變葉榕提取物不同組分總黃酮含量及抗氧化抗炎活性研究*

吳文明，習 丹，鄒婷婷，熊貽友，應 萍，胡建新

(1 江西省人民醫院(南昌醫學院第一附屬醫院)藥學部，江西 南昌 330006；2 華中科技大學生命科學與技術學院，湖北 武漢 430074；3 南昌大學撫州醫學院藥學院，江西 撫州 344000)

變葉榕(FicusvariolosaLindl. ex Benth.)為?？?Moraceae)榕屬(Ficus)植物，別名斑榕、牛奶仔、奶汁柴、椿云仔、常綠天仙果、山榕、芷葛等，灌木或小喬木，主要分布于浙江、江西、福建、廣西、廣東和湖南等地。變葉榕的根、莖和葉均可入藥。其葉經搗碎外敷可治跌打損傷，莖有清熱利尿之功效，根為主要的藥用部位[1]，味苦、辛，性溫，煎湯內服或浸酒擦拭，具有祛風、除濕、活血、止痛、補肝腎、強筋骨、催乳等功效，主治關節風濕疼痛，跌打損傷、胃痛、癤腫、乳汁不下等[2]。同時，變葉榕根作為藥食同源的藥材，多集中于福建、浙江、江西等省的畬族居民聚集地的民間使用，可以祛風濕、活血止痛、催乳等功效，具有良好的臨床療效[3-4]。目前，變葉榕的現代研究甚少，基于其功能主治及藥食同源的特點，本研究對產自我國的變葉榕根不同組分進行總黃酮含量測定及體外抗氧化抗炎活性評價，以期初步闡明其抗氧化抗炎的物質基礎及作用機制。

1 材料、試劑與儀器

1.1 藥材及細胞株

藥材于2020年12月采自廣西壯族自治區平南縣官成鎮，經江西省人民醫院藥學部副主任中藥師應萍鑒定為?？崎艑僦参镒內~榕(FicusvariolosaLindl. ex Benth.)的根，樣品保存于我科實驗室。小鼠巨噬細胞RAW264.7獲贈于江西省人民醫院臨床醫學研究所。

1.2 藥品及試劑

蘆丁(R189033-5g)，Aladdin；LPS(L2880-100mg)，Sigma；亞硝酸鈉(S818033-500g)，麥克林；氫氧化鈉(2110281)，西隴科學；硝酸鋁(A800886-500g)，麥克林；2，2’-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(d6132-1g)，麥克林；2，2-聯苯基-1-苦基肼基(D141336-250mg)，Aladdin；過二硫酸鉀(2107162)，西隴科學；鐵氰化鉀(P111564-100g)，Aladdin；L(+)-抗壞血栓(2110142)，西隴科學；1640培養基(含雙抗，SH30809)，GIBCO；胎牛血清(11011-8611)，四季青。其他化學試劑均為分析純。

1.3 儀 器

NP80 touch型超微量分光光度計，德國Implen公司；Multiskan Sky型酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；RE-2000B型旋轉蒸發儀、SHZ-Ⅲ型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；HH·SII-Z-S型電熱恒溫水浴鍋，上海新苗醫療器械制造有限公司；CO2培養箱，美國Thermo Fisher Scientific公司；PrimoVert型倒置顯微鏡，德國Zeiss公司；FBC1002型超純水機，青島富勒姆科技有限公司；Mettler AE240電子天平(萬分之一)，美國梅特勒-托利多儀器公司；DZF-6050AB真空干燥箱，邦西儀器科技有限公司。

2 方 法

2.1 變葉榕根各組分的制備

稱取干燥變葉榕根粉末100 g，用60%乙醇以料液比1∶10加熱回流提取3次，每次1 h，合并3次濾液，濃縮干燥得干膏8.48 g。將干膏溶于80 mL蒸餾水中，取8 mL留樣備用(FV-Z)，剩余部分依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，得到相應的提取部位：石油醚(FV-1)、乙酸乙酯(FV-2)、正丁醇(FV-3)和水(FV-4)，干燥后稱重，分別為0.95 g、1.28 g、2.45 g及3.80 g。用60%乙醇分別溶解配置成一定濃度的母液，置于4 ℃保存備用。

2.2 各組分總黃酮含量測定

2.2.1 蘆丁標準曲線繪制

參考朱偉等[5]報道的方法，精密配置0.2 μg·mL-1的蘆丁標準溶液。分別取0、0.25、0.5、1、1.5、2 mL的標準溶液于10 mL容量瓶中，加60%乙醇補至2 mL。分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，再分別加入質量分數為10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，之后再分別加入4% NaOH溶液4 mL，并加入60%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻靜置15 min，空白組為60%乙醇溶液，在波長500 nm處測定吸光度值，以蘆丁質量濃度(C，μg/mL)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.001 7x-0.003 2(R2=0.999 7)，如圖1所示。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2.2 樣品總黃酮含量測定

將各組分樣品配置成一定的濃度，按“2.2.1”項下的蘆丁標準曲線繪制方法，測定樣品的吸光度值，按以下公式(1)計算各組分黃酮含量相當于蘆丁的含量：

(1)

