白念珠菌藥物耐受機制研究進展

黃宇穎 劉維達,2 李筱芳,2

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所真菌科,南京 210042; 2.江蘇省皮膚病與性病學分子生物學重點實驗室,南京 210042)

念珠菌引起的侵襲性感染嚴重威脅人類健康,全球侵襲性念珠菌感染病例每年有約70萬例,是重癥監護室患者血流感染的常見病因。而世界范圍內大部分地區,白念珠菌仍為侵襲性念珠菌的主要病原體[1-2]。成年人念珠菌血癥死亡率達40%～70%,新生兒念珠菌血流感染后的死亡率達20%～34%[3]。目前治療白念珠菌感染的藥物種類有限,主要為唑類、多烯類和棘白菌素類,但隨著臨床上的廣泛使用,耐藥(drug resistance)菌株的報道越來越多。此外,在持續性念珠菌血癥中,即使采用體外藥敏試驗提示敏感的藥物進行治療,也常常伴隨遷延不愈和復發,死亡率顯著高于非持續性感染[4],這種臨床療效和低耐藥率不一致的情況可能與其藥物耐受性(drug tolerance)有關[5-6]。白念珠菌的耐受問題使臨床治療面臨嚴峻挑戰,因此了解白念珠菌耐受的概念、機制及其與耐藥之間的聯系至關重要。

1 白念珠菌藥物耐受的概念

真菌的耐受是敏感菌株的一個特征,定義為敏感株在最小抑菌濃度(minimal inhibitory concen-tration,MIC)以上的高濃度藥物中緩慢生長的能力[9]。藥敏試驗中,瓊脂擴散法抑菌圈內少量菌的生長或微量液基稀釋法的拖尾現象都是真菌對藥物耐受的體外表現[7]。在念珠菌中,氟康唑治療的白念珠菌耐受的概念和量化研究最為廣泛。有研究對分離自不同部位的66株白念珠菌進行氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的藥敏實驗,僅發現2株耐藥菌,但大部分菌株均存在拖尾現象[6]。Rosenberg等[6]采用瓊脂擴散法的生長分數(fraction of growth,FoG)和微量液基稀釋法的超MIC生長指數(supra-MIC growth,SMG)(見圖1)更為精確地分析了219株不同感染來源的白念珠菌,發現均存在三唑類藥物耐受現象,棘白菌素和多烯類相對少見;不同菌株的耐受程度不一樣,體現在高于MIC時生長的亞群規模和菌落出現的速度存在差異;219株白念珠菌的FoG值變化范圍為0.10～0.85,耐受程度越高,FoG越大,并與SMG值保持一致。

2 白念珠菌藥物耐受機制的研究

目前對白念珠菌耐受機制的研究主要包括以下四個方面。

2.1 壓力應答調控

目前認為耐受是一種應激策略,對藥靶沒有直接影響,壓力應答調控被認為是耐受的重要方式之一[7]。壓力應答調控的關鍵因子熱休克蛋白90(Hsp90)、鈣調磷酸酶、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、Rim101和雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin,TOR)通過Ca2+-鈣調磷酸酶、PKC-MAPK、Rim途徑和HOG信號通路來調控白念珠菌的壓力應答,以對唑類、多烯類和棘白菌素類藥物產生適應性[9]。這些壓力應答調控因子的抑制劑和突變體可以有效地消除白念珠菌耐受性,并提高氟康唑對一組不同耐受水平菌株的抑菌活性[10-13]。與此一致,Hsp90、鈣調磷酸酶、TOR、賴氨酸去乙?；富騌im101基因功能破壞可增強氟康唑的作用[14]。值得注意的是,抑制這些壓力應答途徑并不影響菌株的MIC水平,因此推測白念珠菌的耐受性水平與這些途徑相關[15]。除上述的核心壓力應答途徑外,還有許多其他途徑和信號蛋白參與耐受現象的產生和維持,例如白念珠菌中的轉錄因子Cas5 在細胞壁壓力應答中發揮作用,并參與對棘白菌素的耐受[16]。參與翻譯后修飾的酶也參與壓力應答調控,其中研究較多的是調節白念珠菌對唑類敏感性的賴氨酸乙酰轉移酶(lysine acetyl-transferase,KAT)[17]。白念珠菌中Spt-Ada-Gcn5-乙酰轉移酶 (Spt-Ada-Gcn5-acetyl-transferase,SAGA) 復合物的共激活因子Ada2功能破壞可導致藥物外排泵表達上調,除了影響耐藥性之外,還部分影響白念珠菌的耐受程度[18-19]。另有研究發現在同一MIC水平不同耐受程度的白念珠菌中,高耐受菌株細胞內氟康唑含量低于低耐受菌株[6],因此某些壓力應答調控途徑可能部分影響藥物的攝取和外排,并間接地促進菌株對氟康唑的耐受。

2.2 非整倍體形成及雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)

