金雀異黃素微粒多糖載體研究進展

江瓊芳，應 浩，錢婉婷，江 林，柳張葳，李曼莉

（桂林旅游學院，廣西桂林 541006）

0 引言

金雀異黃素（Genistein，縮寫為Gen） 又名染料木黃酮，化學名為4′,5,7 - 三羥基異黃酮，是從豆科植物中提取的一種天然異黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、類雌激素、免疫調節等多種生物活性[1]。因具有苦味、水溶性差、生物利用度低等缺陷，限制了其在食品和醫藥領域中的應用[2]。為改善其生物活性，擴大其應用范圍，利用合適的載體包封和輸送金雀異黃素已成為當前研究的熱點。

現有研究顯示，脂類、蛋白質、糖類等材料均可當作載體制備微米級、納米級的Gen 微粒，從而提高Gen 的水溶性和生物利用度，進而改善其活性效應[3]。以多糖為載體的Gen 微粒因具有較高生物相容性、生物可降解性和可再生性等特點，使其成為非常具有吸引力的Gen 包封和遞送載體。常用的Gen 微粒多糖載體有殼聚糖（CS） 及其衍生物、環糊精（CDs） 及其衍生物、淀粉、葡聚糖等。依據制備Gen 微粒所用多糖載體材料的不同，對Gen 微粒多糖載體的制備方法、特點及其對Gen 生物活性的影響進行了綜述，并對Gen 微粒多糖載體的發展進行了展望。

1 殼聚糖及其衍生物載體

殼聚糖（CS） 及其衍生物是一類具有親水性、生物相容性和無毒性的天然高分子材料，被廣泛應用于Gen 等食品功能因子與藥物的輸送、組織工程和傷口愈合等方面[4]。利用殼聚糖及其衍生物為載體包封Gen 的方法主要有交聯法、離子誘導法和自組裝法等[5]，包封后可顯著提高微粒中Gen 的水溶性、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等活性，制成微粒尤其是納米化的Gen 微粒后還可使其中的Gen 在磷酸鹽緩沖液（PBS）、模擬胃腸液和動物血液等介質中呈現良好的緩、控釋性能。

吳婉瑩等人[6]制備了微球口服膠囊制劑Gen-CS。微球膠囊中Gen 在小鼠體內各臟器的濃度與普通膠囊相比降低較緩慢，可在較長時間內使Gen 維持一定的濃度。普通膠囊Gen 在小鼠體內分布以肝臟為主，微球膠囊Gen 以肺與脾臟為主，而在肝臟與腎臟的分布均減少。馮淑瑩等人[7]以CS 為載體，戊二醛為交聯劑，采用乳化分散- 化學交聯法，制備了球形規整、平均粒徑2～4 μm 的微球Gen-CS。在CS和Gen 質量比為4∶1，CS 質量分數為1%，反應介質pH 值為11 的條件下微球載藥量為10.5%，包封率達52.5%，成球后藥物結晶度降低。體外累積釋放率純Gen 在5 h 可達45%，而微球在15 h 才釋放10%。同時，微球中Gen 釋放率受載體質量分數、交聯時pH 值和釋放介質pH 值的影響。王瑩等人[5]采用離子誘導法制備了粒徑為200～300 nm，包封率為37.1%，載藥量為9.3%的球形納米粒Gen-CS。Gen 的結構和性質并沒有因為制成納米粒而發生變化。陳圓等人[8]進一步研究顯示，該納米粒的體外釋放與介質pH 值和離子濃度有關。純Gen 在介質中呈線性釋放；納米粒子在釋放介質中先快速釋藥，后緩慢釋放。Ibrahim S 等人[9]采用靜電紡絲法以3∶7（V∶V） 的CS 和聚乙烯醇制備了粒徑為60.51 nm 的納米纖維Gen-CS-PVA。納米纖維在體外（PBS） 具控釋效應，對人成纖維細胞（W138） 無毒；在體內可使脊髓受損雌性SD 大鼠脊髓組織中抗氧化酶活性增強，抗炎性細胞因子水平升高，而使促炎性細胞因子濃度下降，Gen-CS-PVA 納米纖維明顯提高了脊髓受損大鼠脊髓組織的抗氧化和抗炎癥能力[4]，為神經組織炎癥性疾病的治療提供了新的思路。Rahmani F 等人[10]以物質的量比為4∶1 的CS 和三聚磷酸鈉為原料，采用超聲攪拌的方法制備了粒徑為（788±3.45） nm，多分散指數為0.29，包封率達（76.8±14.69） %，呈球形的納米粒CHI-En/Gen。該納米粒對正常人皮膚成纖維細胞的活力無影響，卻能顯著抑制人結腸癌HT-29 細胞的生長和增殖，可使HT-29 細胞發生凋亡性死亡。雞胚絨毛尿囊膜試驗顯示該納米粒還具有抗血管生成活性。

