氧化應激與糖尿病性心肌病的發生發展

湯嘉雨，徐政倩，楊君婧，張小芬，杜來玲

（浙江樹人學院樹蘭國際醫學院，浙江省污染暴露與健康干預重點實驗室，杭州 310015）

流行病學調查結果表明，中國大陸糖尿病成年患者人數預估達到了1.298 億人，其中男性0.704億，女性0.594 億[1]。而中國人民死亡原因中目前占據首位的疾病是心血管疾病，城市為43.81 % ，農村為46.66 % 。慢性病的前瞻研究表明糖尿病明顯增加了患心臟病風險。其中，糖尿病性心肌?。╠iabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病患者的主要并發癥之一，也是糖尿病患者死亡的主要原因[2]。氧化應激是超過細胞抗氧化能力的活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平升高，使活性氧和抗氧化防御機制失衡導致的[3]，其在糖尿病并發癥（包括微血管和心血管?。┑陌l展中起著關鍵作用[4]。研究發現氧化應激可加速心血管胰島素抵抗、糖尿病性心肌病和心力衰竭[3]。氧化應激能夠促進轉化生長因子‐β（TGF‐β）的表達，活化的TGF‐β 使正常的成纖維細胞轉化成肌成纖維細胞，進而導致心肌纖維化[5,6]。本文就氧化應激對DCM 的影響及其作用機制進行歸納綜述。

1 糖尿病性心肌病

歐洲心臟病學會（European Society of Cardiolo‐gy, ESC）在2008 年發表了關于心肌病分類的聲明，在聲明中其將心肌病定義為排除高血壓、先天性心臟病、冠狀動脈疾病和瓣膜病的心肌功能和結構異常，是心肌疾病的一種[7]。DCM 這一概念在1974 年被Hamby 等[8]人首次提出，糖尿病患者的高血糖癥與高胰島素血癥致使毛細血管損傷、心肌纖維化、心肌肥大并伴有線粒體異常和氧化應激增加等[9]，這符合心肌病的判斷標準。DCM（這種不符合冠心病、高血壓以及其他心臟病變的心肌疾?。┳罱K可以發展為心律失常、心力衰竭和心源性休克，嚴重時甚至可以發生猝死。有研究發現，糖尿病女性與男性患者發生心力衰竭的風險分別提高了5 倍與2.4倍[10]。

雖然糖尿病性心肌病患者機體內發現了一些和擴張型心肌病相似的病理改變，如心肌內微血管異常、心肌細胞肥大、彌漫性心肌纖維化等，但其與限制性心肌病更加相似，限制性心肌病患者在左心室無擴張甚至收縮的情況下，左心室壁增厚，導致左心室充盈壓升高?；颊咭话悴粫南拗菩孕募〔⊙葑兊綌U張性心肌病[11]，因為限制性心肌病和擴張性心肌病分別反映不同的病理生理機制[12,13]。擴張性心肌病的左心室擴張，主要見于長期存在的I 型糖尿病患者；而限制性心肌病的左心室雖室壁增厚但其大小幾乎不變或更甚者較小[14]，常見于肥胖的II 型糖尿病患者，其患病率是I 型糖尿病的20 倍以上[15]。

病理性心肌肥厚的顯微結構特征是心肌細胞肥大、心肌纖維化和心肌細胞凋亡[16]。其中，心肌纖維化在DCM 的心臟結構重建中起著至關重要的作用，有助于左心室功能的改變和舒張功能障礙。糖尿病心臟的結構和功能改變是由TGF‐β、血栓反應蛋白‐1（TSP‐1）及相關基因等的表達增加，進而增加間質和血管周圍膠原沉積加重心肌纖維化引起的[17]。糖尿病性心肌病在早期階段為無癥狀的亞臨床期，其特征是心臟結構和心功能異常，包括左心室肥厚與心肌纖維化、亞臨床舒張功能障礙等；在有臨床癥狀階段，可發展為伴有射血分數保留的心力衰竭（HFpEF，射血分數≥50%），更甚者出現射血分數降低的心力衰竭（HFrEF，射血分數≤40%），此時心臟存在明顯的收縮期功能障礙[18]。

