1細胞內不斷傳代培養，降低其毒力。A.D.Sereda等[17]將經豬骨髓細胞傳代培養后的弱毒株接種豬，結果表明，弱毒株對同源強毒株的攻擊可以提供有效的保護。A.Lacasta 等[18]將經CV1 傳代致弱的E75CV1毒株免疫接種豬后，產生了與親本不同的免疫途徑，能抵御同源毒株的攻擊，但不能抵御異源毒株。西班牙、葡萄牙曾利用傳代致弱毒株免疫豬卻產生災難性后果。近年來，隨著分子生物學技術的進步，尤其是基因編輯技術的突破性進展，基于自然毒株弱化的方式已逐漸被淘汰，因此傳代培養弱毒株是未來有望推向市場的候選疫苗，俄羅斯研制的傳代細胞適應株（Arriah CV-1 株）已被歐盟作為重點研究的候選株[19]。

2.2.3 基因缺失弱毒株疫苗

利用基因編輯、同源重組等現代分子生物學技術敲除ASFV的毒力相關基因，獲得基因缺失毒株，用于疫苗研制。目前，研究主要集中在敲除免疫逃逸基因或與病毒復制有關的基因。M.V.Borca等[20]敲除ASFV-G10分離株的8D基因，獲得ASFVG-Δ8DR基因缺失株，通過肌肉注射和滴鼻接種的方式接種豬后，表現出與ASFV-G 相同的毒力，且病毒血癥值也沒有差異，表明8DR基因的缺失與ASFV-G 分離株的毒力明顯下降無關。而P. L. Monteagudo 等[21]敲除ASFV-BA71 分離株的EP402R 基因，獲得BA71ΔCD2 基因缺失株，免疫接種后，誘導特異性CD8 T 細胞識別同源株BA71、異源株E75 及ASFV-G，產生交叉保護作用。此外，V. O'Donnell 等[22]敲除ASFV-G07 株的9GL基因，獲得ASFV-G-Δ9GL基因缺失株，肌肉注射接種后，可以抵御同源毒株的攻擊，繼續敲掉UK基因，獲得ASFV-G-Δ9GL/ΔUK雙基因缺失株，接種后，對于同源毒株的攻擊提供100%的保護，且安全性比ASFV-G-Δ9GL更高。表明，在ASFV 基因缺失弱毒株疫苗研究時，為減弱毒力，提高保護性，要采取不同毒株敲除不同的基因或同一毒株同時敲除幾個基因的方式。因此，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所的Chen W.等[23]同時敲除ASFV 的7 個基因，構建ASFV 基因缺失弱毒株HLJ/18-7GD，免疫接種SPF 豬、商品豬和懷孕母豬，能抵御強毒株的攻擊，且未見返強，表明該基因缺失株具有較好的保護性和安全性，有望用于ASF防控中，但交叉保護性有待進一步驗證。

2.3 基因工程疫苗

2.3.1 亞單位疫苗

亞單位疫苗是利用特異性基因和蛋白的表達來產生特異性免疫應答的一類疫苗，具有安全性高、特異性強的特點。ASF亞單位疫苗主要是利用真核或原核細胞作為表達載體，表達具有中和表位的保護性抗原基因（如結構蛋白基因p12、p30、p54、p72、pp62 和膜蛋白基因CD2v 等），產生的蛋白質或多肽誘導機體產生中和抗體，然而已研發的亞單位疫苗尚不能有效抵御強毒株的攻擊。G.P.Paulino等[24]認為ASFV的p72、p54及p30蛋白疫苗能夠抑制病毒的依附及內化過程，從而影響病毒復制，在病毒攻擊易感細胞后中和病毒，但免疫接種后的豬不能抵御強毒株的攻擊。J.G.Neilan等[25]利用桿狀病毒表達ASFV 的p30、p54、p72 及p22蛋白，免疫接種豬后均可有效誘導產生中和抗體，能延遲豬發病，但不能提供有效的免疫保護。J.K.Jancovich 等[26]用痘病毒表達ASFV的47個蛋白，免疫接種后，致死劑量的強毒株攻擊后，豬的血液和淋巴組織中病毒基因組水平顯著降低，表明單一抗原引起的機體免疫應答不足以提供全面的保護。M. V. Murgia 等[27]利用甲型病毒載體表達ASFV 的p30、p54 和p72 蛋白先行免疫接種啟動免疫原性，然后用減毒活病毒疫苗加強免疫的策略，能擴大對ASFV 表位的識別。齊艷麗等[28]利用大腸桿菌載體，結合細胞融合技術，獲得ASFV 的p54蛋白單克隆抗體，其最低效價為1∶2 500，與豬偽狂犬病等病毒不發生交叉反應，能識別p54 蛋白C端127-146aa 肽段。這表明鑒定更多的ASFV 保護性抗原，是提高亞單位疫苗免疫效力的思路。

