超聲改性對辣木籽蛋白體外消化特性的影響

巫艷慧，唐詩琦，杜秋函，林 瑩，符 珍

（廣西大學輕工與食品工程學院 南寧 530004）

辣木（Moringa oleifera，MO）又稱芐橄欖樹、鼓槌樹、角樹，是一種具有高利用價值、實用價值和營養價值的多年生植物，原產于印度北部和北歐的部分地區，現分布在亞洲、非洲、中美洲和南美洲，分布面積廣泛[1]。果實成熟期采摘的辣木果實，即辣木籽（Moringa oleifera seeds，MOS）。MOS 營養成分極其豐富，含有大量脂肪、蛋白質、多糖、礦物質元素和膳食纖維等，被譽為“植物鉆石”[2]。研究顯示，攝入辣木籽粉可使糖尿病大鼠的腎功能參數顯著增加和改善[3]，MOS 還具有的抗關節炎特性[4]。多種研究指出辣木籽蛋白功能特性優于其它植物蛋白，辣木葉及種仁中蛋白質含量為牛奶的4 倍[5]。另外，辣木中含有多種人體必需的氨基酸，尤以賴氨酸和蘇氨酸含量最高[6]。辣木籽的市場開發主要用于榨油，而榨油后留下的辣木籽粕，粗蛋白含量達50%以上[7]。

超聲波在溶液中傳播主要是通過產生空化效應和機械效應等多重物理作用，對蛋白質構象產生較大影響且不會顯著改變氨基酸排列順序。據報道，超聲波已廣泛應用于大豆、玉米等的研究中，對其功能特性具有顯著的提高作用[8-11]。高強度的超聲處理可以通過改變蛋白的空間結構，如改變蛋白質二三級結構，來提高溶解度、吸水性等功能特性[12-13]。近年來，許多科研人員對玉米蛋白、蕓豆蛋白、瑪咖蛋白等易獲取的植物蛋白進行模擬人體胃腸消化研究，以酶解后的多肽作進一步分析，尋找具有高抗氧化能力的植物性多肽[14-16]。許多研究表明，經過脫酰胺、糖基化等化學改性和熱處理等物理改性對蛋白質結構的改變，會進一步影響酶解消化后多肽活性以及抗氧化能力[17-18]，為多種植物蛋白在創新食品和定向改性蛋白質食品中的應用提供理論依據。

本文探究經不同超聲功率改性的辣木籽水溶蛋白（MOWP），對體外消化特性和消化產物抗氧化活性的影響，尋找適合的超聲條件，以提高MOWP 消化率、水解度和抗氧化性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木籽，市售，粉碎后過80 目過篩。

胃蛋白酶（1 ∶3000，PS3）、胰蛋白酶（1：250，EC 3.4.4.4）、胰酶粉（1 ∶4000）、膽汁鹽、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、菲洛嗪、鄰苯二甲醛（OPA），索萊寶科技有限公司；過硫酸鉀、過氧化氫、氯化亞鐵、β-巰基乙醇，上海源葉生物科技有限公司；硫酸亞鐵、水楊酸、四硼酸鈉，廣西南寧楚杰生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SHZ-88 水浴恒溫震蕩器，江蘇金怡儀器科技有限公司；CR21N 高速冷凍離心機，Himac 公司；PHSJ-3F pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；722 可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木籽水溶蛋白的制備 根據Tang 等[19]的方法制備，取適量辣木籽粉末加入正己烷脫脂2 h，取辣木籽粉末晾干。脫脂辣木籽粉末中加入蒸餾水（1 ∶25 g/mL），室溫條件下進行磁力攪拌2.5 h，然后將提取液在8 000 r/min、4 ℃的條件下離心25 min，取上清液備用。重復上述提取過程，合并兩次上清液后加入0.5 mol/L HCl 調節上清液pH 值至4.5 等電點沉淀。等電點沉淀后以上述相同條件離心，取蛋白質沉淀，再透析36 h，冷凍干燥得到MOWP 粉末。此方法得到的MOWP，經HPLC 檢測，純度為（93.84±1.32）%。