2 氧化應激與糖尿病性心肌病

糖尿病會導致慢性炎癥和氧化應激增加[19,20]。氧化應激是由自由基的形成和清除之間的不平衡引起的一種現象[21]。最有效的自由基來源于分子氧，大約95% 的氧氣作為能量被消耗并最終變成水；然而剩下的5% 會產生代謝產物，稱為ROS，包括超氧陰離子（O2??）、過氧化氫（H2O2）、單線態氧（1O2）和羥基自由基（?OH），ROS 與未配對的電子形成分子和原子，稱為自由基[22]。內源性ROS 主要產生于線粒體，線粒體中電子泄漏和O2??的形成對糖尿病性心肌病非常重要。細胞的代謝越活躍，線粒體越多，心臟是機體中代謝最活躍、線粒體密度最高的器官。線粒體呼吸鏈傳遞來的4 個電子和1 個氧分子在線粒體細胞色素氧化酶上結合還原，并與4個氫離子作用生成2 個分子水，在這個過程當中，線粒體的電子傳遞鏈會漏出0.2%～2% 的電子并且與氧發生反應，在氧化磷酸化過程中產生O2??[23]。在這一過程中，只有少數氧接受電子轉化為ROS，如O2??。

然而，在糖尿病細胞中血糖病理性提高會導致線粒體的電子傳遞鏈異常，大量產生ROS[24]，從而引發氧化應激。這主要涉及4 種分子機制：增強己糖胺生物合成途徑（hexosamine biosynthetic pathway,HBP）與多元醇途徑（polyol pathway），激活蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）和增加晚期糖基化終產物（advanced glycation end‐products, AGEs）的形成。線粒體超氧化物過量產生可以導致DNA 鏈斷裂，進而激活作為DNA 損傷感受器的多聚ADP 核糖聚合酶（PARP）[25]。PARP 會抑制糖尿病患者體內高血糖細胞中的關鍵糖酵解酶——3‐磷酸甘油醛脫 氫 酶（glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase,GAPDH）的活性，導致GAPDH 上游的糖酵解代謝產物增多，激活并進入以上4 條通路[4]。由糖尿病引發的4 條通路和線粒體過量產生ROS 的也會進一步加劇氧化應激（圖1）。

圖1 氧化應激在糖尿病性心肌病發展中的作用。高血糖誘導線粒體過量產生ROS，如O2?? 和 H2O2，由此通過抑制GAPDH 導致己糖胺生物合成途徑流量增和多元醇途徑流量增加，PKC亞型活化和AGEs形成增加。這些通路本身是額外ROS 和氧化應激的來源。O2??：超氧陰離子自由基；PARP：聚ADP 核糖聚合酶；GAPDH：3‐磷酸甘油醛脫氫酶；AGEs：晚期糖基化終產物。Fig.1 The role of oxidative stress in the development of diabetic car‐diomyopathy. Hyperglycemia induces mitochondrial overproduction of ROS, such as O2?? and H2O2, which induces an increased HBP flux,an increased polyol pathway flux, activation of PKC isoforms, and in‐creased AGEs formation via inhibition of GAPDH. These pathways are themselves a source of additional ROS and oxidative stress. O2??: super‐oxide anion radicals; PARP: poly(ADP‐ribose) polymerase; GAPDH:glyceraldehyde 3‐phosphate dehydrogenase; AGEs: advanced glycation end‐products.

細胞內高血糖、心肌細胞脂肪氧化和脂毒性增加都導致線粒體過量產生ROS。糖尿病患者的心臟特征包括脂肪酸氧化增加和葡萄糖利用率降低，從而引發心臟中血脂過量累積，導致心肌脂毒性，這可能是觸發心臟氧化損傷和慢性炎癥的因素[26]。脂肪酸氧化會直接影響糖酵解和丙酮酸脫氫酶的活性[27]。糖原合成酶激酶‐3β（GSK‐3β）是葡萄糖在心臟代謝的關鍵酶。脂肪酸氧化增加和特異性胰島素抵抗引起糖尿病心臟和大血管系統中線粒體過量產生活性氧，而活性氧會導致胰島素信號傳導受損。糖尿病患者心肌細胞中的胰島素信號傳導受損會抑制蛋白激酶β（Akt），導致GSK‐3β 磷酸化失活[28]，從而改變能量代謝。心臟脂毒性是指心臟中脂質不斷被攝取氧化，并且伴有線粒體功能障礙。心肌脂肪酸攝取增加導致線粒體結構重構，使其最小直徑顯著減小，這與分離線粒體中棕櫚酰肉堿氧化增加和活性氧產生增加有關[29]。游離脂肪酸誘導的活性氧過量產生，也會導致活化PKC、激活己糖胺途徑和多元醇途徑、形成AGEs[30]。

