單細胞測序技術在乳腺癌中的研究進展

楊帥 王新恒 吳佳樂 付子彤 魏博 楊靈冰 綜述 許守平 審校

作者單位：哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科一病區(哈爾濱 150081)

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤,2020年大約有230萬新發病例,超過68.5萬人死于乳腺癌[1]。乳腺癌是一種起源于乳腺導管上皮細胞高度異質性的疾病,由于這些異質性的存在,乳腺癌治療面臨很大的困難。單細胞測序技術是一種在單細胞水平上揭示細胞的基因組、轉錄組或表觀遺傳變化的技術,從不同角度揭示細胞的功能和特征。通過構建數據庫,可以一次檢測龐大的每個單元信息。人類對單細胞的研究主要是基于測序技術。第一代測序技術是1997年開發的Sanger測序方法,主要測序標記的單個核酸分子的堿基,科學家使用該技術在2003年繪制了人類基因的初步序列,為生命的解碼奠定了基礎。2005年,Roche公司開發了第二代測序(高通量平行測序),進一步解碼單細胞轉錄組、基因組、表觀遺傳學和結合多組學單細胞測序技術的細胞和分子變化,為醫學研究進展提供了良好的平臺。傳統高通量測序技術獲得的測序數據只是對大量組織樣本中混合細胞的平均基因測定。與傳統的測序技術相比,單細胞測序技術不僅能夠準確測量基因表達水平和檢測非編碼RNA的表達,還可以充分利用測序特殊樣本的優勢,彌補特殊樣本樣本量小、不易獲得的缺點[2-4]。

近年來不斷發展的單細胞測序技術已經能夠分離單細胞,在單細胞水平上建庫測序,捕獲單個細胞的基因表達信息。2009年,Tang等[5]首次報道了單細胞轉錄組測序技術。最初的單細胞測序只能對10～100個細胞進行研究,隨著技術的不斷完善,現階段人們已經能夠在單個項目中對成千上萬個單細胞進行測序[6-8]。運用單細胞測序技術,不僅能夠區分腫瘤細胞間的異質性,也能識別不同細胞類型。本文綜述了單細胞測序技術應用于乳腺癌圖譜、乳腺癌微環境、乳腺癌轉移與耐藥以及乳腺癌異質性與克隆演化方面的文獻,為乳腺癌的研究提供參考。

1 單細胞測序技術應用于乳腺癌圖譜

乳房由復雜的上皮導管和小葉網絡組成,這些上皮導管和小葉網絡嵌在結締組織和脂肪組織中[9-11]。目前大多數的研究都集中在乳腺上皮細胞類型上,而對非上皮細胞類型的研究相對較少[12-14]。Kumar等[15]構建了具有單細胞和空間分辨率的綜合人類乳腺細胞圖譜?？蒲腥藛T通過單細胞轉錄組測序研究分析了146例女性的714 331個細胞和117 346個細胞核,得到了包括內皮細胞、免疫細胞、基底肌上皮細胞、間充質細胞和肥大細胞在內的12種不同的細胞類型圖譜。這些正常乳腺細胞類型圖譜揭示了乳腺組織豐富的血管周圍樣細胞(Perivascular like, PVL)、內皮細胞和免疫細胞群,以及高度多樣化的管腔上皮細胞群。同時這些數據為研究乳腺癌和乳腺生物學等疾病提供了正常乳腺組織的參考信息。

乳腺癌的異質性可能源于其不同的細胞來源,體現在不同的亞型與獨特的治療不敏感性[16]。然而科研人員對早期腫瘤形成和進展的研究常常受到不發達、偶爾相互矛盾的乳腺譜系注釋的限制?，F有的注釋通常由少量標記定義,不能充分代表乳腺譜系內異質性。乳房是一個動態器官,其對生理和病理生理條件的反應會改變其疾病易感性,但這些臨床變量對細胞狀態的具體影響仍不清楚。Gray等[17]通過整合單細胞RNA測序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)、質量流式細胞術和循環免疫熒光,呈現一個統一的高分辨率乳腺癌圖譜。他們定義了肺泡、激素感應和基底上皮譜系中的細胞亞型,描述了不同亞型與癌癥風險因素的關聯,包括年齡、胎次和BRCA2種系突變。被稱為基底腔細胞的肺泡細胞子集,帶有與基底樣乳腺癌相關的基因特征。有趣的是肺泡細胞子集表現出較差的轉錄譜系保真度,并且隨著年齡的增長而積累。這些數據更全面地高分辨率定義乳腺癌細胞類型。

