含NO供體的水楊酸卟啉酯類化合物的合成、體外活性及作用機制

瑜文美,楊玲艷,劉振華,李 輝,田澤杰,李嘉欣,易小嬋,何 軍,劉運美*

(南華大學 a.藥學院,b.化學化工學院,中國 衡陽 421001)

水楊酸是一種單羥基苯甲酸,是從柳樹中提取出來具有抗炎活性的天然產物[1]。近年來,研究發現炎癥與癌癥之間有著復雜多樣的聯系[2-5]。Kutlu等人[6]通過實驗驗證了水楊酸對A549細胞具有抗增殖活性。研究表明,阿司匹林(對乙酰水楊酸)會影響多種癌細胞的生長[7-9],NO-阿司匹林衍生物通過GSH和蛋白硫醇反應誘導腫瘤細胞凋亡[10,11]。一氧化氮(NO)是一種多功能自由基,在體內由一氧化氮合酶(NOS)調節其水平[12]。NO作為信號分子,可調控多種生理過程,近些年研究發現,NO與腫瘤的發生和增殖相關[13-15],且呈現出濃度依賴性的特點[16]。NO等氣體療法作為一種新型的腫瘤治療方法也成為研究的熱點。

卟啉是一類雜環有機化合物,在植物和哺乳動物的生命活動中發揮著重要作用。在20世紀初,研究者們發現血卟啉能選擇性地聚集在腫瘤組織中并發生光敏化[17]。卟啉作為光敏劑應用于光動力療法(PDT)被廣泛研究。PDT利用可見光與光敏劑的腫瘤定位作用治療惡性腫瘤,使其在不損傷正常組織或器官的情況下選擇性靶向,產生對癌細胞具有殺傷性的ROS,最終破壞腫瘤細胞[18-21]。相對于傳統的腫瘤治療方法,PDT具有簡單有效、毒副作用小及無創等多方面的特點[22-25],這對于傳統治療方法不耐受的患者尤為適用。

雖然光動力療法因其毒副作用小及無創等特點而被廣泛關注,但是單一的PDT無法達到完全治療的目的。聯合治療是目前癌癥治療的新趨勢和新方向之一。為了增強卟啉化合物的抗腫瘤活性,大量研究表明,將卟啉與多種天然抗癌藥結合能夠得到療效更好、毒性更低的抗腫瘤藥物。為此,本文設計并合成含NO供體的卟啉-水楊酸衍生物,并采用MTT法對其抗腫瘤活性進行研究,期望得到活性更好、毒副作用小的抗腫瘤藥物。同時,對其進行分子模擬研究,將目標化合物與CDK和PI3K靶蛋白進行分子模擬對接,推測目標化合物的體內抗腫瘤作用機制。

1 儀器與試劑

Bruker AVANCE-500兆核磁共振波譜儀(瑞典,德國),APCI-MS光譜儀(美國加州),二氧化碳培養箱(賽默飛科技有限公司),酶標儀(BIO-TEK 公司)。薄層硅膠G板和0.075—0.154 mm孔徑硅膠粉(安徽良臣硅源材料有限公司)。水楊酸、5-氯水楊酸、吡咯、2-溴乙醇、3-溴丙醇、4-溴-1-丁醇、5-溴-1-戊醇、6-溴-1-己醇、4-羥基苯甲醛及苯甲醛等從阿拉丁試劑有限公司購入,均為分析純,無須進一步純化。MTT(噻唑藍)試劑(上海麥克林生化科技有限公司)。DEAM Basic (1X),Fetal Bovine Serum (FBS),Trypsin-EDTA(胰蛋白酶)及PBS磷酸鹽緩沖劑等均從Gibco Company購入。

2 方法

2.1 合成路線

設計合成20個含NO供體的卟啉-水楊酸化合物。首先將溴代醇(2-溴乙醇,3-溴-1-丙醇,4-溴-1-丁醇,5-溴-1-戊醇,6-溴-1-己醇)分別與濃硝酸進行硝化反應合成溴代硝酸酯(2a-2e),2a-2e再分別與水楊酸或5-氯水楊酸發生取代反應生成化合物3a-3e和4a-4e,進一步酰氯化后與卟啉化合物進行反應合成了目標化合物(7a-10e)?；衔锏暮铣陕肪€如圖1所示。

