響應面法優化球蘭葉片總黃酮超聲提取工藝

饒雪娥 朱宏陽 林貴燦 林偉鈴

饒雪娥，朱宏陽，林貴燦，等.響應面法優化球蘭葉片總黃酮超聲提取工藝［J］.福建農業科技，2023，54（12）：35-40.

收稿日期：2023-10-10

作者簡介：饒雪娥，女，1986年生，實驗師，主要從事天然藥物開發利用。

基金項目：福建省中青年教師教育科研項目（JAT191292）；福建衛生職業技術學院院級科研項目（2019-01-06）。

摘? 要：為了探究超聲提取球蘭葉片總黃酮的工藝條件，促進福建球蘭的開發利用。以球蘭葉片為主要原材料，通過超聲輔助提取，設計單因素試驗探究提取時間、料液比及提取溫度對球蘭葉片總黃酮提取率的影響，并在此基礎上進行響應面優化試驗。結果表明：球蘭葉片總黃酮最佳提取工藝條件為提取時間40 min、料液比1∶35、提取溫度40℃，此最佳提取工藝條件下球蘭葉片總黃酮的提取率為125.28 mg·g-1，與模型方程理論預測值126.18 mg·g-1較接近。

關鍵詞：球蘭葉片；總黃酮；響應面法；超聲提取

中圖分類號：S 682.2? ???文獻標志碼：A? ???文章編號：0253-2301（2023）12-0035-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.12.005

Optimization of the Ultrasonic Extraction Technology of Total Flavonoids fromHoya carnosa Leaves by Response Surface Methodology

RAO Xue-e， ZHU Hong-yang， LIN Gui-can， LIN Wei-ling

（Department of Pharmacy， Fujian Health College， Fuzhou， Fujian 350101， China）

Abstract： In order to explore the process conditions of ultrasonic extraction of total flavonoids from the leaves of Hoya carnosa， and promote the development and utilization of Hoya carnosa in Fujian， the leaves of Hoya carnosa were used as the main raw material. Then， the effects of extraction time， solid-liquid ratio and extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids from the leaves of Hoya carnosa were investigated by designing the single factor experiment through the ultrasonic-assisted extraction. On this basis， the response surface optimization experiment was carried out. The results showed that the optimum extraction conditions for total flavonoids from the leaves of Hoya carnosa were as follows： the extraction time of 40 min， the solid-liquid ratio of 1∶35， the extraction temperature of 40℃. Under the optimum extraction conditions， the extraction rate of total flavonoids from the leaves of Hoya carnosa was 125.28 mg·g-1， which was close to the theoretical predicted value of 126.18 mg·g-1 predicted by the model equation.

Key words： Leaves of Hoya carnosa； Total flavonoids； Response surface method； Ultrasonic extraction

球蘭Hoya carnosa（Linn.f.）R.Br.別名爬巖草、草鞋板、鐵腳板、繡球花、肺炎草等，它是一種常見的多年常綠攀援灌木，常附生于樹上或石上，莖節上生氣根，民間用作治療關節腫痛、眼目赤腫、肺炎和睪丸炎等［1］。近年來受新型冠狀肺炎疫情影響，許多患者患上各種肺熱型咳嗽癥狀，針對如急慢性支氣管炎，上呼吸道感染咳吐黃痰等癥狀，漳州市中醫院開發的以球蘭為原料提取的院內制劑——球蘭止咳糖漿，臨床實踐應用證明具有良好的治療效果?，F代醫學檢驗證明球蘭植物體中還含有多種化學成分，主要包含孕（甾）烷、孕（甾）烷糖苷脂類、固醇類（植物甾醇、α-谷甾醇）、黃酮類、倍半萜類等［2］。黃酮化合物具有抗氧化［3-4］、抗菌［5］、抗腫瘤［6-7］、抗炎［8-9］、骨保護作用［10］等多種功能，提示了球蘭可能具有的多種活性作用及其廣闊的開發應用前景。