真菌病原體基因組具有顯著的可塑性,能夠通過基因組修飾來適應環境干預?；蚪M修飾不僅可以導致耐藥,也可以使白念珠菌敏感株產生藥物耐受。研究發現白念珠菌暴露于唑類藥物中數小時后,其有絲分裂的細胞周期及紡錘體數目出現異常,產生四倍體和非整倍體細胞[20]。而非整倍體細胞可以改變白念珠菌對氟康唑的耐受性,例如3號染色體右臂形成的三倍體使白念珠菌敏感株對氟康唑存在的環境產生更高的適應性但不改變其MIC值,并觀察到該節段上編碼尿素轉運蛋白的NPR2基因拷貝增加[21]。值得注意的是,由于非整倍體同時影響多個基因,因此它可能賦予同一細胞多種表型,例如2號染色體形成的三倍體可以對羥基脲及卡泊芬凈產生交叉適應性,即預先暴露于羥基脲中的白念珠菌在卡泊芬凈中的存活率也大大提高。此外,白念珠菌中5號染色體形成的單倍體可同時對氟康唑和卡泊芬凈產生耐受[22]。最近一項研究表明,R染色體非整倍體形成是白念珠菌對唑類藥物耐受相關性最大的非整倍體。遺傳多樣性往往是在適應壓力的過程中產生的,Forche等[23]發現白念珠菌暴露于氟康唑、H2O2及高溫等環境中,其LOH率顯著升高,通常這類菌株對環境的適應性增加。

2.3 環境因素及生理代謝

白念珠菌的耐受水平除了受遺傳因素影響外,還受生長環境等物理因素的影響。pH值、溫度以及培養基成分均可影響白念珠菌對氟康唑的耐受水平。已有研究表明在pH值為中性的培養基上白念珠菌的拖尾現象較pH值低的酸性培養基更明顯[24]。最近的研究發現大部分白念珠菌在體溫(37 ℃)下生長的耐受水平高于實驗室溫度(30 ℃),并且在YPD培養基上耐受程度高于RPMI-1640培養基[25]。此外,在棘白菌素類藥物存在的情況下,增加細胞壁幾丁質成分促進細胞的存活[26],而添加鈣調磷酸酶抑制劑則降低菌株對棘白菌素類藥物的耐受性[27]。氟康唑聯合多西環素可降低白念珠菌的耐受性并具有殺菌作用,此效應依賴于多西環素結合培養基中鐵離子導致的鐵離子耗竭,并可以通過添加鐵離子逆轉。因此,鐵離子穩態與白念珠菌耐受性之間存在關聯[28]。

2.4 液泡的發生發育

在白念珠菌中,參與逆行轉運的因子VPS21、VPS15、VPS51和Rim101可能通過調控液泡轉運途徑中關鍵因子的轉錄,對其耐受程度產生影響。該研究推測液泡的發生發育與甾醇穩態相關,也證明了白念珠菌的藥物耐受性更多依賴于細胞內的生理過程[29-30]。

3 耐受與耐藥的區別與聯系

目前白念珠菌的耐藥是研究熱點,而耐受在臨床中常常被忽視。白念珠菌中耐受細胞與耐藥細胞雖然都有在藥物存在的環境中生長的能力,但前者的MIC值常在“臨床折點”之前,被定義為敏感株;而后者的MIC值則在“臨床折點”之后,被定義為耐藥株。在氟康唑誘導白念珠菌敏感株產生耐受與耐藥的實驗中發現,耐藥更容易在濃度與MIC值相近的藥物環境中被誘導,而耐受則更容易出現在超MIC值(即為MIC值5～10倍以上)的高濃度藥物環境中[25]。此外,在含氟康唑的培養基上,耐藥株較耐受株出現的時間更早,菌落更大。耐藥株在含藥培養基上的生長量與其在空白培養基上生長量相當,而耐受株在含藥培養基上的生長量少于其在空白培養基上生長量[6,31]。越來越多的研究提示耐藥和耐受的機制不同,由不可逆轉的基因突變導致的穩定性MIC值升高是耐藥的主要機制和表現,而耐受機制目前認為主要以表觀遺傳修飾和生理代謝因素為主。另外,不同菌株之間耐受水平的差異是由于菌株之間的基因多樣性;而在特定的分離株中,只有部分亞群可以在超MIC藥物濃度中緩慢生長則是由于同一菌株不同細胞之間的生理或代謝變化差異[28]。

有學者提出白念珠菌的耐受性在一定程度上可增加其耐藥突變的頻率,該觀點基于以下觀察結果：在氟康唑存在時,抑制Hsp90不僅可以消除白念珠菌的耐受性,還能使氟康唑產生殺菌效應;高耐受水平的菌株分裂頻率高于低耐受水平的菌株,因此其獲得耐藥基因突變的可能性也更高[6,32]。Levin-Reisman等[33]也證實了耐藥突變產生于病原菌的耐受亞群,耐受是耐藥的重要前提和基礎。

圖2 典型藥敏試驗中抗真菌耐藥和耐受性的行為圖示

4 小結與展望

白念珠菌的耐藥問題目前研究已十分廣泛,但其耐受性對療效的影響在臨床中常被忽略。近年來發現耐藥并不是白念珠菌抵抗藥物的唯一策略,臨床療效和低耐藥率不一致的情況可能和藥物耐受有關。本綜述系統闡述了耐受的概念與機制,并指出其與耐藥的區別與聯系。闡明耐受產生的具體機制并發現其抑制劑將成為臨床治療念珠菌感染的潛在靶標,因為其不但可以增加藥物療效,并最終可能延緩耐藥性的發展。