蛋白質的折疊和內質網應激也與氧化應激有關系。因為蛋白質的折疊需要在氧化還原穩態的環境中進行，所以氧化應激可能會破壞蛋白質折疊機制，導致蛋白質折疊錯誤的出現[31]。而心臟內質網的功能也會被炎癥和脂毒性所破壞，引發內質網應激，導致未折疊蛋白反應（UPR）[32,33]。內質網未折疊蛋白反應超負荷可導致心肌細胞損傷凋亡與心臟功能異常[34]。有研究表明在2 型糖尿病中內質網未折疊蛋白反應（UPRER）可通過激活PERK 通路調控線粒體未折疊蛋白反應（UPRmt），影響細胞存活[35]。線粒體相關的內質網膜(MAMs)是由線粒體和內質網之間的物理接觸而形成的一個獨特的區域，并介導細胞器的交流。在高糖條件下，MAMs 的距離和組成的改變會導致細胞內信號轉導異常，從而影響其生理功能，導致線粒體功能障礙和異常凋亡[36]。

3 糖尿病性心肌病的分子機制

高糖導致糖尿病并發癥的機制主要有4 種假說[4,37]，即增加葡萄糖進入己糖胺生物合成途徑進行代謝的流量，增加葡萄糖代謝的多元醇途徑，激活蛋白激酶C 信號通路和增加AGEs 的形成并激活其受體RAGE 信號通路。如圖1 所示，這4 條通路不僅直接導致糖尿病性心肌病，而它們本身也會加劇氧化應激。

3.1 己糖胺生物合成途徑

葡萄糖進入細胞后，被磷酸化為葡萄糖‐6‐磷酸，并代謝為果糖‐6‐磷酸，其中一部分被允許進入己糖胺生物合成途徑（hexosamine biosynthesis path‐way, HBP）。在糖酵解的果糖‐6‐磷酸步驟中，HBP通常只是葡萄糖代謝的次要替代途徑；但當外源性葡萄糖輸入心肌細胞的量超過了其通過糖酵解和丙酮酸氧化代謝的能力時，HBP 通量會增加[38]。HBP的葡萄糖代謝使糖基分子β‐N‐乙酰氨基葡萄糖（O‐linked β‐N‐acetylglucosamine, O‐GlcNAc）連接到蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基上形成O‐GlcNAc修飾，影響其生物活性（類似于磷酸化），O‐GlcNAc 修飾廣泛存在，對細胞內的許多信號通路具有調節作用。在正常生理情況下，HBP/O‐GlcNAc機制的短暫激活是提高細胞存活的一種適應性、保護性的手段；但在高血糖等病理情況下，HBP/O‐GlcNAc異常增加在糖尿病并發癥中起重要作用[39]。在心肌細胞中，高血糖、氧化應激和導致心肌細胞凋亡的HBP 之間的聯系已被證實[40]。高血糖導致在心肌中發生過量脂肪酸氧化，糖酵解中間體果糖‐6‐磷酸因濃度提高被轉移到HBP 中，可導致蛋白質功能和基因表達的變化。除此之外，氧化應激也可通過抑制糖酵解的限速酶GAPD 來增加HBP 通量，誘發心肌細胞凋亡，從而導致DCM 的發病。在高葡萄糖水平的肌細胞中發現肌質網鈣離子ATP 酶2a（sarcoplasmic reticulum calcium ion ATPase 2a, SERCA2a）蛋白質和mRNA表達水平降低，核蛋白O‐GlcNAc 增加，SERCA2a啟動子活性降低[41]。谷胱甘肽（glutathione, GSH）作為機體內一種重要的抗氧化劑，能夠清除掉人體內的自由基，具有抗氧化作用，GSH 的消耗會引起氧化應激從而來激活HBP[42]。

3.2 多元醇途徑

在糖尿病患者中，多元醇途徑非?；钴S，消耗體內約30% 的葡萄糖[43]。多元醇途徑經醛糖還原酶（aldose reductase, AR）、山梨醇脫氫酶（sorbitol dehydrogenase, SDH）前后兩步代謝將葡萄糖轉化為果糖。在這一途徑中，AR 利用還原型輔酶Ⅱ（nico‐tinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）作為電子供體將葡萄糖轉移到山梨醇中，然后山梨醇被SDH 氧化為果糖，輔助因子NAD+轉化為NADH[44]。多元醇途徑導致ROS 過量產生，因為AR 過度利用NADPH 導致GSH 無法再生，從而降低了整體抗氧化能力，導致或加劇細胞內氧化應激；同樣，SDH會導致NADH 的積累，而NADH 是一種產生ROS的NADH 氧化酶的底物[45]。研究人員使用新型AR抑制劑AT‐001 治療28 天后，可以顯著降低糖尿病患者血液中的山梨醇水平[46]。目前AT‐001 正在被進行一項隨機、雙盲、安慰劑對照、全球3 期臨床研究，旨在發現這種具有更高特異性的AR 抑制劑對有高風險進展為心力衰竭的DCM 患者的療效[47]。