1.3.2 超聲處理辣木籽水溶蛋白 采用20 mmol/L PBS 緩沖液（pH 7.2）配制1% MOWP 懸浮液，室溫條件下磁力攪拌2 h 后將燒杯置于冰水浴中。按照超聲功率0，130，260，390，520，650 W（總功率的0%，20%，40%，60%，80%，100%）超聲波細胞破，工作時間為3 s，間歇時間2 s，超聲處理總時間15 min[20]。全程保持溶液低溫。取出后透析48 h，冷凍干燥，得到超聲處理的MOWP 樣品。樣品名稱為MOWP、MOWP-20、MOWP-40、MOWP-60、MOWP-80、MOWP-100。

1.3.3 模擬體外胃腸消化 根據劉艷美等[21]的胃腸液消化方法并稍作修改。取未超聲和超聲處理后的MOWP 樣品溶于0.9% NaCl 配置成10 mg/mL 蛋白質溶液，常溫條件下磁力攪拌分散30 min，0.5 mol/L HCl 調節溶液pH 值至2.0，放置于37 ℃水浴保溫30 min 待消化。將胃蛋白酶溶于0.1 mol/L HCl 配制成為20 mg/mL 胃液，調節pH值至2.0，放置于37 ℃水浴保溫30 min 待消化。以V蛋白質溶液∶V胃液=50∶1 在37 ℃條件下水浴振蕩酶解2 h 模擬胃消化。消化結束后取10 mL 胃酶解液放置沸水浴滅酶10 min，剩余胃酶解液用于模擬胃腸連續消化。將滅酶的酶解液冷卻后以10 000 r/min 離心30 min，取上清酶解液以作備用。

將剩余胃酶解液迅速調節pH 值至7.5，以V蛋白質溶液∶V腸液=50∶1 加入37 ℃水浴保溫的腸液（腸液：5 mg/mL 胰蛋白酶+5 mg/mL 膽汁鹽+5 mg/mL 胰酶）中，37 ℃水浴振蕩酶解2 h 模擬腸消化。消化結束后腸酶解液放置沸水浴滅酶10 min，冷卻后混合酶解液以10 000 r/min 離心30 min，取上清酶解液以作備用。

1.3.4 模擬體外胃腸消化消化率的測定 取1.3.3節模擬胃腸連續消化的胃酶解液和胃-腸酶解液滅酶的上清液。采用凱氏定氮法測定上清液含氮量，以公式（1）計算樣品消化率。

1.3.5 模擬體外胃腸消化水解度的測定 根據Elena 等[22]的水解度測定方法并稍作修改。取200 μL 的未處理MOWP 和超聲處理MOWP 的酶解液加入3 mL OPA 混合試劑，搖勻避光靜置2 min，在波長340 nm 處測定吸光值，未經水解樣品吸光值為A1，水解樣品吸光值A2，水解度（H）參照公示（2）計算。

式中，d——原樣品與酶解液稀釋倍數；C——蛋白質質量濃度，g/L。

OPA 混合試劑的配制方法如下：0.1 mol/L 四硼酸鈉25.0 mL 中加入0.5 g SDS，再加入1.0 mL甲醇溶解的40 mg OPA 和100 μL 的β-巰基乙醇，定容至50 mL，搖勻即可。

1.3.6 消化產物SDS-PAGE 的測定 取1.00 mg不同處理條件的MOWP 加入400 μL 尿素和100 μL 5 倍樣品緩沖液，煮沸5 min 后10 000 r/min離心5 min。采用12%分離膠和5%濃縮膠，Marker（標準蛋白）上樣量為5 μL，樣品上樣量為10 μL，濃縮膠和分離膠電壓分別為80 V 和120 V[23]。電泳結束后取出凝膠片，考馬斯亮藍R-250 染色液染色0.5 h，脫色至條帶清晰后使用熒光成像系統對凝膠片圖像采集成像。