Vanden Brabera N L 等人[11-12]以美拉德反應制備的水溶性CS 衍生物（WSCh） 為載體包埋Gen，得到粒徑約為2.62 μm，包埋率為（78±5） %的微囊化MCGe。微囊中Gen 在體外模擬胃腸液條件下呈兩相釋放模式，體外抗氧化能力顯著高于純Gen。葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎雌性小鼠連續10 d 飼喂MCGe（0.08 mg/d），可顯著減輕小鼠結腸炎的癥狀。微囊化Gen 有望成為治療氧化性炎癥疾病的新選擇。

隨著研究的不斷深入，以殼聚糖為載體的Gen微粒通過與磁性材料、特定靶向配體等的結合，可提高Gen 在靶部位的聚集，進而增強其對靶部位的活性效應。目前，對這類靶向性Gen 微粒多糖載體的研究總體還較少。張龍等人[13]以CS、Fe3O4為主要原料，采用離子誘導法在優化的條件下制備了具有磁性的Gen 靶向CS 納米粒子。微球粒徑在300～800 nm，具有良好的磁響應性和體外緩釋性。Cai L等人[14]以葉酸（FA）、CS、Gen 為原料，制備了粒徑約為165 nm 的球形納米粒FGCN（含FA） 及GCN（不含FA）。2 種納米粒體外釋放曲線相似，對Gen有良好的控釋效應。FGCN 對人宮頸癌HeLa 細胞的抑制能力和誘導凋亡能力要顯著強于GCN 和游離Gen。因葉酸與HeLa 細胞中大量存在的葉酸受體- α具有高度親和力，致使FGCN 與細胞間通過配體- 受體的特異結合，顯著提高了對HeLa 細胞的靶向性。

2 環糊精及其衍生物載體

環糊精（CDs） 是含有6 個單位α - 環糊精（α-CD）、7 個單位β- 環糊精（β-CD） 和8 個單位γ-環糊精（γ-CD） 并用α（1-4） 糖苷鍵連接的環狀寡糖。在各種CDs 中，β-CD 是更為常用的提高Gen 等食品功能因子與藥物水溶性的CDs。β-CD 分子的外部親水，內部親脂，其錐形排列有助于其在不經過任何化學修飾的情況下，通過非共價鍵的方式包封親脂分子，從而提高親脂分子的水溶性、穩定性和生物利用度[15-16]。利用環糊精及其衍生物為載體包封Gen 的方法主要有酸堿中和法、溶劑蒸發法、濕揉制法和純研磨法等。經上述方法有效包合后可顯著提高微粒中Gen 在水中的溶解度和溶出度、跨膜通透性、抗氧化和抗腫瘤等活性。

雷英杰等人[15]以β-CD 為載體，采用改良的酸堿中和法在Gen 和β-CD 物質的量比為1∶1 時制備了包封率大于90%的包合物Gen-β-CD。該研究顯示，在β-CD 和Gen 的包合過程中出現了一種新的物相，即形成了Gen-β-CD 包合物。在飽和水溶液中，Genβ-CD 中Gen 含量（30 μg/mL） 為純Gen（2 μg/mL）的15 倍，即制成包合物后顯著提高了Gen 在水中的溶解度。Zafar A 等人[16]以1∶1∶0.05（W/W） 的Gen、β-CD 和TPGS 為原料，采用溶劑蒸發法制備了含Gen 的三元包合物GTTIC2。包合后結晶Gen 轉變為非晶態。包合物顯示出增強的穩定常數和絡合效率，飽和溶解度包合物約為純Gen 的48.09 倍；體外模擬釋放率包合物為純Gen 的5.9 倍。在100 μg/mL質量濃度下，包合物的DPPH 自由基清除率為純Gen的1.17 倍。對人乳腺癌MCF-7 細胞的半數抑制濃度包合物只有純Gen 的60.15 %。即Gen 與β-CDs 和TPGS 的有效包合顯著增加了Gen 的溶解度、溶出度和體外抗氧化和抗腫瘤活性。該三元包合物的制備為提高以Gen 為代表的低可溶性藥物口服遞送效果提供了新的途徑。

