耳念珠菌感染治療的研究進展

侯千姍 張大志 閻瀾

(海軍軍醫大學藥學院,上海 200433)

耳念珠菌(Candidaauris)是近二十年來發現的一種新型念珠菌,因其對四大類抗真菌藥物的多重耐藥性和較高致死率而被稱為“超級真菌”,并成為第1個被世界衛生組織列為“全球公共健康威脅”的真菌。它曾在國外引起多次爆發性流行感染,在我國于2018年被首次報道[1]。本文從耳念珠菌的感染流行病學、生物學特性等方面入手,著重論述其治療藥物和耐藥機制,并對我國近5年耳念珠菌的研究情況進行總結。

1 耳念珠菌感染的流行病學概況

耳念珠菌自1996年在韓國首次出現[2]、2009年在日本首次被鑒定和報道[3]以來,截止2021年12月31日,全球除南極洲之外的六大洲,共計47個國家報道了耳念珠菌感染病例[4],其在美國、印度等國較為頻發。全球部分耳念珠菌感染情況見表1。

經跨國研究分析,多數感染者進行過開放性手術,接觸過留置體內的器械,進入過特護病房[7],接受過抗真菌藥物的治療。據調查顯示,耳念珠菌感染患者的死亡率為30%～60%[8],但多數患者均患有各類嚴重的基礎疾病,不能排除此類因素導致死亡的可能性。

2 耳念珠菌的生物學特性

2.1 外形特征

耳念珠菌為子囊菌亞門新種酵母,單個細胞直徑約5 μm。其形狀可隨溫度的變化而改變,多數在25 ℃、37 ℃時呈卵圓形,40 ℃時呈圓形[1]。耳念珠菌可為多核細胞,從而具有分化為菌絲的潛力[9]。

2.2 培養特點

耳念珠菌可生長于沙堡弱葡萄糖瓊脂培養基(SDA)[10]和酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(YPD)[10],在某些極端條件下也可生長,如50%的葡萄糖溶液或10%氯化鈉和5%葡萄糖的混合溶液[3],其耐鹽性較強。耳念珠菌在pH為2～10的條件下均可生長,所適應的酸堿性較為廣泛,最適pH為5～7[10],最適生長溫度為37～40 ℃[3]。培養過程中,耳念珠菌不產生淀粉,無尿素酶活性[3],即無法利用尿素供能。

念珠菌的重要特征之一是形態可塑性。耳念珠菌存在3種不同的細胞形態,為典型酵母態、成絲能力酵母態(filamentation-competent yeast, FC)和菌絲態。在小鼠體內培養時,耳念珠菌呈菌絲態,提取至體外后在30 ℃生長2 d,在25 ℃生長5 d,可轉化為毒性較小的酵母態[11]。

3 耳念珠菌感染的治療藥物

現今,用于真菌感染的治療藥物主要是唑類、多烯類、棘白菌素類、核苷類似物。下文對這4種藥物及其他可能的治療方法展開分析。

表1 部分耳念珠菌感染情況[5-7]

3.1 唑類藥物

唑類藥物分為咪唑類和三唑類,可抑制羊毛甾醇14-α-去甲基酶基因(ERG11基因)的表達,從而限制麥角甾醇的生物合成[12-13]。氟康唑是最為廣泛使用的三唑類抗真菌處方藥,約90%[14]耳念珠菌都對其具有耐藥性,最低抑菌濃度(MIC)超過64 μg/mL[15]。