乳腺癌是復雜的細胞生態系統,其中異型細胞相互作用在疾病進展和對治療的反應中發揮核心作用。然而,目前的研究對其細胞組成和組織的了解是有限的。Wu等[18]提出了人類乳腺癌的單細胞和空間轉錄組學分析,并開發了一種內在亞型分類的單細胞方法來揭示復發性腫瘤細胞的異質性。通過scRNA-seq使用轉錄組和表位的細胞索引進行免疫表型分析可提供高分辨率的免疫圖譜,包括與臨床結果相關的細胞程序性死亡-配體1陽性或者細胞程序性死亡-配體2陽性的巨噬細胞群。他們發現間充質細胞通過在內皮細胞、癌癥相關成纖維細胞(Cancer-associated fibroblast, CAF)和PVL三個主要譜系內分化顯示出不同的功能和細胞表面蛋白表達的差異。該研究提供了乳腺癌細胞結構的全面轉錄圖譜。

2 單細胞測序技術應用于乳腺癌微環境研究

腫瘤微環境是由腫瘤細胞、免疫細胞、成纖維細胞和血管細胞組成的復雜微環境。腫瘤內的細胞組成決定了腫瘤微環境的高度異質和動態特性[19]。乳腺癌的微環境包括腫瘤浸潤淋巴細胞、腫瘤相關骨髓細胞[20-21]、脂質相關巨噬細胞[22]、癌癥相關成纖維細胞(Cancer-associated fibroblast,CAF)和其他促進腫瘤細胞生長和遷移的因子。微環境中的細胞成分被證明參與乳腺癌的發生、生長和轉移。目前,乳腺癌微環境細胞的模式研究相對較少,沒有很好的評估這些微環境細胞在發病機制中的具體作用 。單細胞多組學生物技術,尤其是單細胞RNA測序技術以更高的分辨率揭示單細胞表達水平,精細剖析腫瘤微環境的分子特征[23]。

CAF大量存在于幾乎所有腫瘤微環境中,并影響腫瘤進展。雖然人們逐漸地了解到它們的功能和異質性,但對CAF的起源知之甚少。Houthuijzen等[24]通過對小鼠進行的各種移植研究,發現浸潤性小葉乳腺癌和三陰性乳腺癌中的CAF均源自乳腺組織常駐的正常成纖維細胞(Normal fibroblasts,NF)。單細胞轉錄組學、體內和體外研究揭示了CD26+和CD26-NF細胞群分別轉變為炎性CAF和肌成纖維細胞CAF。功能性共培養實驗表明,CD26+NF轉變為促腫瘤炎性CAF,后者以趨化因子12依賴性方式募集骨髓細胞,并通過基質金屬蛋白酶活性增強腫瘤細胞侵襲。他們的結果表明CD26+和CD26-NF在乳腺癌小鼠模型中轉化為不同的CAF亞群。Bartoschek等[25]利用遺傳工程改造的乳腺癌小鼠模型的768例間充質細胞轉錄組的單細胞RNA測序,定義了三個不同的CAF亞群。并且在轉錄和蛋白水平上揭示了不同來源的CAF亞類的空間分布,包括PVL、乳腺脂肪墊和轉化的上皮細胞。每種CAF亞型的基因譜與其獨特的功能程序相關,CAF三種亞群的分辨率可作為生物標志物為CAF精確靶向藥物的開發提供了可能性。

3 單細胞測序技術應用于乳腺癌轉移研究

作為臨床預后的指標,乳腺癌的淋巴結轉移引起了人們的廣泛關注。許多報道揭示了轉移性乳腺癌細胞的特征,但仍然需要更多乳腺癌相關淋巴結微環境成分和空間轉錄組圖譜的研究。Xu等[26]他們的研究中,通過整合scRNA-seq和空間轉錄組學,研究了6例手術切除淋巴結樣本的轉錄譜和1例陽性淋巴結的組織。結果發現高表達CD68和CD163的破骨細胞樣巨細胞。CD68和CD163是腫瘤相關巨噬細胞的生物標志物。通過空間轉錄組學方法,他們發現破骨細胞樣巨細胞分散在轉移性乳腺癌細胞中。在乳腺癌細胞浸潤的淋巴結微環境中,腫瘤相關巨噬細胞富含包括NF-κB信號通路和NOD樣受體信號通路在內的前腫瘤通路。進一步的子聚類展示了巨噬細胞從活躍的趨化因子產生狀態發展為活躍的淋巴細胞激活狀態的潛在分化軌跡。該研究首次將scRNA-seq和空間轉錄組學整合到腋窩淋巴結腫瘤微環境中,為深入研究乳腺癌淋巴結轉移提供了系統方法。