3.3 蛋白激酶C

PKC 是一組蛋白激酶，可以磷酸化其他蛋白并影響其功能，如信號轉導功能、細胞存活和死亡等。PKC 異構體已被證明在糖尿病和許多高血糖并發癥（尤其動脈粥樣硬化和DCM）中發揮重要作用[48‐50]。在心肌組織中，PKCα 和PKCβ2 是主要的PKC亞型[51]。通過失活PKCα 信號通路減輕氧化應激和炎癥反應，山楂葉黃酮（Hawthorn leaf flavonoids,HLF）對大鼠糖尿病性心肌病有保護作用[50]。氧化應激誘導PKCβ 激活，促進p66Shc磷酸化，使其被肽基脯氨?；樂串悩嬅福≒in‐1）識別并從細胞質轉移到線粒體，誘導線粒體H2O2產生，從而進一步增加細胞內H2O2水平，H2O2、PKCβ、p66Shc三者形成循環，在一種自觸發的控制回路中維持或提高PKCβ 的激活[52]。PKCβ2/p66Shc氧化應激通路在糖尿病性心肌中過度激活，引發心肌細胞肥大、纖維化以及心臟收縮功能下降[53]。高糖誘導PKCβ2 的過度激活可通過損害小泡蛋白‐3（caveolin‐3）的表達和Akt/eNOS 信號通路導致心臟舒張功能障礙[54]。選擇性PKCβ 抑制劑ruboxistaurin（RBX）和抗氧化劑N‐乙酰半胱氨酸（N‐acetyl‐cysteine, NAC），可以抑制PKCβ2 活化，減少氧化應激，緩解糖尿病的心肌肥大和功能障礙[55]。

3.4 晚期糖基化終產物

非酶糖基化（non‐enzymatic glycosylation, NEG）是發生在高爾基體和內質網中，還原糖與蛋白質、脂質或核酸之間的非酶促過程。NEG 會改變抗氧化酶的結構，從而使其失去抗氧化的功能，無法清除自由基，提高糖尿病患者的氧化應激[56]。美拉德反應中，還原糖類羰基物質和蛋白質氨基化合物發生反應形成席夫堿，再通過阿馬道里重排(Amadori rearrangement）反應，形成酮胺。席夫堿和酮胺是可逆的反應產物，但和氨基酸殘基會產生不可逆反應，形成AGEs。因為大多數AGEs 是由氧化和糖基化形成的，所以被稱為糖氧化產物。在高血糖環境下，AGEs 的形成比在生理條件下大幅度提高。AGEs 大量存在于糖尿病患者的心臟中，因此可能是一種導致糖尿病性心肌病的主要源由[57]。RAGE是一類模式識別受體，能特異性識別和結合AGEs而且產生對應生物學效應的免疫球蛋白超家族受體（IgSFR）[58]。內皮祖細胞（EPCs）中的RAGE 和AGEs 反應增加了NADPH 氧化酶的活性，NADPH氧化酶將電子從NADPH 轉移到分子氧并產生活性氧，氧化應激、AGEs 和RAGE 之間的反應激活JNK信號通路，導致心臟細胞凋亡，而使用siRNA 阻斷RAGE 可以阻止JNK 的活化[59]。

4 總結與展望

迄今為止，氧化應激一直被認為在DCM 中起著關鍵作用。由于心臟是人體代謝最活躍的器官，且其線粒體含量與其他組織相比也是最高的，所以心臟極其容易過量產生ROS 并受到氧化應激的損傷。高血糖致使線粒體過量產生ROS，進而促進心臟中的氧化應激。氧化應激致使HBP 與多元醇通路通量增加、PKC 活化、AGEs 形成增加以及RAGE 的活化。這些代謝通路的異常增強又導致ROS 過量產生，從而形成惡性循環，導致氧化應激永久化。氧化應激的增加會導致細胞線粒體損傷、心肌纖維化與肥厚以及心臟功能障礙。因此，抑制ROS 的產生和清除心肌細胞中過多的ROS 可以保護心肌免受高糖介導的氧化損傷。在對糖尿病性心肌病的動物研究中，發現提高原發性抗氧化酶的表達可以減少心肌病理學改變并且改善心臟功能。鈉糖共轉運蛋白2（SGLT2）抑制劑是目前治療糖尿病相關心力衰竭最有效的方法之一，其被證實可以對抗氧化應激[60]，但其具體藥理活性和作用機制，以及對DCM 的病理變化影響，都需要進一步研究[61]。未來若一些主要抗氧化酶的基因轉移治療能夠成功逆轉DCM，這些實驗將最終證明氧化應激是DCM 的關鍵因素，并為臨床預防及治療DCM 提供新的治療方法。