1.3.7 消化產物內源熒光的測定 內源熒光掃描采用熒光分光光度計測定。將MOWP 溶液（0.2 mg/mL）溶解于PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）中。激發波長為290 nm，發射波長范圍為300～500 nm[24]。

1.3.8 消化產物DPPH 自由基清除率的測定 DPPH自由基清除率根據DPPH 化合物與蛋白質中的自由基反應，在波長517 nm 處具有強烈的吸光值，其測定參數如表1所示。

按照表1所示的參數測定，其中采取0.1 mmol/L 的DPPH 無水乙醇試劑溶液進行測定?；旌蠈噭┖笤谑覝貤l件下避光反應30 min，于波長517 nm 處測定對應吸光值，DPPH 自由基清除率計算參照公式見式（3）。

表1 DPPH 自由基清除率測定參數Table 1 DPPH·determination parameters of free radical scavenging rate

1.3.9 消化產物ABTS 自由基清除率的測定 將7 mmol/L ABTS 和2.45 mmol/L 過硫酸鉀以體積比1∶1 的比例混合均勻，黑暗條件下放置16 h 得到ABTS 混合液。采用去離子水稀釋ABTS 混合液直至ABTS 混合液吸光值為0.7±0.02 以作備用。取0.5 mL 酶解液加入調節后的ABTS 混合液，混合均勻，避光靜置10 min，在波長734 nm 處測定吸光值為A3。取0.5 mL 無水乙醇加入調節后的ABTS 混合液，混合均勻，避光靜置10 min，在波長734 nm 處測定吸光值為Ac[14]。ABTS 自由基清除率計算參照式（4）。

1.3.10 消化產物羥自由基的測定 取0.5 mL 酶解液加入0.5 mL 6 mmol/L 的硫酸亞鐵和0.5 mL 0.01%水楊酸，混勻后37 ℃條件下靜置30 min，于波長510 nm 處測定吸光值為A4；去離子水代替水楊酸測定其吸光值為AX；去離子水代替酶解液測定其吸光值為AY[16]。羥自由基計算參照式（5）。

1.3.11 消化產物金屬螯合力Fe2+的測定 參考韓苗等[26]的測定方法并略作修改。取1.0 mL 酶解液加入0.05 mL 2 mmol/L 的氯化亞鐵和0.1 mL 5 mmol/L 的菲啰嗪，混合均勻后室溫靜置10 min，在波長562 nm 處測定吸光值A5；采用去離子水代替酶解液測定吸光值AZ。金屬螯合力Fe2+計算參照式（6）。

1.4 數據處理

試驗均重復測量3 次，數據以平均值±標準偏差表示。試驗繪圖與分析分別采用Origin 9.1 對數據進行繪圖，IBM SPSS Statistics 20 軟件進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 超聲功率對MOWP 消化率的影響

圖1 顯示超聲處理對提高MOWP 模擬體外胃腸消化的消化率作用。以胃酶解液和胃腸連續消化酶解液為基礎，分析發現高功率超聲（P＞60%超聲功率）可顯著（P＜0.05）提高MOWP 在胃環境的消化率，MOWP-100 的消化率可達（68.52±1.70）%，而MOWP-40 低于未處理MOWP，其消化率16.97%。胃腸連續消化的MOWP 消化率也得到相似變化趨勢，MOWP-100 的消化率最大為（91.48±0.64）%。龍佩[18]在探究超聲強度對4 類谷物蛋白（小麥蛋白、蕎麥蛋白、玉米蛋白和大米蛋白）消化率的影響時也發現400 W 左右的超聲強度對谷物蛋白消化率具有極顯著的提高作用。根據消化結果顯示低功率超聲作用并未呈現高消化率，這可能是由于多肽鏈部分化學鍵重排后使多肽內部處于較穩定空間構象，如α-螺旋含量增加。隨超聲功率增大和腸液的進一步消化，α-螺旋含量隨之降低，MOWP 分子粒徑減小，分子間趨于穩定但分子內部穩定性減弱使得MOWP 消化率顯著上升。