Daruházi á E 等人[17]以不同的環糊精β-CD、γ-CD 及其衍生物2- 羥丙基-β-CD（HP-β-CD） 和隨機甲基-β-CD（RAMEβ-CD） 為載體，采用濕揉制的方法制備了呈固態、分子分散的Gen 環糊精及其衍生物包合物。相對純Gen，包合物顯著提高了Gen水溶性，且環糊精衍生物所形成包合物（Gen/HPβ-CD 和Gen/RAMEβ-CD） 的溶解度要高于環糊精所形成的包合物（Gen/β-CD 和Gen/γ-CD）。人結腸癌Caco-2 單層細胞通透性試驗顯示表觀滲透系數和跨膜Gen 量，包合物均顯著高于純Gen，即Gen 與環糊精及其衍生物形成包合物后顯著地改善了Gen 膜滲透作用。Fumi C 等人[18]分別以HP-β-CD 和磺丁基- β - 環糊精鈉鹽（SBE- β-CD） 為載體，采用純研磨的方法制備了環糊精包封的Gen 固態復合物Gen/HP-β-CD 和Gen/SBE- β-CD，共同研磨形成復合物后顯著增強了Gen 的溶解度。3～6 μg/mL 處理72 h，純Gen 及其共研磨環糊精復合物降低了來自黏多糖貯積癥（MPS） 2 型和3 型患者成纖維細胞糖胺聚糖合成能力，且呈劑量依賴性；對正常成纖維細胞的增殖能力和乳酸脫氫酶活性沒有顯著影響。Gen 共研磨環糊精復合物可以作為遺傳性糖胺聚糖代謝異常疾病MPS 聯合治療的一部分。這種純研磨無溶劑、清潔的綠色化學Gen 微粒制備方法具有良好的發展前景。

3 其他多糖載體

除殼聚糖及其衍生物、環糊精及其衍生物可充當Gen 微粒的多糖載體外，淀粉、凝膠多糖、葡聚糖等亦可作為Gen 的微粒載體。因多糖結構上的差異性，致使他們在和Gen 包封時所采用的方法各不相同。這些多糖載體多被用作提高Gen 在水中的溶解度，保護Gen 在模擬消化道環境中的穩定性和控制Gen 在模擬介質中的釋放速率。

Cohen R 等人[19]以土豆直鏈淀粉（A） 和含直鏈淀粉高的玉米淀粉（HACS） 為原料，采用酸化堿溶液的方法與Gen 一起制備了粒徑為微米級的淀粉復合物Gen-A 和Gen-HACS。Gen-A 中Gen 含量顯著高于Gen-HACS。體外釋放研究顯示，2 種復合體在pH 值3～8 的范圍內穩定；在pH 值6.9 的PBS 中，復合體在30 ℃和50 ℃下穩定，而在80 ℃時穩定性較低。2 種復合物在模擬胃液條件下均表現出較高的Gen 滯留量；在胰酶溶液中的Gen 釋放量分別是PBS 溶液中的4.92 倍和2.32 倍。即淀粉包封后減少了Gen 在酸性胃環境中的降解，而卻能在胰酶溶液消化后釋放Gen。該方法制備的Gen 淀粉復合物可在模擬介質中控制Gen 的釋放。Soleimanpour M 等人[20]以玉米淀粉為原料，制備了平均粒徑為105.4 nm的介孔淀粉。介孔淀粉與Gen 以1∶1（W/W） 包埋后，Gen 包封率達79.9 %，納米粒中Gen 在模擬胃腸道消化液溶出率要顯著高于游離Gen 粉末，釋放曲線呈典型的兩相釋放模式。

Lakshminarayanan R 等人[2]以凝膠多糖Curdlan 為載體，用4 種不同的方法制備了4 種微米級的Gen-Curdlan（GC） 復合物I～IV。在4 種復合物種，Gen的總量（mg/100 mg 干物質） 復合物I（2.3） 顯著高于其他復合物II（1.8）、III（1.0） 和IV（1.8）。復合物改變了純組分的結晶性質，Curdlan 和Gen 之間存在分子間相互作用。4 種GC 復合物中Gen 的釋放時間均可延長至72 h，且其中Gen 的釋放量在加入溶壁酶（Lyticase） 的模擬腸液中均高于在PBS（pH值6.9） 中的釋放量，而Curdlan 可在溶壁酶的作用下降解。即在裂解酶對Curdlan 的酶解作用下，GC復合物中Gen 的釋放增強。通過酶促降解載體而調節Gen 釋放的新型藥物緩釋系統為Gen 微粒體在食品和藥品領域的開發應用提供了一種新的策略。Semyonov D 等人[21]以蔗糖為底物，用葡聚糖蔗糖酶酶促合成了葡聚糖球形納米粒，進而包封形成葡聚糖包結的Gen 納米粒，其中Gen 含量可達5.6 g Gen/100 g納米粒。利用酶促合成Gen 微粒多糖載體的方法為利用葡聚糖的溶解性提高Gen 的溶解度和生物利用度提供了新途徑。Jangid A K 等人[22]以多糖菊粉、硬脂酸為原料，運用薄膜水化法制備了載Gen、粒徑為115 nm，包封率達92.2 %的納米粒GNP。GNP 中Gen 在模擬胃腸液中的釋放具有位點特異性（胃中少，腸中多） 和明顯的緩、控釋效應。處理人結直腸癌HCT 116 細胞48 h，GNP 的半數抑制濃度顯著低于純Gen 懸液。