目前，黃酮類化合物的提取方法包括溶劑萃取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法、堿提法以及傳統的浸取法等［11-12］。本研究以球蘭葉片為原料，基于超聲波輔助獲得，在巨大的振動環境、加速度較高、空化效應顯著、持續攪拌等一系列的作用之下，促使黃酮物質的溶出［13］，通過非熱作用實現強化提?。?4］，對于液體、固體系最直接的影響也是機械效應［15］，與高溫提取相比，超聲波可以在常溫狀態下加速提取，且對提取物影響小。通過對球蘭葉片總黃酮提取率的各個影響因素進行考察研究，最終確定試驗因素水平，再利用響應面法優化球蘭葉片總黃酮提取工藝，最終得到最佳的工藝提取條件，為后期進行活性成分分析及今后球蘭的開發利用提供一定的理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

試驗材料為球蘭葉片，采摘于福建閩侯一帶，經過烘干，粉碎過篩即得。

1.2? 儀器與試劑

蘆丁標準品、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉等都是分析純。752型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；ZY2002型電子天平（上海蒲春計量儀器有限公司）；KQ-400VSM型超聲波清洗器（昆山超聲波清洗機有限公司）；800A型多功能粉碎機（永康市紅太陽機電有限公司）。

1.3? 單因素試驗

1.3.1? 提取時間對球蘭葉片總黃酮提取率的影響? 保持提取溫度、料液比分別為40℃和1∶35，考察不同提取時間，即10、20、30、40、50、60 min的提取情況。

1.3.2? 溫度條件對球蘭葉片總黃酮提取率的影響? 保持提取時間、料液比分別為40 min和1∶35，考察不同提取溫度，即20、30、40、50、60℃的提取情況。

1.3.3? 料液比對球蘭葉片總黃酮提取率的影響? 保持提取時間、溫度分別為40 min和40℃，考察不同料液比，即1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45的提取情況。

1.4? 響應面優化試驗設計

按照單因素試驗結果，通過statistica 10.0軟件設計試驗方法，初步建立三因素三水平組合試驗，其因素水平組合見表1，以料液比、提取時間、提取溫度為3個影響因素，以球蘭葉片總黃酮提取率為響應值，考察球蘭葉片總黃酮提取的工藝條件。

1.5? 球蘭葉片總黃酮提取

球蘭葉片烘干粉碎過篩后，準確稱取1.00 g干粉，按一定的料液比加入95%的乙醇溶液，室溫下浸泡5 min后，于超聲波清洗器中進行40℃、40 min提取后，趁熱抽濾，除去濾渣，留取濾液作為樣品溶液。

1.6? 總黃酮含量的測定

1.6.1? 標準曲線繪制? 準確稱取球蘭葉片粉末0.0010 g，選擇特定體積分數酒精試劑，定容到0.1 L，晃勻，由此獲得0.1 mg·mL-1的蘆丁標準試劑，精密量取0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mL蘆丁標準品溶液置于10 mL量筒中，先加入5%的亞硝酸鈉試劑0.3 mL，晃勻放置6 min，之后加入10%的硝酸鋁試劑0.3 mL，晃勻放置6 min，而后加入4%的氫氧化鈉試劑4 mL，最后加入氫氧化鈉試劑直到刻度線為止，定容，搖勻靜置20 min，進行充分顯色反應。以試劑做空白參比液。置于510 nm波長節點檢測吸光度情況。橫縱坐標分別選擇蘆丁標準品濃度、吸光度，得到相應的曲線，并最終求解獲得相關函數曲線A=10.159C+0.0043，R2=0.9997，顯示有良好的線性關系［16］。

1.6.2? 球蘭葉片總黃酮提取率計算

R=A1×C×N×V12×A

公式中A1為樣品溶液的吸光度；C為標準品的濃度；N為溶液的稀釋倍數；V1為樣品的體積；A為標準品的吸光度；R為總黃酮的提取率。

2? 結果與分析

2.1? 單因素試驗結果分析

2.1.1? 提取時間對球蘭葉片總黃酮提取率的影響? 由圖1可知，超聲提取時間10～60 min球蘭葉片總黃酮的提取率總體呈上升趨勢，在40 min時有個峰值，提取率達到最大。所以，選取40 min為最優的提取時間。

2.1.2? 提取溫度對球蘭葉片總黃酮提取率的影響? 由圖2可知，當溫度到達40℃時，球蘭葉片總黃酮的提取率達到峰值，之后繼續升高溫度后發現提取率反而下降。因此，選取40℃為最優提取溫度。