圖1 不同超聲功率對MOWP 的胃腸消化率的影響Fig.1 Effect of different ultrasonic power on gastrointestinal digestibility of MOWP

2.2 超聲功率對MOWP 水解度的影響

植物蛋白酶解后的水解度均為較低狀態，大豆蛋白、糙米蛋白等多種蛋白的水解度均小于20%[26-27]，為提高蛋白質水解度，采用物理、化學等改性手段提高水解度。超聲功率對MOWP 水解度的影響如圖2所示，MOWP-40 在胃消化和胃腸連續消化水解度分別為（5.52±0.12）%和（29.30±0.15）%，均高于未處理MOWP 和高功率處理的MOWP，該情況與消化率變化趨勢相反。當超聲功率達100%時，胃消化和胃腸連續消化中水解度低于未處理MOWP。

圖2 不同超聲功率對MOWP 的水解度的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on gastrointestinal digestive hydrolysis degree of MOWP

根據圖中變化趨勢分析推測MOWP 分子可能是由于低功率超聲處理導致分子內部結構不穩定，多肽鏈隨著化學鍵重排后更多的α-氨基暴露于肽鏈外部與OPA 和β-巰基乙醇相互反應，腸液中的復合酶加強α-氨基的暴露較胃消化呈顯著提高。吳瑕等[25]在研究堿性蛋白酶分解大豆分離蛋白時也得到超聲改性會提高蛋白質水解度的相似結論，高功率超聲處理會最大程度提高大豆分離蛋白水解度。Liu 等[27]和張淼[16]針對該現象分別指出酶種類對蛋白質水解度產生較大影響。

2.3 超聲功率對MOWP 消化產物亞基的影響

圖3 表示未酶解MOWP 和超聲處理后MOWP 在胃腸消化后分子質量變化。經酶解處理后，蛋白質降解成分子質量更小的蛋白。經模擬胃消化水解后的酶解液主要由4 ku 和14～17 ku 亞基肽段組成，其中14～16 ku 亞基肽段含量較大；當超聲功率小于40%時，亞基肽段分子質量主要為14 ku。經模擬胃腸連續消化水解后的酶解液主要由14～16 ku 亞基肽段組成，隨超聲強度增強，肽段分子質量變化趨勢與胃消化相同。圖3b 和圖3c 兩圖對比分析還可知胃腸連續消化較胃消化亞基含量少，表明在消化后期可消化蛋白質分子已顯著降低。

圖3 超聲功率對MOWP 的胃腸消化產物SDS-PAGE 圖譜Fig.3 SDS-PAGE pattern of gastrointestinal digestive products of MOWP by ultrasonic power

進一步分析SDS-PAGE 圖譜發現超聲功率超過20%能改變MOWP 分子結構，同時改變酶對蛋白質分子作用肽鏈長度和分子質量，由于機械力和空化氣泡產生的作用力不斷改變化學鍵，將MOWP 分子內部基團暴露，改變酶切位點，致使段肽鏈變為長肽鏈，則亞基分子質量增加。胃消化的SDS-PAGE 圖譜中還可發現經消化后酶解液含有兩條亞基條帶，可能是一條多肽鏈中含有部分二硫鍵，經β-巰基乙醇分解后產生兩條肽段，也有可能是胃消化直接產生兩條具有顯著分子質量差異的多肽片段；胃腸連續消化的SDS-PAGE 圖譜中僅有一條亞基條帶，也證實胃腸酶連續消化后肽段不含二硫鍵。

2.4 超聲功率對MOWP 消化產物內源熒光的影響

經模擬胃消化和胃腸連續消化兩階段后，內源熒光峰值波長發生偏移，如圖4所示，胃腸連續消化峰值波長大于胃消化峰值波長，并且兩處消化階段內源熒光最大峰值（λmax）均大于330 nm，以此推斷經過胃消化的MOWP 與連續消化的MOWP 產生的肽段均處于極性環境中[24]，連續消化極性作用強于胃消化的極性作用。在連續消化中，超聲預處理可改變熒光強度和峰值波長。其中經超聲作用處理的MOWP 經胃消化后消化產物內源熒光強度均降低，經胃腸連續消化后消化產物內源熒光強度均增強；超聲功率大于40%時在兩處消化中的熒光波長均發生紅移，胃消化的λmax由351 nm 紅移至353 nm，胃腸連續消化由353 nm（MOWP）紅移至356 nm（MOWP-80）處又降至355 nm。