4 結語

綜上所述，Gen 微粒多糖載體中研究相對較多的為殼聚糖（CS） 及其衍生物、環糊精（CDs） 及其衍生物，而對以淀粉、葡聚糖和凝膠多糖等為載體的Gen 微粒的研究則相對較少。多糖載體用于制備Gen 微粒的方法因所用多糖種類的不同而異。殼聚糖及其衍生物包封Gen 的方法主要有交聯法、離子誘導法和自組裝法等，也有用靜電紡絲和超聲攪拌等方法。環糊精及其衍生物包封Gen 的方法主要有酸堿中和法、溶劑蒸發法、濕揉制法和純研磨法等。

因淀粉、環糊精及其衍生物本身結構的特殊性，通常以他們為載體的Gen 微粒的粒徑較大，多在微米級以上，而以殼聚糖、葡聚糖、菊粉等多糖為載體制備的Gen 微粒粒徑多為納米級的。多糖載體在與Gen 形成共包封物后，微粒中Gen 通常由結晶態向非晶態轉變，增加了Gen 在水中的溶解度和溶出速率，改善了微粒中Gen 在PBS、模擬胃腸液、血液等介質中的釋放行為。同時，多糖包合物還能減輕胃刺激，增強Gen 在胃腸道內的穩定性，提高Gen 在體內的生物利用度，并掩蓋Gen 的苦味。

當前，以多糖為載體的Gen 微粒在改善Gen 性能方面的研究主要集中在多糖包合物中Gen 在體外介質（如模擬胃腸液、PBS 等） 中的溶解度、溶出度和釋放機制等，而對Gen 多糖包合物在血液和動物體內的釋放行為研究則較少。在改善Gen 生物活性效應方面的研究主要集中在體外抗腫瘤和動物體內抗炎癥方面：①抗腫瘤：多糖包合物在體外顯示出對人結腸癌HT-29 細胞、人乳腺癌MCF-7 細胞、人結直腸癌HCT 116 細胞、人宮頸癌HeLa 細胞等顯著的抑制作用，其抗腫瘤的機制主要是抑制腫瘤細胞增殖、誘使細胞凋亡和抗新生血管生成等。②抗炎：對小鼠體內結腸炎和大鼠因脊髓受損所引起的神經組織炎癥性疾病顯示出良好的治療作用，其抗炎癥的主要作用機制是促使體內抗氧化酶活性增強、抗炎性細胞因子水平升高、促炎性細胞因子水平下降等。此外，以多糖為載體的Gen 微粒還有體外抑制黏多糖貯積癥（MPS） 2 型和3 型患者成纖維細胞糖胺聚糖合成能力等生物活性效應。目前，對以多糖為載體的Gen 微粒在動物體內的藥代動力學、生物利用度、抗腫瘤及其機制等方面的研究還較少。

未來除了要加強以多糖為載體的Gen 微粒在動物體內和臨床前試驗研究外，制備納米化和具有靶向性的Gen 多糖包合物將是多糖載體包封Gen 極具前途的發展方向。納米化在縮小Gen 微粒體積的同時增加了藥物與細胞、組織的接觸面積，利于提高藥物的濃度；通過與Fe3O4等具有磁性的物質結合和加入葉酸等配體物質，可增強Gen 微粒在靶器官、靶組織的聚集，使藥物的靶向性增強，利于精準化給藥，充分發揮Gen 的生物活性。大部分Gen 微粒多糖載體具有生物可降解、無毒的性質，而且易于制備、重現性好和價格低廉，可與Gen 等疏水性物質形成包合物。因此，以多糖為載體的Gen 微粒在食品和醫藥領域極具發展前景。