2.2 實驗步驟

2.2.1 溴代硝酸酯(2a-2e)的合成 量取1.1 mL濃硝酸和2.4 mL濃硫酸加入到圓底燒瓶,在冰浴條件下攪拌10 min,緩慢加10 mmol 2-溴乙醇到反應瓶中,繼續反應1 h。將反應液倒入冰水中,用CH2Cl2進行萃取,萃取得到的有機相用無水Na2SO4干燥,減壓濃縮,放于真空干燥箱中干燥,得到黃色油狀液體2a。分別以3-溴-1-丙醇,4-溴-1-丁醇,5-溴-1-戊醇,6-溴-1-己醇替代2-溴乙醇,以同樣的方法得到黃色油狀液體2b-2e,收率為89%～98%。

2.2.2 水楊酸衍生物(3a-4e)的合成 精確稱取0.9 mmol水楊酸、4.5 mmol無水K2CO3加入到圓底燒瓶,DMF作溶劑,在氮氣保護的條件下于室溫下攪拌10 min,加0.9 mmol上一步合成的溴代硝酸酯到反應瓶中,繼續反應1 h。反應液倒入分液漏斗,用CH2Cl2萃取,并水洗4～5次除去DMF,將有機相用無水Na2SO4干燥,減壓濃縮,放于真空干燥箱中干燥,得淡黃色油狀粗產物。用二氯甲烷和正己烷作為洗脫劑過硅膠柱純化,干燥后得化合物3a-3e,收率為47%～55%。以5-氯水楊酸替代水楊酸,用相同的合成方法得到化合物4a-4e,收率為47%～53%。

2.2.3 卟啉化合物(5和6)的合成 精確稱取10.2 g苯甲醛、5.3 g對羥基苯甲醛加入到500 mL三頸燒瓶中,以丙酸作溶劑,于135 ℃油浴鍋加熱至反應液回流,用恒壓滴液漏斗緩慢滴4.8 mL新蒸吡咯和丙酸的混合液到反應瓶中,繼續攪拌2 h。反應液于室溫下放置冷卻,向其中加入等量的無水乙醇,在4 ℃下冷藏24 h。抽濾,得藍紫色粗產物,過硅膠柱純化(洗脫劑V(二氯甲烷)∶V(正己烷)=3∶1),收集第二條色帶,得到藍紫色的晶體5,收率為8%。以對氯苯甲醛代替苯甲醛,用相同的合成方法得到藍紫色的晶體6,收率為9%。

2.2.4 卟啉-水楊酸衍生物(7a-10e)的合成 取0.2 mmol3a,0.2 mmol SOCl2和0.2 mmol DMF加入到50 mL圓底燒瓶,用CH2Cl2溶解,于室溫反應,TLC點板監測至反應完全,減壓旋去溶劑,加入CH2Cl2放置備用。精確稱取0.1 mmol晶體5,0.5 mmol無水K2CO3加入到100 mL 圓底燒瓶,以DMF作溶劑,在60 ℃下反應30 min,將上述所得的酰氯化合物滴加到反應液中,TLC點板監測至反應完全。用CH2Cl2萃取,水洗4～5次除去DMF,將有機相用無水Na2SO4干燥,減壓濃縮,放于真空干燥箱中干燥,得粗產物。用二氯甲烷和正己烷作為洗脫劑過硅膠柱分離純化,收集第一條色帶,再用正己烷和乙醇重結晶,得到紫色的目標化合物7a。分別以3b,3c,3d,3e,4a,4b,4c,4d,4e代替3a,卟啉化合物6代替卟啉化合物5,用相同的合成方法得到目標化合物7b-10e。

2.2.5 抗增殖活性測試 以5-FU為陽性對照組,卟啉化合物母體5和6以及水楊酸化合物為原型藥對照組,采用MTT法研究合成的目標化合物7a-10e對HCT-116和A549的體外抗增殖活性。將細胞(對數生長期)消化至略微脫落,加入培養基吹打形成細胞懸浮液,以每孔的細胞數目大約為5×103接種至96孔板,于細胞培養箱培養24 h。按濃度梯度以成倍稀釋的關系(128,64,…,2,1 μmol·L-1)加入待測藥物的含藥培養基,各濃度重復6個孔,各孔150 μL,同時設置A板光照組和B板黑暗組并做相同處置。4 h后,A板棄去原有溶液,各孔加入150 μL PBS,使用12 W紫外燈照射10 min,棄去PBS,往96孔板中重新加入新的培養基,各孔150 μL。培養48 h后,各孔加20 μL配置的MTT溶液,溫育4 h,舍棄所有溶液,各孔加入150 μL DMSO溶液搖床搖晃10 min,酶標儀檢測570 nm處的OD值,最終計算得出藥物的抑制率(IC50值)。