盡管轉移仍然是大多數癌癥相關死亡的原因,但對遠端組織轉移播種的機制知之甚少。Davis等[27]建立了一種可靠的方法,使用單細胞RNA測序和患者衍生的乳腺癌異種移植模型,用于在過程中識別罕見轉移細胞的整體轉錄組變化。他們發現原發性腫瘤和微轉移都顯示出轉錄異質性,但微轉移具有獨特的轉錄組程序,該轉錄組程序在患者衍生的異種移植模型中保守,可以高度預測患者的不良生存率。通路分析顯示線粒體氧化磷酸化是微轉移中上調的主要通路,而原發性腫瘤細胞中糖酵解酶水平較高,并且通過流式細胞術和代謝組學分析證實了這一點。通過抑制氧化磷酸化可以顯著減弱肺部的轉移播種,證明了氧化磷酸化在轉移中的重要性,并突出了其作為預防乳腺癌患者轉移擴散的治療靶點的潛力。

4 單細胞測序技術應用于乳腺癌耐藥研究

耐藥性是乳腺癌治療的主要障礙。為了解決這個問題,Prieto-Vila等[28]對腔面型乳腺癌細胞系MCF7及其耐藥細胞進行了廣泛的單細胞基因表達譜分析。在耐藥細胞中觀察到上皮-間質轉化和干性相關基因的上調和細胞周期相關基因的下調。這些基因主要受淋巴樣增強因子1調節。親代細胞中的少數細胞表現出與耐藥細胞相似的基因表達譜,表明未經處理的親代細胞已經含有耐藥的細胞亞群。

雌激素受體陽性乳腺癌的主要治療方法是內分泌治療,臨床上大約90%的轉移性乳腺癌患者最終對內分泌治療產生耐藥,至少33%的早期乳腺癌患者將產生內分泌耐藥[29-31]。細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)抑制劑聯合內分泌治療能夠改善晚期轉移性雌激素受體陽性乳腺癌患者的預后,但其在早期患者中的價值尚不清楚。Griffiths等[32]運用scRNA-seq對單獨使用內分泌治療或者聯用CDK抑制劑的內分泌治療活體組織進行測序。研究者發現單獨用藥和聯合用藥均出現了共同的耐藥表型。聯合用藥治療的耐藥腫瘤顯示出雌激素信號的加速喪失,同時通過生長因子受體對JNK信號進行集中上調。相比之下,在單一或聯合治療期間維持雌激素信號傳導的癌細胞通過ERBB4信號傳導,顯示CDK4/6激活和ERK上調的增強。這些結果表明,早期ER陽性乳腺癌的聯合治療通過從雌激素轉變為替代生長信號介導的增殖而導致耐藥性的出現。

人表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor2,HER2)陽性乳腺癌患者受益于HER2靶向治療,其中最常用的是曲妥珠單抗。然而,獲得性耐藥通常在接受靶向治療的一年內發生,這種耐藥機制尚不清楚。Guoyu等[33]在兩種HER2陽性乳腺癌細胞系SKBR-3和BT474中通過耐藥篩選,構建了曲妥珠單抗耐藥細胞。通過外顯子組測序技術,檢測抗性誘導過程中不同時間點的細胞,用來研究基因組隨時間的變化。其中單細胞靶向測序被用于識別與耐藥性相關的基因突變。結果發現了拷貝數變異區域的快速增加,以及單核苷酸變異的逐漸積累。單細胞靶向測序發現在SKBR-3和BT474細胞中多個基因位點的突變導致腫瘤細胞對曲妥珠單抗敏感性降低。

5 單細胞測序技術應用于乳腺癌異質性與克隆演化研究

乳腺癌的異質性使得不同患者之間(腫瘤間異質性)、甚至在每個個體腫瘤內(腫瘤內異質性)差異很大。腫瘤異質性發生在形態學、基因組、轉錄組和蛋白質組水平,給診斷和治療帶來挑戰[34]。

近年來,scRNA-seq在探索腫瘤細胞群體的異質性以及腫瘤發生和轉移相關的稀有細胞類型方面,比傳統測序方法具有更大的優勢[35]。scRNA-seq技術將具有不同分子亞型的乳腺癌細胞群體聚集在一起,來鑒定可能與不良預后和耐藥性相關的不同群體。scRNA-seq技術還用于鑒定潛在免疫治療靶點的不同免疫細胞亞群。此外,除了探索異質性,scRNA-seq在乳腺癌研究中還具有多種應用,包括分析細胞間信號通路、調節單細胞狀態和免疫細胞分布等。由于scRNA-seq能夠定義具有潛在治療靶點細胞亞群的能力,因此有助于乳腺癌的個體化治療。