2.3.2 DNA疫苗

ASF 的DNA 疫苗與亞單位疫苗相似，前者是將ASFV的抗原基因克隆入真核表達載體后，直接導入機體內，在宿主細胞內完成轉錄翻譯后產生抗原蛋白，從而激活豬特異性的體液免疫和細胞免疫。但其免疫原性與亞單位疫苗相似。J.M.Argilaguet等[29-30]和A.Lacasta等[31]研究發現，用ASFV的基因（P54、P30）構建的重組質粒DNA疫苗（pCMVPQ），接種小鼠后能誘導免疫反應，而免疫豬卻不能誘導免疫反應；為提高豬的免疫應答，將ASFV基因（P54、P30、sHA）與豬白細胞抗原Ⅱ特異性抗體或血凝素構建新的重組質粒DNA 疫苗（pCMVAPCH1PQ、pCMV-sHAPQ），可成倍增強豬的免疫應答，但不能抵御強毒株的攻擊；為增強誘導細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的效應，將ASFV 基因（P54、P30、sHA）及泛素融合構建重組質粒DNA 疫苗（pCMV-UbsHAPQ），在缺乏抗體的情況下誘導特異性T細胞應答，且部分免疫豬抵御了ASFV的致命攻擊，表明T細胞免疫與預防ASF密切相關；為證明存在具有保護潛能的CD8 T細胞決定因子，構建了包含4 000多個單個質?？寺〉谋磉_庫，每個克隆隨機包含ASFV基因組的Sau3AI限制性片段（p54、p30和血凝素）融合到泛素，用該表達庫免疫豬，對E75 強毒株致死攻擊的保護率為60%，表明ASFV基因組中存在額外的保護性決定因素。

2.3.3 病毒活載體疫苗

細胞免疫在ASF防控中扮演重要角色，而CTL的效應更是免疫效果的保證，因此，可利用病毒活載體在機體內持續復制與表達的特性研制病毒活載體疫苗。目前，常用腺病毒、偽狂犬病病毒、牛痘病毒或新城疫病毒作為載體構建疫苗，可有效刺激細胞免疫和CTL 效應。S. Lokhandwala等[32-33]研制的腺病毒載體的非洲豬瘟病毒抗原具有免疫原性，能引起豬強烈的免疫反應，但不能抵御強毒株的攻擊[34-35]。表明病毒活載體疫苗免疫保護效力需要進一步評價。

3 小 結

ASF在國內已得到有效控制，但其危害性不可忽視，研發安全有效的ASFV疫苗仍是當下亟須解決的問題。目前，在ASFV 基因序列、功能結構、入侵方式及宿主對其免疫應答等方面的研究取得了較大進展，并嘗試了多類別的疫苗研發，雖獲得了一定的效果，但仍沒改變尚無有效疫苗可用的現狀，應持續深入加強病毒與宿主相互作用的基礎性研究。弱毒活疫苗能持續誘導機體產生中和抗體，成為可提供高效、安全的保護性疫苗的首選，但毒力返強問題是其致命弱點，因此采用現代生物學技術，敲除毒力基因，獲得減毒基因缺失株是研制疫苗值得關注的研究方向。同時，更高效的免疫佐劑探索、更多的抗原位點識別研究及多種疫苗的相互聯用，也是今后值得關注的方向。此外，高效安全的特異性疫苗雖是防治ASF的最佳手段，但在疫苗研制舉步維艱的情況下，可采用針對病毒轉錄復制過程來抑制病毒增殖，如RNA 干擾技術、有機試劑阻斷技術等，同時要持續加強生物安全風險控制，切斷病毒傳播途徑，同樣也能達到防控ASF的目的。