ERG11基因突變是耳念珠菌的耐藥性產生的重要原因,常見突變位點有Y132F、K143R、F126L。這3種突變的發生具有一定的地域性,Y132F多發于委內瑞拉,K143R常見于印度和巴基斯坦,F126L則在南非較為普遍[16]。3種突變各有其不同的作用機制。Y132位于羊毛甾醇14-α-脫甲基酶的催化面,因此Y132F突變導致氟康唑和Erg11p不能正常識別與結合。原血紅素(heme)可能參與P450還原酶的作用過程,而K143在DNA上位于原血紅素基因附近,K143R突變可能影響原血紅素的催化效率。F126殘基位于配體通道蛋白附近,修飾該殘基會干擾甾醇脫甲基酶抑制劑進入胞內。當發生F126L突變,通道蛋白作用異常,甾醇脫甲基酶受到抑制,于是麥角甾醇的濃度降低[13]。對于白念珠菌,ERG11的過表達也會導致耐藥[17],在耳念珠菌中是否有此效果,仍有待研究。艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑會和甾醇脫甲基酶的其他殘基結合,不受以上3種基因突變的影響,因此可作為治療耳念珠菌的一種選擇[13]。

第二,真菌細胞膜上外排泵的過表達也是耳念珠菌對唑類產生耐藥性的原因之一。主要的外排泵有ATP結合盒基因超家族(ABC)和易化擴散載體超家族(MFS)。CDR1和CDR2的表達產物同屬于ABC,敲除CDR1基因會導致耳念珠菌耐藥性減弱4～8倍,敲除CDR2基因則影響較小[18]。轉錄因子 Tac1在耳念珠菌中以兩個串聯的副本(two tandem copies)形式出現,可以抑制CDR1和CDR2基因的高表達[19],從而增強耐藥性。

第三,Hsp90在細胞對藥物的應激反應中可以穩定關鍵的調節因子——鈣調神經磷酸酶[20],從而抑制白念珠菌和耳念珠菌從酵母態轉化為菌絲態,同時抑制麥角甾醇的合成,使耐藥性加強[21]。

此外,耳念珠菌的生物被膜可使其具有短期的耐藥性。生物被膜是附著在有機體表面的一層微生物群體,包含多種大分子,具有較強的免疫防御作用。在生物被膜形成后,4 h內咪康唑對耳念珠菌的MIC升高16倍(從1 μg/mL至16 μg/mL),12 h內升高64倍(從1 μg/mL至64 μg/mL)[22]。

3.2 多烯類藥物

據統計[14],有30%的耳念珠菌對多烯類藥物敏感度較低。多烯類藥物可以在細胞膜外形成聚合物,與磷脂雙分子層中的麥角甾醇結合,在細胞膜上形成親水通道,破壞真菌的細胞膜,導致胞質內容物外泄[14,23]。兩性霉素B為典型的多烯類藥物。

耳念珠菌對多烯類的耐藥主要存在以下幾種相關因素：

第一,在麥角甾醇生物合成通路上,多數具有耐藥性的耳念珠菌存在5個基因的過表達,分別是MVD、ERG1、ERG2、ERG6、ERG13。它們的表達產物會改變細胞膜中甾醇的組分,從而影響細胞膜的穩定性[19]。

第二,單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)是單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態性,是可遺傳變異中最常見的一種。耳念珠菌中部分SNP與兩性霉素B耐藥性有極大關聯,存在于下列5個基因座(genome loci)：utg4_968953(T/C)、utg5_821828(C/T)、utg4_160118(G/A)、utg4_352365(G/A)、utg3_385439(G/A)。其中,utg5_821828(C/T)突變使轉運因子上的絲氨酸變為天冬酰胺,utg4_968953 (T/C)突變使膜轉運蛋白上的異亮氨酸變為蘇氨酸[24],另外3種突變機制未明。

耳念珠菌的生物被膜也有抵抗兩性霉素B的作用,可使得兩性霉素B對耳念珠菌的MIC在生物被膜成熟后12 h增大1倍(從2 μg/mL至4 μg/mL),24 h后不再增加[22]。

3.3 棘白菌素類藥物

棘白菌素類是(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶抑制劑類的抗真菌藥,包括卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈等。全球范圍內,對棘白菌素類具有耐藥性的耳念珠菌約占3.8%[25],在美國發現的所有耳念珠菌均對米卡芬凈敏感[26]。因此,棘白菌素類已成為現階段針對此類疾病的一線藥物。