2.2.6 分子對接 PI3K和CDK是目前研究較為廣泛的靶標蛋白。在快速增殖的腫瘤組織中PI3K的活性增強,PI3K在調節細胞的生理過程中發揮重要作用,CDK對細胞增殖起關鍵作用,CDK失活能夠導致有絲分裂的停止。從蛋白質數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)下載CDK蛋白(PDB: 4y72)和PI3K蛋白(PDB: 1e7u),分別與篩選出的具有較好腫瘤細胞抑制活性的9b和9c用SYBYL-X 2.0軟件進行分子對接實驗研究。

3 結果與討論

3.1 目標化合物的合成

3.1.1 產率及結構表征數據 化合物7a:收率為40%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.86 (d,J=7.3 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.22～8.29(m, 7H, meso-Ph-H), 8.17～8.20(m, 2H, meso-Ph-H),7.73 (q,J=7.5, 6.3 Hz, 10H, meso-Ph-H), 7.16～7.29(m, 4H, Ph-H), 4.61 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 3.83 (t,J=6.1 Hz, 2H, —CH2—), -2.75 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z 理論值(C53H37N5O6+840.898 6[M+H]+), 實測值 840.856 3.

化合物7b:收率為41%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.84～8.88(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.23 (dt,J=7.4, 1.2 Hz, 7H, meso-Ph-H), 8.11～8.14(m, 2H, meso-Ph-H), 7.77 (dqd,J=8.7, 7.2, 1.9 Hz, 10H, meso-Ph-H), 7.24 (s, 4H, Ph-H), 4.84 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 4.33 (t,J=5.8 Hz, 2H, —CH2—), 2.39 (p,J=6.1 Hz, 2H, —CH2—), -2.75 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C54H39N5O6+854.925 2[M+H]+), 實測值 854.904 7.

化合物7c:收率為38%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.88 (d,J=10.7 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.16～8.32(m, 7H, meso-Ph-H), 8.10～8.15(m, 2H, meso-Ph-H), 7.77 (qd,J=6.6, 3.4 Hz, 10H, meso-Ph-H), 7.22～7.27(m, 4H, Ph-H), 4.66 (td,J=6.1, 2.4 Hz, 2H, —CH2—), 4.24 (q,J=5.9, 5.2 Hz, 2H, —CH2—), 2.10 (dtt,J=13.8, 7.2, 3.5 Hz, 4H, —CH2—), -2.73 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C55H41N5O6+868.951 7[M+H]+), 實測值 868.892 4.

化合物7d:收率為37%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.84～8.91(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.23 (dt,J=7.7, 1.3 Hz, 7H, meso-Ph-H), 8.11～8.14(m, 2H, meso-Ph-H), 7.73～7.82(m, 10H, meso-Ph-H), 7.22～7.30(m, 4H, Ph-H), 4.58 (t,J=6.6 Hz, 2H, —CH2—), 4.24 (t,J=6.1 Hz, 2H, —CH2—), 2.01 (dt,J=15.3, 6.4 Hz, 2H, —CH2—), 1.93 (dq,J=8.5, 6.7 Hz, 2H, —CH2—), 1.75～1.81(m, 2H, —CH2—), -2.75 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C56H43N5O6+882.978 3[M+H]+), 實測值 882.917 5.

化合物7e:收率為39%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.84～8.91(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.23 (dt,J=7.6, 1.3 Hz, 7H, meso-Ph-H), 8.10～8.14(m, 2H, meso-Ph-H), 7.76 (qd,J=6.6, 5.0 Hz, 10H, meso-Ph-H), 7.24～7.30(m, 4H, Ph-H), 4.25 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 3.64 (t,J=6.7 Hz, 2H, —CH2—), 1.98～2.02(m, 2H, —CH2—), 1.91 (q,J= 6.9 Hz, 2H, —CH2—), 1.63～1.70(m, 4H, —CH2—), -2.75 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C57H45N5O6+897.004 9[M+H]+), 實測值 897.923 8.