式中：C1——按標準曲線所求得的黃酮的濃度，μg/mL

C2——樣品的質量濃度，μg/mL

V2——所取樣品的體積，mL

2.3 抗氧化實驗

2.3.1 DPPH自由基清除活性測定

參照Yu等[6]報道的方法，略有改動。精密吸取濃度為6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的樣品溶液100 μL，分別加入100 μL 100 μg/mL的DPPH溶液，混勻后避光反應30 min，于酶標儀在517 nm波長處測定吸光度值As。配置溶劑空白組An(等體積甲醇代替DPPH溶液)和樣品空白組A0(等體積甲醇代替樣品溶液)，以VC為陽性對照，以上實驗重復3次。按以下公式(2)計算各組分對DPPH清除率，并計算IC50值。

(2)

2.3.2 ABTS自由基清除活性測定

參照王榮等[7]報道的方法，簡述如下：精密配置7.0 mmol/L的ABTS水溶液。稱取5 mg K2S2O8，加入7.5 mL超純水溶解，將二種溶液按體積比1∶1等量混合，得ABTS母液，置于4 ℃冰箱保存10～12 h備用。使用時，用無水乙醇稀釋至吸光度在(0.7±0.02) Abs范圍內。將各組分母液用無水乙醇稀釋至6.25、12.5、25、50、100 μg/mL，分別吸取100 μL，加入ABTS水溶液100 μL，避光反應30 min，在734 nm波長處測定吸光度值As。同時，設定溶劑空白組An(等體積乙醇代替ABTS溶液)和樣品空白組A0(等體積乙醇代替樣品溶液)，以VC為陽性對照，重復實驗3次。按“2.3.1”中公式(2)計算ABTS清除率，計算IC50值。

2.3.3 Fe3+還原能力測定

參照Mazor D等與朱偉等[8-9]報道的方法，分別取0.8 mL濃度為6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的樣品溶液，加入2 mL磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)和2 mL 1%鐵氫化鉀，50 ℃水浴20 min，加10%三氯乙酸2 mL，混勻離心，取2 mL上清液，依次加2 mL去離子水、0.4 mL 0.1%三氯化鐵，靜置5 min，在700 nm波長處測吸光度值，以VC為陽性對照，重復實驗3次。相同濃度下，測得的吸光度值越大表示還原能力越強，吸光度為0.5時的樣品濃度即為樣品的IC50值。

2.4 抗炎實驗

小鼠巨噬細胞RAW264.7培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中。取對數期細胞，以每孔2×104個細胞接種于96孔板中，培養24 h，移去培養基，設正常對照組An、LPS對照組Ac和樣品處理組As。正常對照組加入200 μL培養基；LPS組加入終濃度為1 μg/mL LPS的200 μL培養基；樣品組加入終濃度為1 μg/mL LPS和終濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的變葉榕不同組分樣品溶液200 μL，培養24 h后收集上清。參照文獻[10]方法，取100 μL細胞上清，加入50 μL Griess A試劑，37 ℃避光反應10 min，加入50 μLGriessB試劑，37 ℃避光反應10 min，540 nm處測定吸光度值A。NO釋放抑制率按以下公式(3)計算：

(3)

2.5 統計分析

采用excel和GraphPad Prism 9.0.0統計分析軟件對各組數據間的顯著性差異進行分析及IC50的計算。

3 結 果

3.1 各組分總黃酮含量測定結果

從表1數據可以看出，變葉榕根總提取物中黃酮含量為(162.26±2.74)mg/g，與其它4個組分的黃酮含量之間均存在明顯的差異；經過不同極性溶劑萃取后，乙酸乙酯組分FV-2的總黃酮含量最高，為(285.75±5.99)mg/g，明顯高于總提取物及其他3個組分，差異具有統計學意義(p<0.001)。FV-1和FV-4的黃酮含量較低，分別為(36.53±1.94)和(84.71±6.73)mg/g，明顯低于FV-Z和FV-2(P<0.001)。

表1 變葉榕根不同極性部位總黃酮含量

3.2 抗氧化實驗結果

3.2.1 DPPH自由基清除活性測定結果

由圖2可以看出，變葉榕根乙醇提取物FV-Z及組分FV-2、FV-3均具有明顯的DPPH自由基清除活性，且隨濃度的增大，活性增強，在濃度為100 μg/mL時，DPPH自由基的清除率均大于90%，其IC50值分別為25.62、15.53、19.75 μg/mL。VC作為陽性對照，其IC50值為8.47 μg/mL。組分FV-1和FV-4在濃度為25～100 μg/mL之間較弱的清除DPPH自由基的活性，但在低濃度6.25～12.5 μg/mL時，未見有活性，其IC50值分別為大于100和15.53 μg/mL。由此可見，變葉榕根清除DPPH自由基的活性部位集中在黃酮含量較高的提取物、乙酸乙酯和正丁醇組分，且乙酸乙酯組分的活性最強。