2.1.3? 料液比對球蘭葉片總黃酮提取率的影響? 由圖3可知，料液比在1∶20～1∶45范圍內，隨著料液比的升高，球蘭葉片總黃酮提取率明顯升高，在到達1∶35時呈最高峰狀態，繼續增加料液比，提取率反而變小。因此，確定料液比為1∶35。

2.2? 球蘭葉片總黃酮響應面法試驗結果

2.2.1? 響應面法優化試驗結果? 在單因素試驗結果的基礎上，以球蘭葉片總黃酮提取率為響應值，

根據statistica 10.0試驗設計原理，對料液比（X1）、提取時間（X2）、提取溫度（X3）3個主要影響因素進行三因素三水平的響應面試驗設計，結果見表2。

2.2.2? 回歸方程的建立及模型分析? 采用statistica 10.0軟件對表1數據進行回歸分析，得到響應值球蘭葉片總黃酮提取率（Y）與料液比（X1）、 提取時間（X2）、 提取溫度（X3）三因素的二次多元回歸方程：Y=-10.520X1-17.410X12+8.891X2-20.150X22-1.485X3-19.719X33-7.980X1X2-4.635X1X3-11.375X2X3+124.491。再通過此軟件對試驗結果進行方差分析后得到的結果見表3。

由表3可知，該模型的顯著性較高，相關系數R2=0.9275，說明該模型的擬合程度較好，由F值不難得到多個要素和提取結果的關聯權重占比，即料液比最大，溫度最低，中間為提取的時間，各因素對總黃酮提取率的互相影響比較不顯著。

2.2.3? 提取總黃酮工藝條件的響應曲面分析? 應用statistica10.0軟件，將各因素兩兩交互作用對球蘭葉片總黃酮提取率的影響進行曲面分析，做出相應的3D響應面分析圖及等高線圖，結果見圖4。

2.3? 最佳條件試驗驗結果驗證

通過statistica10.0軟件得到球蘭葉片總黃酮最佳提取要素，即料液比、提取時間、提取溫度依次保持1∶33.19、36.83 min、39.14℃。為了試驗操作的方便性，選取料液比為1

∶35（g·mL-1）、提取時間為40 min、提取溫度為40℃，在此最佳條件基礎上進行3次平行試驗進行驗證，得到的平均總黃酮提取率為125.28 g·mL-1，與模型預測值126.18 g·mL-1較接近。說明所建立的預測模型比較可靠，響應面法可以適用于優化球蘭葉片總黃酮的提取工藝。

3? 討論與結論

關于中草藥活性成分的提取研究，尤其是黃酮類化合物提取分離研究歷史悠久，近年來隨著科研設備儀器的日益更新換代，以及新的提取技術出現，越來越多植物內含的有效成分總黃酮被人們提取出來，大大提高植物的開發利用價值。本研究在單因素試驗的基礎上，采取響應面法對球蘭葉片總黃酮提取工藝進行進一步優化。結果表明其預測模型具有相對可靠性和穩定性，三因素對球蘭葉片總黃酮提取率關聯權重占比關系中，料液比所占影響因素最大，提取時間次之，提取溫度影響因素最低。本研究結果表明影響總黃酮提取率的三因素最佳配比為料液比、提取時間、提取溫度分別為1∶35、40 min、40℃，此最佳提取工藝條件下得到的總黃酮提取率為125.28 mg·g-1。

球蘭莖葉水提物的活性成分在體外抑菌性已得到試驗驗證。然而球蘭提取物中許多其他已知和未知的活性成分功能尚待進一步研究驗證，比如黃酮類化合物和皂苷類化合物是否具有降血糖和血脂效果，目前研究甚少。對于進一步利用其化學成分開發天然藥物新藥具有重要意義。球蘭廣泛分布于福建沿海區域加之民間藥用療效確切，通過現代技術手段提取分離其有效化學成分，可以使球蘭藥用價值進一步被挖掘利用，從而開辟新的藥物來源，能更好地為人類健康事業注入新鮮血液。

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（責任編輯：林玲娜）