由于研究樣本偏少,關于耳念珠菌對棘白菌素類的耐藥機制,各方研究者說法較為統一。FKS屬于(1,3)-β-葡聚糖合成酶基因家族,對維持真菌細胞壁有重要作用。多數念珠菌對棘白菌素類的耐藥性來源于FKS的突變,其破壞酶和藥物的正常結合。據報道,有5種FKS的突變通過基因檢測被識別鑒定,分別是F635Y[27]、R1354S[27]、F635L[27]、S639F[27-28]、S639P[25],前兩者在小鼠體內引起較為顯著的耐藥性,F635L、S639F的效果中等[29]。與耐藥性相關的突變存在2段高發區域(HS1、HS2),在HS1內的S636(相當于白念珠菌的S645)處發生的突變產生的耐藥性最強[25]。

此外,研究表明卡泊芬凈也可導致外泌體(extracellular vesicle,EV)的增多。EV介導RNA在真菌細胞間的交流,比如不同株隱球菌間可發生毒性的傳遞轉移[28]。這是否會成為新型藥物研究的突破點,仍待更多探索。

3.4 核苷類似物

目前有關核苷類藥物的抗真菌作用研究較少,主要是5-氟胞嘧啶(5-flucytosine, 5-FC)應用于念珠菌和隱球菌的臨床治療。已知基因FCY2、FCY1、FUR1與5-FC的吸收和轉化過程相關,其突變可引起耳念珠菌耐藥[30]。另有研究也證實FUR1基因的突變可引發耳念珠菌對5-FC產生耐藥性,發生F211I氨基酸替換[14,31],引起苯丙氨酸變為異亮氨酸[31]。此外,敲除CgFPS1基因和CgFPS2基因會引起光滑念珠菌對5-FC的敏感度上升[30]。真菌對5-FC的耐藥性可以在用藥后迅速形成,這使得5-FC多數時候參與兩性霉素B、三唑類的聯合用藥,很少單獨施加[30]。

3.5 其他藥物

對于耳念珠菌感染的治療,許多新型藥物正處于研發當中。比如葡聚酶合成酶抑制劑Ibrexafungerp(SCY-078)[29]、糖基磷脂酰肌醇的合成抑制劑Fosmanogepix(APX001)[32]等。

4 我國近五年耳念珠菌相關的研究(2018—2022)

4.1 流行病學

2018年,北京大學人民醫院對1名患有高血壓和腎病綜合征的76歲女性進行肺泡灌洗術,在其肺泡灌洗液中檢測到耳念珠菌的存在。這是耳念珠菌首次在中國境內出現。此菌株被命名為BJCA001,它具有多種表現型,對氟康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈、CuSO4均敏感,其毒性在蠟螟和小鼠的體內弱于白念珠菌[1]。同年,沈陽報道15名耳念珠菌感染病例[33]。2018年6月,北京再次報道2名耳念珠菌感染病例,發現它們與來自沈陽的耳念珠菌高度相似[34]。此后,我國又陸續發現多起耳念珠菌的感染病例。2021年,北京將最新發現的耳念珠菌命名為BJCA002,與BJCA001進行生物學和基因組的對比研究[35]。2021年,香港報道19名耳念珠菌感染病例,并對檢測到的耳念珠菌進行基因測序,發現多處基因突變,部分突變與之前的報道吻合[33]。2022年,廈門也檢測出1名耳念珠菌感染者[36]。除2018年發現的BJCA001屬于南亞支之外,我國所有耳念珠菌均屬于南非支[36-37],他們在毒力因子、藥敏分析等方面具有顯著差異[36]。在中國,耳念珠菌多見于北方,正逐漸向南方擴散,并且約有86.11%[38]的菌株具有多種感染類型。