圖4 超聲功率影響MOWP 的胃腸消化產物內源熒光圖譜Fig.4 Ultrasonic power affects the fluorescence spectra of gastrointestinal digestive products of MOWP power

峰值波長紅移原因可能分為兩種：1）經超聲處理的MOWP 會改變非共價作用力，多肽之間相連的化學鍵在聲場沖擊下不斷斷裂，不同多肽之間重寫排列又形成新的化學鍵，依照化學鍵的改變多肽間末端氨基酸排列順序也隨之改變，經過胃消化或胃腸連續消化作用后，酶切作用生成不同分子質量亞基即峰值波長發生偏移；2）經超聲處理的MOWP 分子內部不斷伸展，超聲強度增強伸展程度，酶切位點暴露程度不同導致峰值波長發生偏移。

2.5 超聲功率對MOWP 消化產物抗氧化活性的影響

2.5.1 DPPH 自由基清除率 經超聲處理的MOWP 在胃消化和兩步消化后的DPPH 自由基清除率與未處理樣品相比具有顯著性差異（P＜0.05）。如圖5所示，經胃蛋白酶酶解后超聲作用的MOWP 清除能力顯著增強，上升至（78.26±0.85）%；然而，隨著超聲功率增強，在MOWP-100 處降至（41.34±6.66）%。在胃腸消化水解后DPPH 自由基清除率相較胃消化顯著降低，MOWP-60 經酶解后雖降低至（44.23±0.98）%，但優于未處理MOWP。

圖5 超聲功率對MOWP 胃腸消化產物DPPH 自由基清除活性的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on scavenging activities of DPPH free radical in gastrointestinal digestive products of MOWP

已有研究表明超聲作用蛋白質可顯著提高改性蛋白質酶解產物抗氧化活性[25，27-28]。本文中40%～60%超聲功率條件下的超聲波機械和空化作用在最大程度延展分子內部化學鍵的同時暴露部分具有單電子和強電荷量的氨基酸，并且酶的作用位點根據超聲強度而偏移，經胃蛋白酶消化后含有該類氨基酸的多肽游離于溶液中，與DPPH 反應后暴露的單電子氨基酸與其相結合，DPPH 自由基清除率增強。隨著連續消化的進行，游離氨基酸增多，含有單電子和強電荷量氨基酸的多肽含量減少，自由基清除效果減弱。Santos 等[29]探究辣木籽水溶性凝固劑凝固血液效果中發現水提取完整辣木籽得到的凝固劑具有一定DPPH 自由基清除能力，正是由于辣木籽中含有抗氧化性多肽，胃腸消化增強其抗氧化能力所致。

2.5.2 ABTS 自由基清除率 如圖6所示，未處理MOWP 與前期超聲處理的MOWP 在胃消化和胃腸連續消化中清除ABTS 自由基能力呈現相反趨勢，經胃消化酶解后清除ABTS 自由基能力隨超聲功率呈現先減小后增大趨勢，MOWP-40 處降至最低為（6.45±0.75）%；模擬胃腸連續消化后MOWP 的清除ABTS 自由基能力顯著（P＜0.05）上升，MOWP-100 的ABTS 清除值升至（91.87±0.19）%。

圖6 超聲功率對MOWP 的胃腸消化產物ABTS 自由基清除率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on scavenging activities of ABTS free radical in gastrointestinal digestive products of MOWP