化合物8a:收率為48%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.78 (d,J=7.3 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.24～8.31 (m, 7H, meso-Ph-H), 8.19～8.23(m, 2H, meso-Ph-H),7.71 (q,J=7.7, 6.5 Hz, 10H, meso-Ph-H), 7.25 (s, 3H, Ph-H), 4.62 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 4.59 (t,J=6.2 Hz, 2H, —CH2—), -2.76 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C53H36ClN5O6+875.343 6[M+H]+), 實測值 875.302 1.

化合物8b:收率為45%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.86 (d,J=8.3 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.18～8.28(m, 7H, meso-Ph-H), 8.13 (d,J=8.3 Hz, 2H, meso-Ph-H), 7.77 (qd,J=6.6, 3.6 Hz, 10H, meso-Ph-H), 7.26 (s, 3H, Ph-H), 4.84 (td,J=6.3, 2.3 Hz, 2H, —CH2—), 4.31～4.35(m, 2H, —CH2—), 2.39 (ddt,J=9.3, 6.2, 3.2 Hz, 2H, —CH2—), -2.75 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C54H38ClN5O6+889.370 2[M+H]+), 實測值 889.319 3.

化合物8c:收率為46%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.78 (d,J=7.3 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.11～8.25(m, 7H, meso-Ph-H), 7.95～8.09(m, 2H, meso-Ph-H), 7.72 (t,J=7.5 Hz, 10H, meso- Ph-H), 7.18～7.21(m, 3H, Ph-H), 4.57 (t,J=6.4 Hz, 2H, —CH2—), 4.39 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 1.83～1.88(m, 4H, —CH2—), -2.75 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C55H40ClN5O6+903.396 8[M+H]+), 實測值 903.337 4.

化合物8d:收率為43%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.87 (d,J= 16.7 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.18～8.29(m, 7H, meso-Ph-H), 8.12 (d,J=8.3 Hz, 2H, meso-Ph-H), 7.72～7.82(m, 10H, meso-Ph-H), 7.26 (d,J=8.5 Hz, 3H, Ph-H), 4.58 (t,J=6.6 Hz, 2H, —CH2—), 4.25 (t, J=6.1 Hz, 2H, —CH2—), 2.03 (q,J=7.5, 7.0 Hz, 2H, —CH2—), 1.94 (q,J=7.2 Hz, 2H, —CH2—), 1.78 (q,J= 8.5 Hz, 2H, —CH2—), -2.76 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C56H42ClN5O6+917.423 4[M+H]+), 實測值 917.386 2.

化合物8e:收率為40%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.84～8.89(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.21～8.26(m, 7H, meso-Ph-H), 8.13～8.16(m, 2H, meso-Ph-H), 7.74～7.81(m, 10H, meso-Ph-H), 7.32～7.36(m, 3H, Ph-H), 4.30 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 3.67 (t,J=6.6 Hz, 2H, —CH2—), 2.01～2.07(m, 2H, —CH2—), 1.91～1.98(m, 2H, —CH2—), 1.63～1.76(m, 4H, —CH2—), -2.76 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C57H44ClN5O6+931.45[M+H]+), 實測值 931.408 3.

化合物9a:收率為49%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ8.83～8.89(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.17～8.37(m, 9H, meso-Ph-H), 7.77 (d,J=8.1 Hz, 7H, meso-Ph-H), 7.32 (d,J=8.7 Hz, 4H, Ph-H), 4.65 (t,J=6.2 Hz, 2H, —CH2—), 4.57 (t,J=5.9 Hz, 2H, —CH2—), -2.78 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C53H34Cl3N5O6+944.233 8[M+H]+), 實測值 944.203 7.

化合物9b:收率為50%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.81～8.92(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.08～8.16(m, 9H, meso-Ph-H), 7.69～7.78(m, 7H, meso-Ph-H), 7.28 (d,J=8.2 Hz, 4H, Ph-H), 4.40 (t,J=5.8 Hz, 2H, —CH2—), 3.93 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 2.44 (p,J=6.0 Hz, 2H, —CH2—), -2.81 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C54H36Cl3N5O6+958.260 3[M+H]+), 實測值 958.219 5.