圖2 變葉榕各組分不同濃度對DPPH自由基的清除活性

3.2.2 ABTS自由基清除活性測定結果

從圖3可以看出，變葉榕總樣及其4個組分均具有不同程度的清除ABTS自由基的活性，但不同組分之間存在較大的差異。其中，FV-Z、FV-2和FV-3具有較強的ABTS自由基清除能力，在濃度為25～100 μg·mL-1范圍內，清除率均超過88%。在低濃度6.25～12.5 μg/mL時，各組分的清除能力顯著低于陽性對照VC(p<0.001)。石油醚組分FV-1對ABTS自由基的清除能力最弱，在濃度為100 μg/mL時，清除率僅為43.82%。各組分ABTS自由基清除活性IC50值分別為6.99、大于100、6.69、7.31和25.68 μg/mL。VC作為陽性對照，其IC50為2.31 μg/mL。由此可見，變葉榕總提取物、乙酸乙酯和正丁醇組分具有良好的ABTS自由基的清除能力，且乙酸乙酯組分活性最強。

圖3 變葉榕各組分不同濃度對ABTS自由基的清除活性

3.2.3 還原能力測定結果

從圖4可以看出，乙酸乙酯組分FV-2的還原能力最強，在濃度為50 μg/mL和100 μg/mL時，吸光度值分別為0.522和0.786，其還原能力明顯強于FV-Z(P<0.001)。正丁醇組分FV-3僅在濃度為100 μg/mL時，其吸光度值大于0.5，為0.522，其還原能力亦顯著強于FV-Z(P<0.001)。FV-2和FV-4的IC50值分別為56.52、88.63 μg/mL，其中，FV-2的IC50值接近陽性對照VC的IC50值(48.26 μg·mL-1)，可能是變葉榕根主要的還原活性部位。組分FV-Z、FV-1和FV-4的Fe3+還原活性較弱，其IC50值均大于100 μg/mL。

圖4 變葉榕各組分不同濃度的還原能力

3.2.4 NO抑制活性測定結果

本研究選擇的變葉榕不同組分的濃度為6.25～100 μg/mL，在此濃度范圍內，各組分均對RAW264.7細胞活力無明顯影響，說明各組分在選定的濃度范圍內無細胞毒作用。由圖5可以看出，在6.25～100 μg/mL濃度范圍內，變葉榕各組分對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO均有一定的抑制作用，且隨著濃度的升高，抑制作用增強。其中，石油醚組分FV-1和乙酸乙酯組分FV-2具有明顯的抑制LPS誘導RAW 264.7細胞釋放NO的活性，在100 μg/mL時，抑制率分別為59.33%和62.40%，且與石油醚組分FV-Z相比，差異具有統計學意義(p<0.001)。其他組分的抑制作用較弱，在100 μg/mL時，抑制率均低于50%。FV-1和FV-2的IC50值分別為66.89、63.07 μg/mL，其他組分IC50值均大于100 μg/mL。由此可見，變葉榕具有抑制LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO的活性部位主要為石油醚和乙酸乙酯組分。

圖5 變葉榕各組分不同濃度對LPS誘導RAW 264.7細胞NO釋放的抑制率

4 結 論

榕屬植物根多含有黃酮類化合物，也是抗氧化抗炎的重要成分[11-14]。黃酮類化合物多具有游離酚羥基，一般易溶于極性較大的有機溶劑和堿性溶液，不溶于非極性強的有機溶劑[15]。本次研究表明，經過萃取，變葉榕根的總黃酮主要富集于乙酸乙酯部位，而石油醚部位總黃酮含量最少。從抗氧化實驗結果可以看出，各組分清除DPPH、ABTS+自由基及還原能力基本與總黃酮的含量呈正相關。本研究結果顯示黃酮含量較高的總膏FB-Z、乙酸乙酯部位FB-2、正丁醇部位FB-3具有較好的抗氧化活性，其中乙酸乙酯部位黃酮含量最高，其清除DPPH、ABTS自由基及還原能力均最強。黃酮含量較低的石油醚組分和水組分抗氧化活性相應的也較弱。在抗炎活性研究中，我們發現變葉榕石油醚和乙酸乙酯組分能夠抑制LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7產生炎性因子NO，NO在急、慢性炎癥、自身免疫疾病等的發生、發展中起著關鍵的調節作用，抑制NO的過度生成在炎癥及自身免疫性疾病的預防和治療中具有非常重要的意義[16]。因此，變葉榕對炎癥及免疫性疾病的治療用作可能與抑制NO的生成有關。

本次研究初步闡明了變葉榕根的抗氧化抗炎的物質基礎及可能的作用機制。目前，關于變葉榕的臨床應用及現代化研究的報道較少，僅有少量的初步的藥理活性研究，如其提取物對蘿卜蚜的觸殺活性及對斑馬魚極性毒性的研究。變葉榕具有藥用及保健價值，為藥食同源的中藥材，目前針對其功能主治及保健作用的現代研究極其缺乏。中藥具有多成分、多靶點、多療效的特點[17]，因此，變葉榕在活性成分、藥理活性、保健價值等方面都還有待深入研究。同時，為保證安全的臨床應用，在質量控制方面，變葉榕也缺乏專屬性的定量評價標準，這些都是亟待解決的問題。