一種全自動藥敏系統檢測念珠菌抗真菌藥物敏感性的應用評價

田瑞卿 王琦琦 萬喆 李若瑜 劉偉

(1.北京大學第一醫院皮膚性病科,北京大學真菌和真菌病研究中心,北京 100034;2. 保定市第一醫院檢驗科,保定 071000)

近年來,隨著腫瘤放化療、器官移植、介入操作、糖皮質激素及廣譜抗菌藥物的廣泛應用,侵襲性真菌病的發病率和死亡率逐年升高。在侵襲性真菌感染中侵襲性念珠菌病最常見,且病死率最高[1]。多項研究顯示念珠菌對抗真菌藥物的耐藥發生率呈逐年上升趨勢,念珠菌的耐藥問題受到人們越來越多的關注[2-3]。因此,對病原真菌進行體外抗真菌藥物敏感試驗也顯得尤為重要。目前,真菌藥敏試驗方法以手工法或半自動的方法為主,隨著真菌檢出率的不斷提高,臨床實驗室急需引入全自動的真菌藥敏試驗方法以提高工作效率。

本研究以CLSI M27-A4微量肉湯稀釋法為參考方法,探討一種全自動真菌藥敏分析系統對念珠菌屬體外藥物敏感性的檢測能力。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

全部受試菌株分離自臨床各類標本,保藏于北京大學真菌和真菌病研究中心,包括白念珠菌40株、近平滑念珠菌20株(含2株似平滑念珠菌)、光滑念珠菌18株、熱帶念珠菌18株、克柔念珠菌2株、葡萄牙念珠菌1株、季也蒙念珠菌1株;質控菌株為近平滑念珠菌ATCC22019和克柔念珠菌ATCC6258。所有菌株經顯色培養基傳代培養進行初步鑒定,純培養物使用布魯克質譜儀進行準確鑒定,可信度低者或顯色表型與質譜鑒定不一致的菌株采用ITS區序列分析準確定種。所有菌株從-70 ℃保藏冰箱取出后,在35 ℃下沙堡弱瓊脂斜面培養基上連續傳代2次,以保證受試菌株的純度和活力。

1.2 儀器和試劑

全自動藥敏系統,包括全自動藥敏儀、真菌藥敏盤、培養液等由復星診斷科技(上海)有限公司提供;U型96孔藥敏板購自江蘇世泰實驗器材有限公司;沙堡弱培養基購自江門市凱林貿易有限公司;RPMI-1640粉為美國Gibco公司產品;兩性霉素B購自華北制藥股份有限公司,其他抗真菌藥物購自華中海威(北京)基因科技有限公司。

1.3 微量肉湯稀釋法

肉湯培養基和梯度濃度藥敏板的制備以及菌懸液的制備和接種均按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)M27-A4進行[4]。接種后的藥敏板于35 ℃培養箱中孵育約24 h,兩性霉素B讀取生長完全(100%)抑制的最小抑菌濃度(MIC),其他藥物讀取相對于陽性對照孔50%抑制的藥物濃度。每個受試菌株進行兩次重復檢測,讀取MIC結果時由2～3人共同完成。

1.4 全自動真菌藥敏

按照復星診斷真菌藥敏試劑盒的操作說明進行操作,約24 h后儀器自動讀取MIC值并判讀結果。

1.5 質量控制

每次試驗用上述兩種方法平行測試質控菌株ATCC22019和ATCC6258,所測結果均應在規定的MIC范圍內。

1.6 數據分析

基本一致性(essential agreement,EA),試驗方法與參考方法的MIC結果相差在兩個倍比稀釋度之內的樣本比率[5];分類一致性(categorical agreement,CA),試驗方法與參考方法敏感性一致的樣本比率[6],以2020版CLSI文件M59 3rd edition和M60 2nd edition折點和流行病學界值(epidemiological cutoff value, ECV)作為CA分類的判斷標準[7-8]。極嚴重錯誤(very major error, VME)：試驗方法檢測結果為敏感,參考方法為耐藥;嚴重錯誤(major error, ME)：試驗方法檢測結果為耐藥,參考方法為敏感;一般錯誤(MiE)：試驗方法檢測結果為中介,參考方法為耐藥或敏感;或者參考方法的檢測結果為中介,試驗方法為耐藥或敏感。

2 結 果

2.1 全自動真菌藥敏與CLSI M27-A4檢測念珠菌屬對抗真菌藥物的敏感性結果

表1列出了兩種方法測定白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌對9種抗真菌藥物的MIC范圍,以及50%和90%菌株生長受抑制時的MIC值(分別表示為MIC50和MIC90)?？偟膩碚f,全自動方法測得的MIC與CLSI方法相比,相同或偏高。在檢測白念珠菌對兩性霉素B,近平滑念珠菌對阿尼芬凈,光滑念珠菌和熱帶念珠菌時對泊沙康唑時,全自動方法測定的MIC略低于微量肉湯稀釋法。

2.2 全自動真菌藥敏與CLSI M27-A4檢測念珠菌抗真菌藥物敏感性的一致性評估

如表2所示,對于40株白念珠菌而言,其中10株白念珠菌,全自動方法測得的MIC高于CLSI兩個稀釋度以上,白念珠菌的卡泊芬凈基本一致性為75%,但根據折點判斷后,分類一致性為100%。其他藥物的基本一致性和分類一致性均在85.5%以上。

表1 兩種方法測定9種抗真菌藥物對念珠菌的最小抑菌濃度(MIC)

(續表)

對于18株光滑念珠菌,其中7株卡泊芬凈的MIC為0.06～0.25 μg/mL,根據折點判讀后,分類一致性為61.1%,但基本一致性為100%。伏立康唑也存在類似問題,基本一致性為100%,根據ECV判斷后,分類一致性為66.7%。其他藥物的一致性在94%以上。