異質性和復雜的細胞結構對乳腺癌的進展以及對治療的反應具有重要的影響。然而,破譯腫瘤亞型及其空間組織仍然具有挑戰性。Liu等[36]將scRNA-seq與基于微陣列的空間轉錄組學相結合,來識別細胞群及其在乳腺癌組織中的空間分布。腫瘤細胞聚集成不同的亞群,這些細胞簇具有不同的起源、特征和功能。他們發現這些亞群分布在不同的組織區域,觀察到基質細胞類型的差異富集,并且通過對大型乳腺癌RNA-seq隊列的去卷積推斷了這些腫瘤亞群的豐度,揭示了與患者生存和治療反應的差異關聯。這項研究為乳腺癌的細胞結構和潛在的治療策略提供了新的見解。

確定腫瘤異質性及其對藥物反應的影響能更好地對患者進行分層,幫助制定患者個性化治療方案。為了評估腫瘤細胞異質性對藥物反應的影響,Gambardella等[37]對來自32例乳腺癌細胞系的35 276個單個細胞進行轉錄分析,得到32個單細胞圖譜。研究者設計了一種單細胞轉錄譜映射到乳腺癌圖譜的算法,通過這種算法可以從腫瘤活檢的基因表達譜中確定細胞系組成,對患者來源的細胞系進行分層,從而預測藥物反應。最后,他們將細胞系體外藥物篩選的結果與單細胞數據聯系起來進行比對,進而預測單細胞譜與藥物敏感性的關系。結果發現非遺傳的轉錄異質性使具有不同藥物敏感性的細胞在相同的細胞系中也能共存。這對確定細胞系組成和藥物反應方面的腫瘤異質性提供了一個框架。

在克隆演化方面,拷貝數改變(Copy number alterations,CNA)在塑造乳腺癌基因組中發揮重要作用,并證明在臨床上可用于治療和預后。Balsan等[38]使用單細胞測序技術,全面繪制出乳腺癌腫瘤隊列中拷貝數改變異質性的特點。分析揭示:腫瘤塊內非腫瘤細胞(即基質)的遺傳異質性;拷貝數異質性對乳腺癌基因組的影響程度以及亞克隆事件的基因組位置和劑量的重要性;染色體擴增的遺傳異質性普遍存在;以及拷貝數異質性與臨床和生物學參數(如多倍體和雌激素受體陰性狀態)的關聯。他們的數據突出了單細胞基因組學在剖析多種形式的CNA腫瘤內遺傳異質性方面的特點,CNA異質性對乳腺癌基因組的影響程度,以及CNA異質性對腫瘤耐藥和復發的影響。

Kacavas等[6]對來自六個原發性三陰性乳腺癌患者超過1 500個細胞進行了scRNA-seq。結果發現每個腫瘤內基因表達程序的細胞間異質性是可變的,并且在很大程度上與推斷的基因組拷貝數變化的克隆性相關?；虮磉_譜的聚類確定了多個腫瘤共有的不同惡性細胞亞群,包括與治療抗性和轉移的多個特征相關的單個亞群,其功能特征是激活鞘糖脂代謝和相關的先天免疫途徑。定義該亞群的新特征預測了大型隊列中三陰性乳腺癌患者的長期結果。這項分析揭示了三陰性乳腺癌的功能異質性及其與基因組進化的關聯,并揭示了導致這種疾病預后不良的未預料到的生物學原理。

6 小結與展望

近年來,對單個細胞水平的分析正在改變人們對疾病的認識,腫瘤研究者開始逐漸認識到腫瘤組織和細胞群體的復雜性和異質性,傳統的混合組織測序分析不能很好地表征生物學的復雜性。然而,在單細胞研究廣泛開展的大背景下,單細胞測序技術應用于腫瘤研究也存在一些局限性。首先,單細胞測序技術的成本很高,需要一定的科研經費支持;另外單細胞分析的常規方法還不完善,技術方面受限于單細胞的分離和捕獲、細胞膜的完整性及活性,從而使下游分析中的細胞失去了其在機體內環境下的真實狀態;其次,單細胞測序基因組學在單個實驗中測量成千上萬單細胞基因組信息,所產生的龐大數據的分析處理及對生物學信息的解析是一個巨大的挑戰。因此,與生物信息學和計算機生物學的跨學科合作將極大提高單細胞測序實驗領域的進展,對腫瘤學的研究具有重要的意義。