化合物9c:收率為46%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.88～8.91(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.16～8.21(m, 9H, meso-Ph-H), 7.95 (dd,J=8.1, 5.7 Hz, 7H, meso-Ph-H), 7.71 (dd,J=8.3, 2.9 Hz, 4H, Ph-H), 4.46 (t,J=5.8 Hz, 2H, —CH2—), 4.15 (t,J=6.2 Hz, 2H, —CH2—), 1.89～1.98(m, 4H, —CH2—), -2.78 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C55H38Cl3N5O6+972.286 9[M+H]+), 實測值 972.225 6.

化合物9d:收率為47%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.84～8.95(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.12～8.18(m, 9H, meso-Ph-H), 7.77 (d,J=8.2 Hz, 7H, meso-Ph-H), 7.30 (d,J=8.8 Hz, 4H, Ph-H), 4.62 (t,J=6.5 Hz, 2H, —CH2—), 4.29 (t,J= 6.1 Hz, 2H, —CH2—), 2.03～2.10(m, 2H, —CH2—), 1.95～2.01(m, 2H, —CH2—), 1.81 (t,J= 7.9 Hz, 2H, —CH2—), -2.78 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C56H40Cl3N5O6+986.313 5[M+H]+), 實測值 986.258 1.

化合物9e:收率為45%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.89 (d,J=4.7 Hz, 2H, pyrrole-β-H), 8.83 (d,J=4.0 Hz, 6H, pyrrole-β-H), 8.06～8.17(m, 9H, meso-Ph-H), 7.71～7.79(m, 7H, meso- Ph-H), 7.28 (d,J=8.5 Hz, 4H, Ph-H), 4.26 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 3.64 (t,J=6.6 Hz, 2H, —CH2—), 2.01 (p,J=6.6 Hz, 2H, —CH2—), 1.93 (p,J=6.8 Hz, 2H, —CH2—), 1.65～1.74(m, 4H, —CH2—), -2.81 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C57H42Cl3N5O6+1 000.340 0[M+H]+), 實測值 1 000.289 3.

化合物10a:收率為53%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.74～8.83(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.17～8.37(m, 9H, meso-Ph-H), 7.75 (d,J=8.3 Hz, 7H, meso-Ph-H), 7.31 (d,J=8.6 Hz, 3H, Ph-H), 4.63 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 4.59 (t,J=6.1 Hz, 2H, —CH2—), -2.81 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C53H33Cl4N5O6+978.678 8[M+H]+), 實測值 978.619 7.

化合物10b:收率為54%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.92 (d,J=4.8 Hz, 2H, pyrrole-β-H), 8.83 (d,J=2.5 Hz, 6H, pyrrole-β-H), 8.07～8.16(m, 9H, meso-Ph-H), 7.71～7.76(m, 7H, meso- Ph-H), 7.24～7.32(m, 3H, Ph-H), 4.40 (t,J=5.8 Hz, 2H, —CH2—), 3.93 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 2.44 (p,J=6.1 Hz, 2H, —CH2—), -2.82 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C54H35Cl4N5O6+992.705 4[M+H]+), 實測值 992.663 1.

化合物10c:收率為48%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.85 (d,J=2.4 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.21～8.25(m, 9H, meso-Ph-H), 7.89～7.92(m, 7H, meso-Ph-H), 7.56～7.61(m, 3H, Ph-H), 4.57 (t,J=6.4 Hz, 2H, —CH2—), 4.43 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 1.87～1.96(m, 4H, —CH2—), -2.81 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C55H37Cl4N5O6+1 006.732[M+H]+), 實測值 1 006.702 8.

化合物10d:收率為46%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.83～8.95(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.16 (t,J=7.4 Hz, 9H, meso-Ph-H), 7.77 (d,J= 8.1 Hz, 7H, meso-Ph-H), 7.30 (d,J=8.5 Hz, 3H, Ph-H), 4.59 (t,J=6.4 Hz, 2H, —CH2—), 4.31 (t,J=6.5 Hz, 2H, —CH2—), 1.95～2.02(m, 2H, —CH2—), 1.95～2.01(m, 2H, —CH2—), 1.75～1.82(m, 2H, —CH2—), -2.79 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C56H39Cl4N5O6+1 020.759[M+H]+), 實測值 1 020.714 9.