在18株熱帶念珠菌中,其中2株耐藥的熱帶念珠菌,伊曲康唑和伏立康唑兩個藥物,全自動方法測得MIC>8 μg/mL,超出CLSI 測定結果兩個梯度以上,根據折點判讀,兩種方法伏立康唑均為耐藥,而伊曲康唑根據ECV全自動方法判定為非野生型(NWT),CLSI方法判定為野生型(WT)。泊沙康唑的分類一致性為83.3%,其他藥物一致性在94%以上。

兩種方法測定100株念珠菌對9種抗真菌藥物總的基本一致性在89%以上,總的分類一致性在91%以上。

2.3 試驗方法與參考方法檢測結果誤差分析

對有臨床折點的藥物進行誤差分析發現,相對于參考方法,全自動方法測定結果未出現嚴重錯誤(ME)和極嚴重錯誤(VME),均為一般錯誤(MiE),其中氟康唑、伏立康唑和阿尼芬凈均出現了4個一般錯誤,米卡芬凈1個一般錯誤,卡泊芬凈8個一般錯誤,在檢測光滑念珠菌時,卡泊芬凈的敏感性結果有7個一般錯誤,見表3。

3 討 論

在侵襲性念珠菌病的病原菌中,已發現超過15種念珠菌可導致人類感染,白念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌是我國侵襲性念珠菌感染的主要病原菌[9]。本研究選取了上述常見的臨床分離株以及其他少數不常見念珠菌為研究對象,具有臨床指導意義。

隨著抗真菌藥物的廣泛應用,念珠菌的耐藥問題也逐漸受人關注。光滑和熱帶念珠菌對唑類藥物的耐藥性在國內外均有報道[10-12]。準確、規范的念珠菌體外藥物敏感性檢測方法對耐藥菌株的檢出和臨床抗真菌藥物的選擇具有重要的指導價值。參考方法微量肉湯稀釋法為手工操作、復雜、耗時,不宜在常規實驗室開展。目前國內獲注冊證的商品化檢測試劑品種有限,實驗室應用較多的有ATB FUNGUS 3,Sensititre YeastOne顯色藥敏板,多以手工操作為主[13-15]。本研究以微量肉湯稀釋法CLSI M27-A4為參考,評價一種全自動藥敏分析系統的應用價值,旨在將這種全自動真菌藥敏檢測技術普遍應用于臨床。

表2 兩種方法檢測念珠菌抗真菌藥物敏感性的一致性

表3 試驗方法檢測念珠菌體外藥物敏感性誤差分析(個)

使用質控菌株ATCC22019和ATCC6258進行質量控制,在質控菌株結果均在控的情況下,將兩種方法檢測的念珠菌對9種抗真菌藥物的MIC 進行比較,基本一致性在89%以上,分類一致性在91%以上,對于有臨床折點的藥物進行誤差分析顯示,全自動方法測定結果只出現了少數一般錯誤(MiE),而無嚴重錯誤(ME)和極嚴重錯誤(VME)。按照不同菌種的抗真菌藥物敏感性比較,對于白念珠菌而言,卡泊芬凈的基本一致性偏低,為75%,這些菌株見于藥敏試驗存在明顯的拖尾情況,全自動方法的MIC讀取結果高于參考方法兩個稀釋度以上,這表明該系統可能對于存在拖尾的藥敏結果判讀不準確。但根據折點判斷后,兩種方法判讀的結果均為敏感,分類一致性為100%。在18株光滑念珠菌中,兩種方法結果的基本一致性為100%,但其中7株光滑念珠菌卡泊芬凈的MIC范圍雖然為0.06～0.25 μg/mL,但根據折點判讀后,分類一致性較低,為61.1%,因為差一個藥物濃度梯度就是不同的判斷結果,導致光滑念珠菌對卡泊芬凈的敏感性結果中有7個一般錯誤。檢測光滑念珠菌對伏立康唑的敏感性時,存在類似現象,兩種方法測定的MIC基本一致性為100%,但根據ECV判定后,6株光滑念珠菌復星的檢測結果為NWT,而參考方法為WT。根據CLSI M59和M60,念珠菌屬沒有氟胞嘧啶的判斷標準,白念珠菌沒有伊曲康唑的判斷標準,但兩種方法所測定MIC均在兩個稀釋梯度之內,基本一致性均為100%。此外,克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌檢測菌株數較少,兩種方法測定的MIC 均在兩個稀釋度之內,然而克柔念珠菌的卡泊芬凈和泊沙康唑兩個藥物,根據ECV判讀后,各有1株菌敏感性結果不一致,其他藥物判讀結果均一致。

針對上述問題,認為這與本研究選取不同種念珠菌的數量較少有關,這也是本研究的不足之處,還有待于加大各種常見念珠菌的菌株數量,并且能更多地覆蓋其他少見念珠菌,從而為全自動真菌藥敏分析系統的應用提供更有力的依據。然而需要指出的是,真菌藥敏試驗采用“90-60規則”,這意味著由敏感菌株引起的感染中,90%的概率治療有效,而由耐藥菌株引起的感染60%病例也可能治療成功。因此,除了考慮兩種方法的一致性之外,應進一步結合體內療效分析,以便藥敏試驗能夠更加客觀地反映抗真菌治療的臨床療效[16-17]。

綜上所述,全自動真菌藥敏分析系統檢測念珠菌屬體外藥物的敏感性與CLSI參考方法相比,具有很好的一致性,且操作簡便,能夠自動判讀結果,有利于同時檢測多個樣本,在臨床微生物實驗室具有很好的應用價值。