4.2 耳念珠菌鑒定

近5年,我國嘗試多種方式,提升鑒定耳念珠菌及其他念珠菌的準確性。在傳統的實驗室中,耳念珠菌、希木龍念珠菌(Candidahaemulonii)、擬黑馬朗念珠菌(Candidaduobushaemulonii)難以區分。Autof MS 1000和Vitek MS是兩種飛行質譜儀系統(MALDI-TOF system),它們對耳念珠菌的識別準確率高達100%。但總體而言,Autof MS 1000比Vitek MS準確率更高,尤其是在罕見微生物的識別方面[39]。MALDI-TOF MS可以鑒別耳念珠菌和克柔念珠菌,其中識別耳念珠菌的正確率達89.28%[40]。API ID 32 C系統[41]、CHROMagarCandidaPlus顯色培養基[42]、新型多重終點PCR[43]、新型多路實時定量PCR[44]均可用于鑒別耳念珠菌,且保持極高準確率。通過等位基因特異性分子信標和按照不對稱PCR的DNA曲線分析,可以完成一個雙聯ERG11實驗和一個單一FKS1HS1實驗,從而在2 h內,識別出最顯著的耐藥相關突變基因,正確率達100%[45]。

4.3 耐藥機制探究

在基因方面的研究中,我國學者發現多種因素可導致耳念珠菌的耐藥性。轉錄分析表明,相比敏感型耳念珠菌,耐藥型有453個基因活性下降,541個基因表達上調,包括麥角甾醇外排泵合成基因、Hsp相關基因等[46]?；驕y序發現多處新型突變,比如在ERG11基因上發生Y501H、I466M突變,在ERG10基因上發生R278H突變,這些突變與耳念珠菌對氟康唑、米卡芬凈、兩性霉素B的耐藥性相關[47]。在耳念珠菌的菌絲態中存在一種突變,可以導致較長的非編碼RNA的斷裂,它輔助耳念珠菌完成和抗真菌藥、H2O2等的反應,對維持耳念珠菌的毒性至關重要[48]。在部分對氟康唑具有耐藥性的耳念珠菌內,還可以檢測出一條額外的染色體V,它可導致大量耐藥相關的基因表達上調[49]。

4.4 治療方法

我國學者研究多種藥物使用方法治療耳念珠菌,發現唑類與某些藥物的結合可以使其效力增強,如同時施加氯已定和氟康唑[50]、唑類和AZD8055[51]或磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole)、伏立康唑和伊曲康唑[52]等。蒿甲醚可以擾亂外排泵Pdr5p的作用,使氟康唑在胞內累積,因此蒿甲醚與氟康唑聯合用藥對耳念珠菌具有較強的抑制作用[53]。在體外,米諾環素單獨用藥可以殺死80%的耳念珠菌,結合唑類藥物后也有良好的抑菌效果。相同試劑在體內施加,效果卻大幅度下降[54]。2020年,我國成為世界首個檢測米替福斯對耳念珠菌的作用的國家,發現米替福斯和兩性霉素B聯合用藥可以使得耳念珠菌對兩性霉素B的MIC顯著減小[55]。

此外,我國報道自組裝的蛋白磷脂體系統可以純化并表達來自耳念珠菌的重組交替氧化酶(alternative oxidase, AOX)。AOX促進真菌耐藥性的產生,但在人體中并不存在,因而成為一個理想的治療靶點[56]。光動力可以使耳念珠菌的生物膜失活,因此抗微生物光動力療法(antimicrobial photodynamic therapy)也成為可能的治療手段之一。

5 小 結

耳念珠菌是一種是多重耐藥菌株,基因突變頻發,致死率高,帶給世界全新挑戰。然而,現在用于治療耳念珠菌的藥物仍然比較局限和傳統,免疫抑制藥物、廣譜類抗真菌藥的使用可能導致耳念珠菌感染的加重,更多新型治療手段亟須研發。目前,耳念珠菌在中國的感染病例正在逐年增多,但無聚發性感染,雖不必受美國、印度等主要流行地區的恐慌所影響,但是仍需警惕,防患于未然。