化合物10e:收率為45%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.90～8.94(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.23 (t,J=7.4 Hz, 9H, meso-Ph-H), 7.71 (dd,J=8.2, 1.7 Hz, 7H, meso-Ph-H), 7.28～7.36(m, 3H, Ph-H), 4.32 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 3.77 (t,J=6.6 Hz, 2H, —CH2—), 2.01～2.06(m, 2H, —CH2—), 1.92～1.97(m, 2H, —CH2—), 1.66～1.74(m, 4H, —CH2—), -2.82 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C57H41Cl4N5O6+1 034.785[M+H]+), 實測值 1 034.706 9.

3.1.2 合成過程的影響因素 (1)在溴代醇的硝化反應中,碳鏈長的溴代醇反應收率略高于碳鏈短的溴代醇反應收率,由于溴是吸電子基團,因此它會減慢硝化反應的反應速率,隨著碳鏈長度的延長,溴原子對反應的影響程度越來越小。(2)在水楊酸或5-氯水楊酸與溴代硝酸酯的取代反應中,水楊酸與溴代硝酸酯的反應收率略高于5-氯水楊酸與溴代硝酸酯的反應收率,這可能是因為氯原子的吸電子誘導效應大于給電子共軛效應,總的來說會降低苯環上的電子云密度,不利于進行親核反應。(3)反應最后一步合成目標化合物,硝酸酯部分碳鏈短的水楊酸衍生物與卟啉反應的產物收率比硝酸酯部分碳鏈長的水楊酸衍生物與卟啉反應的產物收率高一點,原因可能是碳鏈長的位阻大,不利于反應的進行。

3.2 抗增殖活性特征

采用MTT法對所有最終產物進行抗HCT-116細胞和A549細胞增殖活性的檢測。經典抗腫瘤藥5-FU作為參比化合物。所有目標化合物(7a-10e)、卟啉化合物(5和6)及水楊酸單體的抗增殖效果如表1所示。在光照條件下,大部分目標化合物對HCT-116細胞和A549細胞的抑制作用強于卟啉母體化合物5和6及水楊酸單體化合物。在黑暗條件下,目標化合物對受試細胞株的毒性相對較小。與5-氟尿嘧啶(IC50=60.05 μmol·L-1)相比,化合物9c對HCT-116細胞的抑制作用最強,IC50值為37.65 μmol·L-1。相比于5-氟尿嘧啶(IC50=78.24 μmol·L-1),化合物9b和9c對A549細胞均有較好的抑制活性,IC50值分別為66.89 和58.36 μmol·L-1。

表1 卟啉-水楊酸化合物的抗腫瘤抑制作用

3.3 分子對接效應

化合物9b和9c的對接結果如圖2所示。從圖2(a)和(b)可以看出化合物9b和9c通過多個位點分別與PI3K靶蛋白進行結合?；衔?b主要通過卟啉母核吡咯環上的氮氫與氨基酸殘基 LYS-807 形成1個氫鍵,水楊酸化合物中的NO供體部分與殘基TYR-867及LYS833形成2個氫鍵。而在化合物9c中主要通過水楊酸化合物中的含NO供體部分與氨基酸殘基 HIS-288及ARG-257形成2個氫鍵,卟啉母核與水楊酸結合處的酯基與殘基LYS-195形成1個氫鍵。從圖2(c)和(d)化合物9b和9c與CDK對接活性圖中可以看出,化合物9b和9c主要通過水楊酸化合物中的含NO供體片段與氨基酸殘基PHE147和ASP146形成2個氫鍵。由此可以看出化合物9b和9c與CDK及PI3K蛋白均具有較好的結合作用,這可能與其體內抗腫瘤作用存在一定相關性。

4 結論

通過化學合成手段成功制備了20個未見文獻報道的含NO供體的卟啉-水楊酸化合物,其結構用氫譜及質譜進行了確證。其中化合物9b和9c對HCT-116細胞和A549細胞均顯示出良好的體外抗增殖效果。分子對接結果顯示化合物9b及9c能很好地與CDK及PI3K靶蛋白結合,9b及9c在體內可能通過與CDK及PI3K結合,阻斷PI3K-AKT-mTOR通路,抑制腫瘤細胞的增殖,從而實現抗癌的功效。