Zou 等[20]在研究中指出ABTS 試劑是一種具有顯色基團的化合物，該化合物極易與疏水基團或氨基酸結合。在先前的研究中[19]，MOWP 經不同超聲功率處理后表面疏水指數顯著降低。結合ABTS 試劑作用基團或氨基酸種類，提示在胃消化后大量小分子質量多肽暴露更多的親水基團，ABTS 自由基清除率降低。進入模擬小腸消化階段，酶解作用增強，酶解程度增加，被包埋的疏水基團或者氨基酸逐漸分解、暴露，ABTS 自由基清除率增大。

2.5.3 羥自由基清除率 當前研究表明羥自由基在生物體內具有殺死紅細胞、降解DNA、降解多糖化合物等多重惡性效應[30]。圖7所示，胃消化酶解與腸消化酶解對未處理MOWP 影響較大，在胃蛋白酶酶解后羥自由基清除能力較強為（97.15±0.93）%，繼續模擬小腸酶解降低至（63.53±0.50）%。經胃消化后，隨著超聲功率的增大，超聲波作用顯著降低（P＜0.05）MOWP 的酶解多肽對羥自由基的消除能力；而進入胃腸連續消化，MOWP的酶解多肽對羥自由基的消除能力顯著增強（P＜0.05），MOWP-80 的清除值（96.53±1.35）%。

圖7 超聲功率對MOWP 的胃腸消化產物羥自由基清除率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on scavenging activities of OH free radical in gastrointestinal digestive products of MOWP

超聲作用后，隨功率增大（20%～80%），經胃腸連續酶解后的MOWP 與羥自由基結合位點暴露程度增強，清除能力增加。超聲功率為60%時，胃消化酶解與腸消化酶解后的羥自由基清除率無顯著變化，這可能是由于與羥自由基結合的位點在胃蛋白酶酶解后已完全暴露，多數含有結合位點的多肽與羥自由基結合，清除數值無明顯變化。降低羥自由基含量對抗衰老具有積極意義，超聲作用增強了人體消化MOWP 的過程中對羥自由基清除效果。

2.5.4 Fe2+螯合力的影響 如圖8所示，該圖為前期不同超聲功率處理對MOWP 消化產物金屬鰲合力的影響。圖中胃消化后MOWP 的Fe2+鰲合能力均高于胃腸連續消化，并且不同功率的超聲作用均使酶解后多肽的鰲合力高于原蛋白。然而，進一步的研究發現模擬小腸深度酶解后Fe2+鰲合能力低于胃水解，最高值僅為（22.90±1.06）%（MOWP-80），未處理MOWP 降低至（2.54±0.58）%。

圖8 超聲功率對MOWP 的胃腸消化產物Fe2+螯合力的影響Fig.8 Effect of ultrasonic power on Fe2+ chelating force in gastrointestinal digestive products of MOWP

根據MOWP 消化率和水解度測定結果，胃蛋白酶水解后酶解液中含有少量完整蛋白質分子和大量多肽，Fe2+與蛋白質或多肽結合形成螯合物可降低自由基氧化速率并阻止Fe2+進一步催化[31-32]。含有胰蛋白酶的小腸液進一步分解蛋白質和多肽，切斷多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中側鏈羧基，解離成更多游離氨基酸，對Fe2+作用能力較小，鰲合力降低。對比蛋白質和多肽對金屬鰲合能力，陳夢霏等[33]在研究蛹蟲草抗氧化活性時做出分析，發現多肽對金屬離子螯合能力優于蛋白質，并隨濃度增加而增強。本文中正是由于經胃水解產生大量多肽加強Fe2+螯合能力，前期超聲作用增加胃蛋白酶酶切位點，解離更多具有螯合能力的多肽，進一步增強Fe2+螯合力。

3 結論

本研究表明MOWP 經模擬胃腸消化的消化產物的消化率、水解度和熒光峰值波長隨著超聲功率的增強而增加。在模擬人體消化過程中，超聲處理使MOWP 增強分子內部延展，并改變化學鍵與分子間作用方式。超聲處理的MOWP 在胃消化階段生成較多多肽，顯著增強消化產物的DPPH自由基清除力和Fe2+螯合力；模擬小腸進一步水解后生成較多游離氨基酸，則增強ABTS 自由基清除力和羥自由基清除力。